研究与评论:微生物学与雷竞技苹果下载生物技术杂志
菜单E- issn: 2320 - 3528
P- issn: 2347 - 2286
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2浙江中医药大学第一临床医学院、第一附属医院肿瘤科，杭州310006
收到日期:2016年6月30日;接受日期:2016年8月8日;发表日期:2016年9月5日
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目的:探讨AETC联合吉非替尼对非小细胞肺癌PC9/R细胞系的体内外抑制作用及机制。方法:培养人肺腺癌细胞PC9/R、PC9并建立裸鼠模型。MTT法检测细胞增殖抑制作用。每3天测量各组异种移植瘤体积，并在小鼠死亡后测量肿瘤重量。Western-blot检测细胞及移植瘤中EGFR、p-EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2、PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT3蛋白的表达。采用PCR法检测EGFR、ERK1、ERK2、PI3K、AKT、STAT3 mRNA的表达。采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析。结果:AETC联合一定浓度吉非替尼对PC9和PC9/R细胞的影响优于单药(与吉非替尼比较，P<0.05)，说明两药具有协同作用。AETC联合吉非替尼通过降低体内外EGFR及其下游通路相关蛋白和mrna的表达，对PC9/R诱导的异种移植的生长具有较好的抑制作用(P<0.05)。单独使用AETC可抑制EGFR及其下游通路，在PC9和PC9/R细胞系中达到抗肿瘤作用。 Conclusions: AETC plus Gefitinib is effective in overcoming Gefitinib resistance in PC9/R cell lines in vivo and in vitro through suppressing EGFR and its downstream pathways. AETC alone can reach anti-tumor effects in PC9 and PC9/R cell lines through inhibiting EGFR and its downstream pathways.
AETC，吉非替尼，耐药，非小细胞肺癌，在体外而且在活的有机体内．
非小细胞肺癌(NSCLC)已成为全球死亡率最高的癌症类型[1］．大多数NSCLC患者被诊断为疾病晚期，尽管使用了化疗，但预后较差。近年来，非小细胞肺癌分子特征研究的进展导致了新型药物的使用，这些药物能够靶向致癌突变。
表皮生长因子受体(EGFR)是NSCLC最重要的靶点之一。吉非替尼、埃洛替尼、伊可替尼抑制EGFR信号通路是晚期NSCLC和EGFR激活突变患者的有效临床治疗方法。然而，所有患者最终都会对这些药物产生获得性耐药，中位无进展生存期为9.5-13.7个月[2］．
红豆杉(Pilger) Rehd是一种常绿乔木，分布在中国东南部地区。在中医理论中，水提取物红豆杉黄芪(AETC)(尤以其叶、树皮及小枝为主)味苦，中性，微毒，属心经。AETC在中医配方中已被广泛使用了数百年，被认为对治疗由有毒因素或湿气积聚引起的疾病有效，如癌症和肾脏疾病。AETC联合EGFR-TKIs在中国较为常见，临床疗效优越。此外，我们前期的研究已经证实AETC与厄洛替尼在抗肿瘤活性方面具有协同作用，但在A549细胞系中其机制与紫杉醇不同[3.，4］．因此我们推测AETC联合EGFR- tkis可通过EGFR及其下游信号通路降低EGFR- tki耐药。因此,通过在体外而且在活的有机体内以PC9(吉非替尼敏感)细胞株和PC9/R(吉非替尼耐药)细胞株为实验对象，探讨AETC联合吉非替尼克服吉非替尼耐药的疗效和机制。
细胞培养和试剂
