研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
菜单E - ISSN: 2320 - 3528
P - ISSN: 2347 - 2286
E - ISSN: 2320 - 3528
P - ISSN: 2347 - 2286
2肿瘤学、第一临床医学院、第一附属医院浙江中国医科大学,310006年杭州,中国
收到日期:2016年6月30日;接受日期:08年8月,2016;发表日期:2016年9月5日
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目的:探索AETC结合吉非替尼的效果和机制抑制非小细胞肺癌PC9 / R细胞株体外和体内。方法:文化人类肺腺癌细胞系PC9 / R, PC9和建立裸鼠模型。麻省理工是用来测量细胞增殖的抑制作用。异种移植的体积每个治疗组每3天测量和肿瘤的重量测量后牺牲的老鼠。利用免疫印迹检测表皮生长因子受体的表达,p-EGFR, ERK1/2, p-ERK1/2, PI3K, AKT, p-AKT, STAT3, p-STAT3蛋白质在细胞异种移植肿瘤。PCR用于检测表皮生长因子受体的表达,ERK1, ERK2, PI3K, AKT, STAT3 mRNA。单向方差分析每组是由SPSS 19.0软件。结果:AETC结合特定浓度的gefitinb体现感情比单一药物(与吉非替尼相比,P < 0.05)在PC9 PC9 / R细胞,这显示了2药物有协同效应。AETC +吉非替尼可以达到更好的抑制作用的增长PC9 / R比吉非替尼异种移植仅通过降低(P < 0.05)表皮生长因子受体的表达及其下游通路相关蛋白和mrna体内和体外。AETC仅可以抑制表皮生长因子受体及其下游通路PC9达到抗肿瘤效应和PC9 / R细胞系。 Conclusions: AETC plus Gefitinib is effective in overcoming Gefitinib resistance in PC9/R cell lines in vivo and in vitro through suppressing EGFR and its downstream pathways. AETC alone can reach anti-tumor effects in PC9 and PC9/R cell lines through inhibiting EGFR and its downstream pathways.
AETC、吉非替尼耐药,Nonsmall细胞肺癌,在体外和在活的有机体内。
非小细胞肺癌(NSCLC)已经成为世界上死亡率最高的癌症类型(1]。大多数的晚期NSCLC患者被诊断为疾病,导致预后不良,尽管化疗的使用。近年来,非小细胞肺癌的分子特征的发展,导致了小说的使用药物能够目标致癌突变。
表皮生长因子受体(EGFR)在非小细胞肺癌最重要的目标之一。表皮生长因子受体信号的抑制吉非替尼、Elotinib Icotinib是一种有效的临床治疗晚期非小细胞肺癌患者,EGFR-activated突变。然而,所有患者最终会产生获得性耐药,这些药物,与9.5 - -13.7个月的中位进展——免费的存活期(2]。
红豆杉(皮尔格)Rehd是一种常绿乔木分布在中国的东南部地区。在中医理论中,水提物的红豆杉Rehd (AETC)(尤其是它的叶子,叫小分支),味道是苦的,中立的,轻微的毒性,是属于心子午线。AETC数百年来已广泛应用中医公式和被认为是有效的治疗疾病造成的有毒因素的积累或潮湿,如癌症和肾脏疾病。结合AETC和EGFR-TKIs在中国很常见,临床疗效更佳。此外,我们先前的研究已经证实,AETC具有协同作用的效果与埃罗替尼在抗肿瘤活性,与不同的机制与紫杉醇A549细胞株(3,4]。所以我们假设AETC结合EGFR-TKIs已经衰减的影响EGFR-TKI阻力通过表皮生长因子受体及其下游信号通路。因此,通过在体外和在活的有机体内PC9实验(吉非替尼敏感)细胞株和PC9 / R(吉非替尼resisitant)细胞系,我们探索的疗效和机制AETC结合吉非替尼在克服阻力吉非替尼。