EGFR突变人肺腺癌细胞系PC9 (EGFR外显子19 del E746-A750，吉非替尼敏感)和PC9/R (EGFR外显子19 del E746-A750，吉非替尼耐药)。Dulbecco的改良鹰培养基(DMEM)培养基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶- edta(乙二胺四乙酸)购自Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA)。3-(4,5-二甲基噻唑-2 -基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)、青霉素和链霉素购自西格玛化学公司(圣路易斯，密苏里州)。PC9和PC9/R细胞系均在添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中，5% CO的潮湿气氛中培养2在37°c。
红豆杉(Pilger) Rehd(8克/袋)购自浙江省中医院药房，由宁波泰康生物工程公司(中国宁波)生产。批号:100513)。吉非替尼(250 mg/片)由阿斯利康英国有限公司(伦敦，英国)提供。批准文号:J20100014)
AETC的制备
本研究采用中药炮制法制备AETC [5］．干红豆杉(Pilger) Rehd(1000克)浸泡在蒸馏水中过夜。将原液在蒸馏水中煮沸3次，共70min，用真空吸滤机过滤，浓缩至500ml，再以12000转/分的速度离心15min;上清液经0.22 μm微孔滤液过滤灭菌，干燥成粉。AETC保存在-20°C下使用。根据我们之前的研究，AETC稀释至0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/ml为在体外实验中，AETC稀释至104 mg/ml浓度进行在活的有机体内实验(5］．
细胞毒性试验
在对数期，对细胞进行胰蛋白酶化和收获，以测试AETC和吉非替尼的细胞毒性。将细胞接种于浓度为5 × 104 Cells /ml的96孔平板板中，在5% CO的湿润气氛中培养24 h2在37°C。PC9细胞和PC9/R细胞随机分为3组(AETC组、吉非替尼组、AETC加吉非替尼组)。AETC组PC9和PC9/R细胞分别用不同浓度的AETC(0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/ml)培养72 h以上。在吉非替尼组，分别给予不同浓度的吉非替尼(PC9细胞浓度为0.01、0.02、0.04、0.1、0.5、1、5、10 μmol/l, PC9/R细胞浓度为1、3、6、9、12、15、18、30 μmol/l)。AETC +吉非替尼组给予相同浓度的AETC (0.25 mg/ml) +不同浓度的吉非替尼(PC9细胞浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.1、0.5、1、5、10 μmol/l, PC9/R细胞浓度分别为1、3、6、9、12、15、18、30 μmol/l)。在每孔中加入20 μl MTT染料(5 mg/ml)测定药效。波长由ELX808 Micro Plate Reader (Bio-Tek Instruments Inc.， Winooski, VT, USA)测量，并从3个490 nm吸收的独立实验中评估。测定细胞增殖抑制率(IR)和组合指数(CI)。IR=(1-治疗组平均A490 /对照组平均A490) × 100%。CI<1为协同作用，CI>1为拮抗作用，CI<0.5为协同作用强。
异种移植瘤模型
选用海西泊-鲁比康实验动物有限公司(生产许可证号:SCXK，上海，中国，2013-0016)4-8周龄BALB/c雄性裸鼠80只，建立异种移植瘤模型。在对数期，每只小鼠右腋窝皮下注射0.2 ml PC9或PC9/R细胞悬液(1-2 × 106/ml)。将携带PC9或PC9/R肿瘤的裸鼠随机分为4组(每组10只)。(a)口服AETC组(10.4 mg/10 g/ d)， (b)口服吉非替尼组(0.5 mg/10 g/ d)， (c)联合组(口服AETC 10.4 mg/10 g/ d +吉非替尼0.5 mg/10 g/ d)， (d)对照组(口服NS 0.1 ml/10 g/ d)。治疗期间每3天测量肿瘤宽度和长度，计算肿瘤体积为宽度2 ×长度/2，单位为mm3。治疗4周后，处死所有小鼠，摘除异种移植瘤。测量肿瘤权重和抑制率。将移植瘤标本保存于液氮中，进行western blotting、RT-PCR和免疫组化实验。本研究所有动物实验均在浙江中医药大学进行，并经动物伦理委员会批准。
抗体和免疫印迹法