细胞培养和试剂
人类表皮生长因子受体突变体肺腺癌细胞系PC9 (EGFR外显子19 del E746-A750,吉非替尼敏感)和PC9 / R (EGFR外显子19 del E746-A750,吉非替尼耐药)。杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)媒体、胎牛血清(的边后卫)和trypsin-EDTA(乙二胺四乙酸)从Gibco BRL购买(盖瑟斯堡,医学博士,美国)。3 - (4 5-Dimethylthiazol - 2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)、青霉素、链霉素,买来西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州)。PC9和PC9 / R细胞系都在DMEM培养补充10%的边后卫和1%青霉素和链霉素在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°c。
红豆杉(皮尔格)Rehd(8克/袋)购买从浙江省中医医院的药房,由宁波泰康生物工程公司(宁波、中国。批号:100513)。吉非替尼(250毫克/片)是由英国阿斯利康有限公司(英国伦敦提供。批准文号:J20100014)。
制备AETC
准备AETC用于这项研究是基于中医处理方法(5]。干红豆杉(皮尔格)Rehd(1000克)是沉浸在一夜之间蒸馏水。这原始的解决方案在蒸馏水煮3次,总计70分钟,过滤,真空抽滤,最后集中到500毫升。集中被离心机在12000 rpm 15分钟;上层清液提取然后透过0.22μm微孔过滤灭菌和干燥粉末。AETC储存在-20°C的使用。基于我们之前的研究中,AETC稀释到0.25,0.5,1,2,4,8,16毫克/毫升在体外实验中,AETC稀释至104毫克/毫升的浓度在活的有机体内实验(5]。
细胞毒性试验
在对数期,细胞使胰蛋白酶化和收获的细胞毒性测试AETC和吉非替尼。细胞被播种在平底的96孔板5×104个细胞/毫升的浓度和培养24 h在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°C。然后,PC9细胞和PC9 / R细胞被随机分为3组(AETC组、吉非替尼组,AETC +吉非替尼组分别。AETC组,PC9和PC9为72 h / R细胞培养与不同浓度的AETC(0.25, 0.5, 1、2、4、8、16毫克/毫升)。吉非替尼组中,不同浓度的吉非替尼(PC9细胞的浓度:0.01,0.02,0.04,0.1,0.5,1、5、10μmol / l, PC9 / R细胞的浓度:1、3、6、9、12、15、18、30μmol / l)细胞,分别。AETC +吉非替尼组,相同浓度的AETC(0.25毫克/毫升)加不同浓度的吉非替尼(PC9细胞的浓度:0.01,0.02,0.04,0.1,0.5,1、5、10μmol / l, PC9 / R细胞的浓度:1、3、6、9、12、15、18、30μmol / l)是细胞。20μl MTT染色(5毫克/毫升)被添加到每个为了确定药物的效果。波长测量的ELX808微板读者(美国Winooski Bio-Tek仪器公司,VT),评估从3独立实验与吸收490海里。相对细胞增殖抑制率(IR)和组合指数(CI)被测量。IR = (1-average A490治疗组和对照组的平均A490)×100%。CI < 1意味着协同效应,CI > 1显示拮抗效果,CI < 0.5意味着高度协同效应。
异种移植肿瘤模型