通过sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞或异种移植瘤中提取的蛋白30 μg，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(immunoblion -p, 0.45 mm;Millipore公司，比勒丽卡，MA，美国)。用5%脱脂牛奶在TBST中在室温下阻断膜1小时，然后用β-Acitne、EGFR、p-EGFR (Tyr1068)、ERK1/2、p-ERK1/2 (Tyr202/Tyr204)、PI3K、p-AKT (Ser473)、AKT、STAT3、p-STAT3 (Tyr705) (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA, USA)的一抗在37℃下孵育2小时或4℃过夜。膜用TBST洗涤3次，每次洗涤10 min，并用酶标二抗在室温下孵育1-2 h。然后用TBST重新冲洗三次。使用ECL和MP4+Chemidoc XRS蛋白质标记检测系统(Bio-Rad Laboratories, Inc.， Hercules, CA, USA)对蛋白质进行可视化。β-Acitne作为内负荷对照。以β-Acitne表达归一化条带密度读数。使用Quantity One软件(Bio-Rad Laboratories, Inc.， Hercules, CA, USA)分析条带强度。每个实验至少独立进行3次。
rt - pcr
从细胞或组织中提取总RNA后，用紫外分光光度计测定RNA浓度3次。根据所需的RNA量，用不同体积的RNA样本进行反转录，合成cDNA，反转录后加入引物。GAPDH、EGFR、ERK1、ERK2、PI3K、AKT、STAT3引物由上海普迪生物科技有限公司(中国上海)合成。(GAPDH正向和反向引物:5 ' - ggagcgagatccctccaaaat -3 '和5 ' - ggcagatggatgtgaac -3 '和5 ' - agccgtgatctgtcaccacataa -3 '， ERK1正向和反向引物:5 ' - ctacacgcagttgcagtacat -3 '和5 ' - cagvaggatctggatctccc -3 '， ERK2正向和反向引物:5 ' - cagvaggatctggatctccc -3 '和5 ' - catgtctgaagcgcagtaagatt -3 '， PI3K正向和反向引物:5 ' - ccccgaccatcatcaggtgaa -3 '和5 ' - ccccacggaggcattctaaagt -3 '，AKT正向和反向引物:5 ' -AGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3 '和5 ' -GCCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3 '， STAT3正向和反向引物:5 ' - atccgccttctacagactgc -3 '和5 ' -CATCCTGGAGATTCTCTACCACT-3 ')。目标扩增采用Power SYBR绿色PCR混合Step One Plus Real-time PCR系统(Applied Biosystems)。在95℃(5秒)、60℃(30秒)、10 μl反应混合液中进行PCR，循环40次。用delta Ct法定量计算基因表达量。数据为三个独立实验的平均值±标准差。每个实验至少独立进行3次。
统计数据
所有数据均以均数±标准差表示。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为有统计学意义。
在体外实验
AETC联合吉非替尼对PC9和PC9/R细胞系增殖的影响：为了研究AETC单独和联合吉非替尼的效果，我们检查了对EGFR-TKIs的不同对应敏感性:PC-9(敏感)，PC9/R(耐药)。我们首先测试了不同剂量的吉非替尼或AETC单独对PC9和PC9/R细胞系的抑制率和IC50值(图1而且表1) MTT法。吉非替尼作用72 h后，PC9/R的IC50值为14.245±0.243 μmol/L, PC9的IC50值为0.044±0.005 μmol/L，说明PC9/R对吉非替尼耐药，而PC9对吉非替尼敏感。不同剂量AETC对PC9和PC9/R细胞均有浓度依赖性抑制作用，实验组光密度值较对照组显著降低(P<0.05) (图1一个而且1 d)．我们使用浓度为0.25 mg/ml的AETC联合不同浓度的吉非替尼来检测PC9和PC9/R细胞系的抑制率。在本实验中，此浓度的AETC具有最小的细胞毒性。两药联合治疗效果优于单药治疗(图1 g)在PC9和PC9/R细胞系中表达(P<0.05)。PC9和PC9/R的联合指数分别为0.278和0.645，说明AETC联合吉非替尼可达到增效。因此，AETC联合吉非替尼可减弱PC9和PC9/R细胞系。
| 细胞系 | IC50值 | 结合指数(CI) | ||
|---|---|---|---|---|
| AETC (毫克/毫升) |
吉非替尼 (μ摩尔/升) |
0.25毫克/毫升AETC +吉非替尼 (μ摩尔/升) |
||
| PC9 | 1.693±0.25 | 0.044±0.005 | 0.005±0.001 * | 0.278 |
| PC9 / R | 1.344±0.075 | 14.245±0.243 | 5.516±1.145 * | 0.645 |
表1:AETC、吉非替尼或AETC加吉非替尼在PC9和PC9/R细胞系中的IC50值及联合指数(CI)，与吉非替尼比较，*P<0.05。
图1:AETC、吉非替尼或AETC联合吉非替尼对PC9和PC9/R细胞系增殖的影响
A:不同浓度AETC(0.25、0.5、1、2、4 mg/ml)对PC9细胞的抑制率;B:不同浓度吉非替尼(0.01、0.02、0.04、0.5、10 μmol/l)对PC9细胞的抑制率;C: 0.25 mg/ml AETC加不同浓度吉非替尼(0.01、0.02、0.04、0.5、10 μmol/l)对PC9细胞的抑制率;D:不同浓度AETC(0.25、0.5、1、2、4 mg/ ml)对PC9/R细胞的抑制率;E:不同浓度吉非替尼(3、6、9、15、30 μmol/l)对PC9/R细胞的抑制率;F:不同浓度的0.25 mg/ml AETC +吉非替尼(3、6、9、15、30 μmol/l)对PC9/R细胞的抑制率;G: AETC (mg/ml)、吉非替尼(μmol/l)和0.25 mg/ml AETC +吉非替尼(μmol/l)对PC9、PC9/R细胞系的IC50值。
PC9和PC9/R细胞系中EGFR信号通路蛋白水平的联合影响
确定AETC联合吉非替尼对PC9和PC9/R细胞系的影响在体外，通过Western-blot检测EGFR蛋白及其下游信号通路ERK信号通路、PI3K/AKT信号通路、STAT3信号通路的表达。如图2而且图3在PC9细胞系中，联合治疗组较单独吉非替尼可显著降低P - egfr、P - akt、P - stat3的表达(P<0.05)。上述结果表明，AETC联合吉非替尼可抑制PI3K/AKT和STAT3通路的激活。与对照组比较，单独AETC可降低PC9细胞中EGFR、P -EGFR、P - erk1 /2、PI3K、AKT、P -AKT、STAT3、P -STAT3的表达(P<0.05)，说明AETC可抑制PC9细胞中EGFR及其下游分子的表达。
图2:AETC、吉非替尼或AETC联合吉非替尼对PC9和PC9/R细胞中EGFR及下游信号通路相关蛋白表达的影响AETC组用0.25 mg/ml AETC治疗72 h;吉非替尼组以3 μmol/L吉非替尼作用于PC9/R细胞72 h, 0.02 umol/L吉非替尼作用于PC9细胞72 h;联合组用0.25 mg/ml AETC + 3 μmol/L吉非替尼作用于PC9/R细胞72 h, 0.25 mg/ml AETC + 0.02 μmol/L吉非替尼作用于PC9细胞72 h;对照组用细胞培养基处理。
图3:AETC、吉非替尼或AETC联合吉非替尼对PC9和PC9/R细胞中EGFR及下游信号通路相关蛋白表达的灰色强度比与吉非替尼组比较，*P<0.05;与对照组相比，△P < 0.05。
在PC9/R细胞系中，与吉非替尼相比，AETC联合吉非替尼可显著降低P - egfr、P - erk1 /2、PI3K、P -AKT、P -STAT3的表达(P<0.05)，说明两药联合可能通过抑制ERK、PI3K/AKT和STAT3信号通路的激活来抑制PC9/R细胞系吉非替尼耐药。与对照组比较，单用AETC可降低PC9/R细胞中P -EGFR、P - erk1 /2、PI3K、AKT、P -AKT、STAT3、P -STAT3的表达(P<0.05)，说明AETC可抑制PC9/R细胞中EGFR及其下游分子的表达。