80只雄性BALB / c裸小鼠年龄在4 - 8周从海西poole-Rubicam实验动物有限公司(生产许可证号码:SCXK,上海,中国,2013 - 0016)被用来建立异种移植肿瘤模型。在对数期,0.2毫升暂停PC9或PC9 / R细胞(1 - 2×106 /毫升)的右腋窝皮下注入每一个鼠标。裸小鼠轴承PC9或PC9 / R肿瘤分别随机分为4组每组小鼠(10)。(一)口服AETC组(10.4毫克/每天10 g), (b)口服吉非替尼组(0.5毫克/每天10 g), (c)合并后集团(口服AETC每天10.4毫克/ 10 g +吉非替尼每天0.5毫克/ 10 g), (d)对照组(口服NS 0.1 ml /每日10 g)。肿瘤的宽度和长度测量每3天在治疗和肿瘤体积计算width2×mm3长度/ 2。4周治疗后,所有老鼠牺牲和异种移植肿瘤被剥夺了。肿瘤和抑制率的重量被测量。异种移植肿瘤是储存在液氮和被用来做实验的免疫印迹,rt - pcr和免疫组织化学。所有的动物实验研究中进行了浙江中医药大学动物伦理委员会批准。
抗体和免疫印迹
蛋白质30μg每个从细胞中提取或异种移植肿瘤被SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Immunobilon-P, 0.45毫米;美国微孔有限公司Billerica的)。膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下TBST 1 h,其次是与主要抗体β-Acitne孵化,表皮生长因子受体,p-EGFR (Tyr1068) ERK1/2, p-ERK1/2 (Tyr202 / Tyr204), PI3K, p-AKT (Ser473),一种蛋白激酶,STAT3, p-STAT3 (Tyr705)(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)在37°C 2 h一夜之间或在4°C。膜清洗三次与TBST 10分钟和孵化HRP-conjugated二级抗体在室温下1 - 2 h。膜与TBST然后再洗3次。蛋白质是可视化使用ECL和MP4 + Chemidoc XRS蛋白质标记检测系统(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。β-Acitne用作内部加载控制。乐队的微数据规范化β-Acitne表达式。带强度进行了分析通过使用一个软件数量(Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。每个实验独立完成至少3倍。
rt - pcr
从细胞或组织中提取总RNA, RNA浓度被紫外分光光度计测量3次。根据所需的RNA,不同数量的RNA样本用于逆转录合成cDNA,反转录后,引物了。引物GAPDH,表皮生长因子受体、ERK1 ERK2, PI3K, AKT, STAT3被上海PuDi生物技术有限公司合成有限公司(上海,中国)。(GAPDH正向和反向引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT - 3′, 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′, EGFR正向和反向引物:5′-ACCACGTACCAGATGGATGTGAAC-3′, 5′-AGCCGTGATCTGTCACCACATAA-3′, ERK1正向和反向引物:5′-CTACACGCAGTTGCAGTACAT-3′, 5′-CAGVAGGATCTGGATCTCCC - 3′, ERK2正向和反向引物:5′-CAGVAGGATCTGGATCTCCC-3′, 5′-CATGTCTGAAGCGCAGTAAGATT-3′, PI3K正向和反向引物:5′-CCACGACCATCATCAGGTGAA-3′, 5′-CCTCACGGAGGCATTCTAAAGT-3′, AKT正向和反向引物:5′-AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3′, 5′-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3′, STAT3正向和反向引物:5′-ATCACGCCTTCTACAGACTGC-3′, 5′-CATCCTGGAGATTCTCTACCACT-3′)。