PC9和PC9/R细胞系中EGFR信号通路mRNA水平的联合影响
为了探索AETC联合吉非替尼在基因水平上的作用，我们检测了PC9和PC9/R细胞系中EGFR及下游信号通路相关mRNA的表达水平。作为图4一结果表明，与吉非替尼相比，AETC联合吉非替尼可显著降低PC9细胞系中EGFR、ERK1、ERK2、AKT mRNA的表达(P<0.05)，而PI3K、STAT3 mRNA的表达未见明显变化。
图4:AETC、吉非替尼或AETC加吉非替尼对PC9和PC9/R细胞中EGFR及下游信号通路相关mrna表达的影响
AETC组用0.25 mg/ml AETC治疗72 h;吉非替尼组以3 μmol/L吉非替尼作用于PC9/R细胞72 h, 0.02 μmol/L吉非替尼作用于PC9细胞72 h;联合组用0.25 mg/ml AETC + 3 μmol/L吉非替尼作用于PC9/R细胞72 h, 0.25 mg/ml AETC + 0.02 μmol/L吉非替尼作用于PC9细胞72 h;对照组用细胞培养基处理。与吉非替尼组比较，*P<0.05;与对照组相比，△P < 0.05。
PC9/R细胞系中，联合组与吉非替尼组比较，EGFR、ERK1、ERK2、PI3K、STAT3 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。图4 b)．
与对照组相比，AETC组可降低PC9和PC9/R细胞系中EGFR、ERK1、ERK2、PI3K、AKT、STAT3 mRNA的表达水平。
在活的有机体内实验
AETC能抑制裸鼠PC9和PC9/R异种移植细胞的生长:基于在体外实验表明，AETC具有抗肿瘤作用在活的有机体内被进一步探讨。裸鼠接种后每日给药。所有移植瘤在接种后5天左右均可触及，成瘤率100%。图5一个而且表2由于PC9是吉非替尼敏感细胞系，接受吉非替尼或吉非替尼加AETC的裸鼠的异种移植在治疗后约10天消失。与对照组相比，AETC处理的裸鼠异种移植物生长缓慢，AETC组的异种移植物重量(0.921±0.405 g)显著轻于对照组(1.398±0.417 g) (P<0.05)。如图5 b而且表2AETC联合吉非替尼对PC9/R诱导的异种移植生长的抑制效果优于单独使用吉非替尼(P<0.05)， AETC联合吉非替尼组和吉非替尼组的抑制率分别为71.9%和63.1%。此外，与对照组相比，AETC组的抑制率为56.9%，说明AETC单用能显著抑制肿瘤生长(P<0.05)。
| 集团 | n | PC9 | PC9 / R | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 异种移植重量(g) | 抑制率(%) | 异种移植重量(g) | 抑制率(%) | ||
| AETC | 8 | 0.921±0.405△ | 34.1 | 0.604±0.239△ | 56.5 |
| Gefitinb | 8 | 0.000±0.000△ | One hundred. | 0.513±0.259△ | 63.1 |
| AETC +吉非替尼 | 8 | 0.000±0.000△ | One hundred. | 0.391±0.095 *△ | 71.9 |
| 控制 | 8 | 1.398±0.417 | 0 | 1.390±0.720 | 0 |
表2:不同处理对PC9及PC9/R异种移植生长的影响与吉非替尼组比较，*P<0.05;与对照组相比，△P < 0.05。
图5:不同处理对PC9和PC9/R异种移植细胞生长的影响AETC组每天加10.4 mg/10 g AETC;吉非替尼组患者每日给予吉非替尼0.5 mg/10 g;联合组患者给予AETC 10.4 mg/10 g/ d +吉非替尼0.5 mg/10 g/ d);对照组患者每日加用NS 0.1 ml/10 g;
AETC对PC9和PC9/R异种移植组织中EGFR及下游信号通路相关蛋白表达水平的影响
图6而且图7在PC9诱导的肿瘤中，AETC可显著降低EGFR、P -EGFR、P - erk1 /2、PI3K、P -AKT、P -STAT3蛋白的表达水平(P<0.05)，说明AETC在PC9诱导的肿瘤中通过抑制EGFR及其下游ERK、PI3K/AKT、STAT3信号通路实现抗肿瘤作用。
图6:AETC、吉非替尼或AETC联合吉非替尼对PC9和PC9/R异种移植组织中EGFR及下游信号通路相关蛋白表达的影响
图7:AETC、吉非替尼或AETC联合吉非替尼对PC9和PC9/R异种移植组织中EGFR及下游信号通路相关蛋白表达的影响与吉非替尼组比较，*P<0.05;与对照组相比，△P < 0.05。
在PC9/R诱导的肿瘤中，与吉非替尼组相比，AETC联合吉非替尼可显著降低EGFR、P -EGFR、ERK1/2、P -ERK1/2、PI3K、AKT、P -AKT、P - stat3的表达水平(P<0.05)。与对照组比较，单用AETC可降低EGFR、P -EGFR、P - erk、PI3K、P - akt、STAT3、P -STAT3的表达水平(P<0.05)。这一结果说明联合组在PC9/R诱导的肿瘤中获得抑制吉非替尼耐药的机制与抑制ERK、PI3K/AKT、STAT3信号通路密切相关。AETC通过抑制EGFR及其下游ERK、PI3K/AKT、STAT3信号通路在PC9诱导的肿瘤中发挥抗肿瘤作用。
AETC对PC9和PC9/R异种移植组织中EGFR及下游信号通路相关mRNA表达水平的影响
在PC9诱导的肿瘤中，AETC组可显著降低EGFR、ERK1、ERK2、PI3K、AKT mRNA的表达水平(P<0.05) (图8)．
图8:AETC、吉非替尼或AETC联合吉非替尼对PC9和PC9/R异种移植组织中EGFR及下游信号通路相关mrna表达的影响与吉非替尼组比较，*P<0.05;与对照组相比，△P < 0.05。
进一步研究AETC联合吉非替尼在mRNA水平上抑制PC9/R异种移植组织吉非替尼耐药的机制。我们检测了PC9/R异种移植细胞中EGFR、ERK、PI3K、AKT、STAT3 mRNA的表达水平。PC9/R诱导的肿瘤中，PI3K、AKT、STAT3 mRNA较吉非替尼组明显降低(P<0.05)，而EGFR、ERK无明显差异(P<0.05)。图8 b)．单用AETC可抑制PC9/R诱导的肿瘤中EGFR、ERK2、PI3K、AKT mRNA的表达水平(P<0.05)。
最近，靶向抗癌药物，包括EGFR-TKIs，已被批准用于NSCLC的治疗。然而，由于原发性或获得性耐药，并非所有患者都受益于这种疗法。对吉非替尼或厄洛替尼耐药患者的法替尼改善。尽管阿法替尼有望克服egfrt790m介导的对第一代可逆EGFR TKIs的获得性耐药，并且ALK抑制剂克唑替尼与EML4-ALK基因的改变一起使用[2，6-8］．但这两种药物未能证明吉非替尼或厄洛替尼耐药患者的总体生存改善。因此，NSCLC的治疗方案仍然不能令人满意。
EGFR-TKI获得性耐药的机制可分为以下几点。(1) EGFR继发性突变:T790M是EGFR最常见的继发性突变，约占临床上吉非替尼和厄洛替尼获得性耐药的50% [9］．T790M增加ATP对EGFR的亲和力，抑制EGFR- tki对EGFR的亲和力[10］．(2) HGF/MET通路激活:HGF过表达、MET扩增、MET突变、MET过表达是激活HGF/MET通路的因素[11，12］．研究表明，约20%的EGFR-TKI获得性耐药患者HGF/MET途径被激活[13］．HGF/MET通路的激活导致下游通路如PI3K/AKT通路的激活，从而促进肿瘤的发生[12，14］．(3) IGF-1R通路的激活。(4) HER2突变[15］．(5) HER3的激活[16，17］．(6) SCLC表型转化。(7) EMT。前两种机制在临床上占EGFR-TKI耐药的70%以上。
目前，已有几种草药提取物通过抑制EGFR及其下游途径来克服EGFR- tkis耐药性。淫羊藿提取物联合吉非替尼可通过PI3K/Akt/mTOR通路对H1975和PC9/GR细胞产生协同抑制作用[18］．Hong发现木犀草素通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路，在细胞和动物水平上对埃洛替尼耐药EGFR T790M突变NSCLC具有显著的抗肿瘤活性[19］．