放大的目标是通过使用电力SYBR绿色PCR与步骤1 +混合实时PCR系统(应用生物系统公司)。PCR进行40周期在10μl反应混合物在95°C(5秒),60°C(30秒)。量化计算基因表达的三角洲Ct方法。数据代表三个独立实验的平均数±标准差。每个实验独立完成至少3倍。
统计数据
所有的数据都表示为平均数±标准差。统计分析是由SPSS 19.0软件。比较两组进行统计学差异的t检验,两组之间的比较测试统计差异的方差分析(ANOVA),统计学意义是作为P < 0.05。
在体外实验
AETC结合吉非替尼PC9扩散和PC9 / R细胞系:调查AETC单独的影响,结合吉非替尼,我们检查了相对应的微分灵敏度EGFR-TKIs:中冲(敏感),PC9 / R(抗)。我们首先测试了不同剂量的抑制率和IC50值吉非替尼或AETC仅影响PC9和PC9 / R细胞系(图1和表1通过MTT测定)。72小时后,吉非替尼对细胞的影响,PC9 / R的IC50值是14.245±0.243μmol / L, PC9的IC50值是0.044±0.005μmol / L,这表明PC9 / R是吉非替尼耐药,对吉非替尼虽然PC9敏感。不同剂量的AETC可以抑制PC9 PC9 / R细胞浓度的方式和实验群体的光密度值显著降低与对照组(P < 0.05) (图1一个和1 d)。我们使用AETC浓度为0.25毫克/毫升gefitinb组合在不同浓度测试PC9的抑制率和PC9 / R细胞系。这种AETC浓度最小的细胞毒性的实验。2药物的组合表现效果比单一药物(图1 g)在PC9和PC9 / R细胞系(P < 0.05)。PC9和PC9 / R的组合指数分别为0.278和0.645,这表明AETC联合吉非替尼可以实现协同效应。因此,PC9 PC9 / R细胞系可以减毒AETC结合吉非替尼。
| 细胞系 | IC50值 | 结合指数(CI) | ||
|---|---|---|---|---|
| AETC (毫克/毫升) |
吉非替尼 (μmol / l) |
0.25毫克/毫升AETC +吉非替尼 (μ摩尔/升) |
||
| PC9 | 1.693±0.25 | 0.044±0.005 | 0.005±0.001 * | 0.278 |
| PC9 / R | 1.344±0.075 | 14.245±0.243 | 5.516±1.145 * | 0.645 |
表1:IC50值AETC、吉非替尼或AETC +吉非替尼和组合指数(CI) PC9 PC9 / R细胞系,与吉非替尼相比,P < 0.05。
图1:AETC、吉非替尼或AETC +吉非替尼PC9和PC9 / R细胞株的增殖。
答:不同浓度的抑制率AETC(0.25, 0.5, 1、2、4毫克/毫升)影响PC9细胞;B:抑制利率的不同浓度的吉非替尼(0.01,0.02,0.04,0.5,10μmol / l)影响PC9细胞;C:抑制率为0.25毫克/毫升AETC加不同浓度的吉非替尼(0.01,0.02,0.04,0.5,10μmol / l)影响PC9细胞;D:不同浓度的抑制率AETC(0.25, 0.5, 1、2、4毫克/毫升)影响PC9 / R细胞;艾凡:不同浓度的抑制率吉非替尼(3、6、9、15、30μmol / l)影响PC9 / R细胞;F:抑制利率的不同浓度为0.25毫克/毫升AETC +吉非替尼(3、6、9、15、30μmol / l)影响PC9 / R细胞;旅客:IC50值AETC(毫克/毫升),吉非替尼(μmol / l)和0.25毫克/毫升AETC + Gefitnib PC9(μmol / l), PC9 / R细胞系。
结合对蛋白质含量的影响表皮生长因子受体信号通路在PC9 PC9 / R细胞系
确定的影响AETC结合PC9吉非替尼和PC9 / R细胞系在体外,我们测试了蛋白质的表达表皮生长因子受体及其下游信号通路包括ERK信号通路,PI3K / AKT信号通路和免疫印迹分析STAT3信号通路。所示图2和图3PC9细胞系,联合治疗组可以显著减少的表达p-EGFR, p-AKT, p-STAT3与吉非替尼相比(P < 0.05)。这些结果表明,AETC结合吉非替尼可以抑制PI3K / AKT和STAT3通路的激活。与对照组相比,AETC可以减少表皮生长因子受体的表达,p-EGFR, p-ERK1/2, PI3K, AKT, p-AKT, STAT3 p-STAT3 (P < 0.05),这表明AETC可以抑制表皮生长因子受体的表达及其下游分子PC9细胞。
图2:AETC、吉非替尼或AETC +吉非替尼表达EGFR和下游信号通路相关蛋白PC9和PC9 / R细胞。AETC组处理0.25毫克/毫升AETC 72小时;吉非替尼组治疗3μmol / L吉非替尼在PC9 / R细胞72小时,0.02 umol / L吉非替尼在PC9细胞为72小时;合并后的集团处理0.25毫克/毫升AETC + 3μmol / L吉非替尼在PC9 / R细胞72小时,0.25毫克/毫升AETC + 0.02μmol / L吉非替尼在PC9细胞为72小时;对照组治疗与细胞培养基。
图3:灰色的强度比AETC、吉非替尼或AETC +吉非替尼影响表达EGFR和下游信号通路相关蛋白PC9 PC9 / R细胞与吉非替尼组相比,* P < 0.05;与对照组相比,△P < 0.05。
PC9 / R细胞系,与吉非替尼相比,AETC吉非替尼可以显著减少p-EGFR的表达相结合,p-ERK1/2, PI3K p-AKT p-STAT3 (P < 0.05),表明两种药物的组合可能抑制耐吉非替尼PC9 / R细胞株的抑制ERK的活化,PI3K / AKT和STAT3信号通路。与对照组相比,AETC可以减少p-EGFR的表达,p-ERK1/2, PI3K, AKT, p-AKT, STAT3 p-STAT3 (P < 0.05),这表明AETC可以抑制表皮生长因子受体的表达及其下游分子PC9 / R细胞。
结合影响mRNA水平的表皮生长因子受体信号通路在PC9和PC9 / R细胞系
探讨影响AETC联合吉非替尼可以实现基因的水平,我们测试了表皮生长因子受体的表达水平和下游信号通路相关mRNA PC9和PC9 / R细胞系。作为图4一显示,与吉非替尼相比,AETC结合吉非替尼可以显著减少表皮生长因子受体的表达,ERK1, ERK2, AKT mRNA在PC9细胞系(P < 0.05),而没有发现显著变化PI3K和STAT3 mRNA的表达。
图4:AETC、吉非替尼或AETC +吉非替尼表达EGFR和下游信号通路相关mrna PC9和PC9 / R细胞。
AETC组处理0.25毫克/毫升AETC 72小时;吉非替尼组治疗3μmol / L吉非替尼在PC9 / R细胞72小时,0.02μmol / L吉非替尼在PC9细胞为72小时;合并后的集团处理0.25毫克/毫升AETC + 3μmol / L吉非替尼在PC9 / R细胞72小时,0.25毫克/毫升AETC + 0.02μmol / L吉非替尼在PC9细胞为72小时;对照组治疗与细胞培养基。与吉非替尼组相比,* P < 0.05;与对照组相比,△P < 0.05。
PC9 / R细胞系,表皮生长因子受体的表达水平,ERK1, ERK2, PI3K, STAT3 mRNA结合组显著减少(P < 0.05)相比,吉非替尼组(图4 b)。
AETC集团可以减少表皮生长因子受体的表达水平,ERK1, ERK2, PI3K, AKT, STAT3 mRNA PC9和PC9 / R与对照组相比细胞系。
在活的有机体内实验
AETC可以抑制PC9的生长和PC9 / R在裸鼠异种移植:基于在体外实验,AETC的抗肿瘤效应在活的有机体内进一步探索。接种后每天裸体小鼠接受治疗。异种移植都是明显的接种后5天,肿瘤形成率是100%。图5一个和表2显示的增长和重量PC9异种移植,因为PC9吉非替尼敏感细胞株,异种移植于裸小鼠接受吉非替尼、吉非替尼+ AETC治疗10天后消失。与对照组相比,异种移植于裸小鼠接受AETC治疗越来越慢,和异种移植的重量AETC组(0.921±0.405 g)明显轻于对照组(1.398±0.417 g) (P < 0.05)。所示图5 b和表2AETC +吉非替尼可以达到更好的抑制作用PC9 / R诱导异种移植的生长比吉非替尼(P < 0.05), AETC +吉非替尼、吉非替尼组的抑制率为71.9%和63.1%,分别。此外,与对照组相比,AETC组的抑制率为56.9%,这意味着仅AETC可以显著抑制肿瘤的生长(P < 0.05)。
| 集团 | n | PC9 | PC9 / R | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 异种移植的重量(克) | 抑制率(%) | 异种移植的重量(克) | 抑制率(%) | ||
| AETC | 8 | 0.921±0.405△ | 34.1 | 0.604±0.239△ | 56.5 |
| Gefitinb | 8 | 0.000±0.000△ | One hundred. | 0.513±0.259△ | 63.1 |
| AETC +吉非替尼 | 8 | 0.000±0.000△ | One hundred. | 0.391±0.095 *△ | 71.9 |
| 控制 | 8 | 1.398±0.417 | 0 | 1.390±0.720 | 0 |
表2:不同治疗方法对PC9的生长的影响和PC9 / R异种移植与吉非替尼组相比,* P < 0.05;与对照组相比,△P < 0.05。
图5:不同治疗方法对PC9的生长的影响和PC9 / R异种移植AETC组处理10.4毫克/ 10 g AETC日报;吉非替尼组处理0.5毫克/每天10 g吉非替尼;结合组治疗10.4毫克/ 10 g AETC日常+ 0.5毫克/ 10 g吉非替尼每日);对照组治疗0.1 ml /每天10 g NS。
AETC对表皮生长因子受体的表达水平的影响和下游信号通路相关蛋白在PC9和PC9 / R异种移植
图6和图7体现在PC9诱导肿瘤,AETC可以显著减少表皮生长因子受体的蛋白表达水平,p-EGFR, p-ERK1/2, PI3K p-AKT p-STAT3 (P < 0.05),这表明AETC达到抗肿瘤效果PC9诱导肿瘤抑制表皮生长因子受体及其下游ERK PI3K / AKT, STAT3信号通路。
图6:AETC、吉非替尼或AETC +吉非替尼表达EGFR和下游信号通路相关蛋白在PC9和PC9 / R异种移植。
图7:AETC、吉非替尼或AETC +吉非替尼表达EGFR和下游信号通路相关蛋白在PC9和PC9 / R异种移植。与吉非替尼组相比,* P < 0.05;与对照组相比,△P < 0.05。
在PC9 / R诱导肿瘤,与吉非替尼组相比,AETC结合吉非替尼可以显著减少表皮生长因子受体的表达水平,p-EGFR, ERK1/2, p-ERK1/2, PI3K, AKT, p-AKT p-STAT3 (P < 0.05)。与对照组相比,AETC仅能减少表皮生长因子受体的表达水平,p-EGFR, p-ERK, PI3K, p-AKT, STAT3 p-STAT3 (P < 0.05)。这一结果表明,抑制耐吉非替尼的机制组合组获PC9 / R诱导肿瘤的抑制ERK密切相关,PI3K / AKT, STAT3信号通路。AETC达到抗肿瘤效果PC9诱导肿瘤抑制表皮生长因子受体及其下游ERK PI3K / AKT, STAT3信号通路。
AETC对表皮生长因子受体的表达水平的影响和下游信号通路相关mRNA PC9和PC9 / R异种移植
PC9诱导肿瘤,AETC组达到降低表皮生长因子受体的表达水平显著影响,ERK1, ERK2, PI3K, AKT mRNA (P < 0.05) (图8)。
图8:AETC、吉非替尼或AETC +吉非替尼表达EGFR和下游信号通路相关的mrna在PC9和PC9 / R异种移植与吉非替尼组相比,* P < 0.05;与对照组相比,△P < 0.05。
进一步研究AETC + gefitinb机制抑制gefininb阻力PC9 / R异种移植在mRNA水平。我们测试了表皮生长因子受体的信使rna表达水平,ERK, PI3K, AKT, STAT3在PC9 / R异种移植。PI3K在PC9 / R诱导肿瘤,AKT, STAT3信使rna与吉非替尼组相比显著降低(P < 0.05),而表皮生长因子受体,兵不显示显著差异(图8 b)。AETC仅能抑制表皮生长因子受体的表达水平,ERK2, PI3K, AKT mRNA在PC9 / R诱导肿瘤(P < 0.05)。
最近,有针对性的抗癌药物,包括EGFR-TKIs,已经被批准用于治疗非小细胞肺癌。然而,并不是所有的病人受益于这种疗法由于原发性或获得性耐药。吉非替尼或Erlotinib-resistant Fatinib改善病人。虽然Afatinib有望克服EGFRT790M-mediated获得第一代可逆EGFR TKIs,阻力和筛选抑制剂crizotinib用于改变在针对有eml4 - ALK基因(2,6- - - - - -8]。但这两种药物没能证明吉非替尼或Erlotinib-resistant患者总生存期提高。因此,非小细胞肺癌的治疗方案仍不满意。
EGFR-TKI获得耐药性的机制可分为以下几点。(1)二级EGFR突变:T790M是最常见的二级表皮生长因子受体的突变,它占大约50%吉非替尼和埃罗替尼获得抗病性在诊所9]。T790M增加ATP亲和的表皮生长因子受体,抑制的亲和力EGFR-TKI表皮生长因子受体(10]。(2)激活HGF /满足途径:HGF的过度表达,放大,遇到突变,遇到超表达因素激活HGF /满足途径(11,12]。研究表明大约20%患者EGFR-TKI获得抗病性得到HGF /遇到通路激活(13]。激活HGF /满足途径导致下游通路的激活等PI3K / AKT通路,从而促进肿瘤发生[12,14]。(3)IGF-1R通路的激活。(4)HER2基因突变(15]。(5)HER3激活(16,17]。(6)SCLC表型转化。(7)EMT。前两个机制在诊所EGFR-TKI阻力占70%以上。
目前,几个从草药提取物显示其影响在克服EGFR-TKIs阻力通过抑制表皮生长因子受体及其下游通路。提取淫羊藿koreanum Nakai结合吉非替尼显示协同抑制作用在H1975 mTOR / PI3K / Akt通路和PC9 / GR细胞系(18]。香港发现木樨草素具有显著的抗肿瘤活性elotinib-resistant EGFR T790M突变在非小细胞肺癌细胞和动物水平通过阻断mTOR / PI3K / AKT信号(19]。
我们先前的研究显示AETC抗肿瘤效果在活的有机体内和在体外和AETC机制与紫杉醇的抗肿瘤效果不同。在A549细胞株,AETC块通过诱导A549细胞早期通过诱导细胞凋亡而紫杉醇阻止细胞坏死和凋亡晚期(3]。与此同时,AETC可以抑制表皮生长因子受体下游信号通路的激活- MAPK / ERK通路在A549细胞株A549异种移植(5]。在我们目前的研究中,MTT结果表明AETC和吉非替尼协同效应PC9 / R细胞系动物实验显示AETC +吉非替尼可以显著抑制PC9 / R诱导肿瘤的生长。这些结果表明AETC结合吉非替尼可以达到在PC9 / R细胞株的抑制作用比单独吉非替尼在体外和在活的有机体内。此外,与对照组相比,AETC仅能达到抗肿瘤作用PC9和PC9 / R细胞系在活的有机体内和在体外。根据以上结果,我们进一步探索AETC +吉非替尼的机制抑制耐吉非替尼通过检测表皮生长因子受体及其下游通路。
表皮生长因子受体及其下游细胞外signal-regulated激酶1/2 (ERK1/2) phosphatidy linositol 3-kinase PI3K / AKT信号传感器和催化剂transcription3 (STAT3)通路参与了生存、增殖和/或肿瘤的进展与表皮生长因子受体的激活,FGFR或其他生长因子受体M [20.- - - - - -22]。
等一些生长因子受体PI3K激活表皮生长因子受体,c-MET, c - kit, IGF-IR膜。随后激活PI3K催化PIP2成PIP3 [23]。后来,AKT激活通过磷酸化氨基酸Thr308和Ser47322]。AKT激活不仅起着重要的作用在抗凋亡信号传导和细胞葡萄糖代谢,但也可以很好地预测非小细胞肺癌窝藏EGFR突变(21,24]。连续的PI3K / AKT激活与吉非替尼耐药非小细胞肺癌(密切关联25]。因此,PI3K和AKT抑制剂结合EGFR-TKIs被认为是一个光明的未来在克服EGFRTKIs电阻(26,27]。我们的研究体现AETC结合吉非替尼可以显著下调PI3K的表达水平,phospho-AKT蛋白质和PI3K mRNA相比,吉非替尼在体外和在活的有机体内。根据这个,AETC结合吉非替尼可能抑制PI3K / AKT通路。
ERK1/2被激活的促有丝分裂的代理和扮演重要的角色在细胞操作如扩散、转换和生存。的放大ERK2诱发epithelial-to-mesenchymal转换和被确定为一种机制导致EGFR-TKI阻力在非小细胞肺癌(28]。研究显示ERK的活化诱发耐吉非替尼、双重抑制ERK和表皮生长因子受体可能是一个战略克服耐吉非替尼(29日,30.]。此外,有许多交叉ERK和PI3K / AKT通路之间的会谈,ERK1/2可以维持一种蛋白激酶磷酸化当PI3K / AKT通路受阻(23,31日]。Chetram等人研究发现,ERK1/2信号通路的激活(NSCLC)的高表达ERK1/2及其磷酸化显著增加。抑制ERK1/2磷酸化可以抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡和抑制肺癌中发挥作用。在我们的研究中,除了阻塞PI3K / AKT通路,AETC结合吉非替尼可以显著抑制phospho-ERK1/2和ERK2 mRNA的表达水平在细胞和动物水平与吉非替尼组相比,这意味着AETC可以抑制ERK1/2信号通路。
STAT3统计家族中的一员,STAT3时形成二聚体等各种细胞因子激活表皮生长因子,il - 6和干扰素32,33]。STAT3在肿瘤发生中占有重要的地位,它放松细胞生长和调节细胞凋亡、肿瘤血管生成和转移(32]。研究表明,激活EGFR / STAT3促进NSCLC生存,吉非替尼的功效可以通过STAT3激活受损,和抑制STAT3的活动可以使敏感Gefitinib-resistant非小细胞肺癌(34- - - - - -37]。此外,激活STAT3与一种蛋白激酶,吴发现吉非替尼耐药非小细胞肺癌的结果STAT3 AKT介导的激活(34]。的确,JAK / STAT3的强度和持续时间提升免疫抑制微环境的创建和废除抗肿瘤反应,涉及失活的树突细胞,T细胞和自然杀伤(NK)细胞。此外,激活JAK / STAT3可以转录调节炎症细胞因子的表达(14]。此外,STAT3激活调节血管内皮生长因子的表达,最后发展为浸润和转移15]。我们的研究表明,合并后的集团可以显著抑制STAT3和p-STAT3 mRNA的表达与吉非替尼组相比,这意味着AETC可以抑制STAT3通路。
上述结果与讨论建议AETC +吉非替尼可以抑制耐吉非替尼、AETC目标的影响对PC9 / R细胞异种移植是表皮生长因子受体及其下游通路。PC9 AETC仅能达到抗肿瘤效应和PC9 / R细胞系通过抑制表皮生长因子受体及其下游通路。基于上述结果,我们认为AETC是一种有效的抗癌剂,可以在全世界使用。
周教授Caicun(上海同济大学附属肺科医院、中国)提供PC9和PCR细胞。每个老师浙江中医药大学医院中心实验室给我们指导帮助。