我们之前的研究表明AETC具有抗肿瘤作用在活的有机体内而且在体外AETC的抗肿瘤作用机制与紫杉醇不同。在A549细胞系中，AETC通过诱导早期凋亡阻断A549细胞，而紫杉醇通过诱导坏死和晚期凋亡阻断A549细胞[3.］．同时，AETC可抑制A549细胞系和A549异种移植中EGFR下游信号通路- MAPK/ERK通路的激活[5］．在本研究中，MTT结果显示AETC和吉非替尼对PC9/R细胞有协同作用，动物实验显示AETC联合吉非替尼能显著抑制PC9/R诱导的肿瘤生长。这些结果表明AETC联合吉非替尼对PC9/R细胞系的抑制作用比单独使用吉非替尼更强在体外而且在活的有机体内．此外，与对照组相比，单独使用AETC可在PC9和PC9/R细胞系中达到抗肿瘤作用在活的有机体内而且在体外．基于上述结果，我们通过EGFR及其下游通路的检测，进一步探索AETC联合吉非替尼抑制吉非替尼耐药的机制。
EGFR及其下游细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)、磷脂化肌醇3-激酶(PI3K)/AKT和信号转导器和转录激活因子3 (STAT3)通路通过激活EGFR、FGFR或其他生长因子受体参与肿瘤的生存、增殖和/或进展M [20.-22］．
PI3K在细胞膜上被一些生长因子受体如EGFR, c-MET, c-KIT, IGF-IR激活。活化的PI3K随后催化PIP2转化为PIP3 [23］．随后，AKT被Thr308和Ser473氨基酸磷酸化激活[22］．活化的AKT不仅在抗凋亡信号通路和细胞葡萄糖代谢中发挥重要作用，而且在EGFR突变的NSCLC中也是一个很好的预测因子[21，24］．PI3K/AKT持续激活与吉非替尼耐药NSCLC密切相关[25］．因此，PI3K和AKT抑制剂联合EGFR-TKIs被认为在克服EGFRTKIs耐药方面具有光明的前景[26，27］．我们的研究表明，AETC联合吉非替尼与单独吉非替尼相比，可以显著下调PI3K、磷酸化akt蛋白和PI3K mRNA的表达水平在体外而且在活的有机体内．由此可见，AETC联合吉非替尼可能抑制PI3K/AKT通路。
ERK1/2由有丝分裂因子激活，在细胞增殖、转化和生存等过程中发挥重要作用。ERK2的扩增诱导上皮细胞向间质细胞转化，并被确定为导致NSCLC中EGFR-TKI耐药的机制[28］．研究表明ERK的再激活可诱导吉非替尼耐药，ERK和EGFR的双重抑制可能是克服吉非替尼耐药的策略[29，30.］．此外，ERK与PI3K/AKT通路存在许多交叉对话，当PI3K/AKT通路被阻断时，ERK1/2可维持AKT磷酸化[23，31］．Chetram等研究发现，在(NSCLC)中ERK1/2信号通路的激活具有ERK1/2的高表达，其磷酸化水平明显升高。抑制ERK1/2磷酸化可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，在肺癌抑制中发挥作用。在我们的研究中，与吉非替尼组相比，AETC联合吉非替尼除阻断PI3K/AKT通路外，还能在细胞和动物水平上显著抑制磷酸化ERK1/2和ERK2 mRNA的表达水平，说明AETC可抑制ERK1/2信号通路。
STAT3是STAT家族成员，STAT3在EGF、IL-6、干扰素等多种细胞因子的激活下形成二聚体[32，33］．STAT3在肿瘤发生过程中具有重要的作用，它调控细胞生长，调节细胞凋亡、肿瘤血管生成和转移[32］．研究表明，激活的EGFR/STAT3可促进NSCLC生存，激活STAT3可损害吉非替尼的疗效，抑制STAT3活性可使吉非替尼耐药的非小细胞肺癌增敏[34-37］．此外，STAT3的激活与AKT有关，Wu发现STAT3介导的AKT激活导致吉非替尼耐药NSCLC [34］．事实上，JAK/STAT3的强度和持续时间促进了免疫抑制微环境的形成，并消除了抗肿瘤反应，其中包括树突细胞、T细胞和自然杀伤细胞(NK)的失活。此外，激活的JAK/STAT3可以通过转录调节炎症细胞因子的表达[14］．此外，STAT3的激活调节血管内皮生长因子的表达，最终向浸润和转移进展[15］．我们的研究表明，联合组较吉非替尼组可显著抑制p-STAT3和STAT3 mRNA的表达，说明AETC可抑制STAT3通路。
上述结果和讨论表明，AETC联合吉非替尼可抑制吉非替尼耐药，AETC对PC9/R细胞和异种移植的作用靶点是EGFR及其下游途径。单独使用AETC可以通过抑制EGFR及其下游途径在PC9和PC9/R细胞系中达到抗肿瘤作用。基于以上结果，我们认为AETC是一种有效的抗肿瘤药物，可以在世界范围内使用。
周彩村教授(同济大学附属上海肺科医院)提供PC9和PCR细胞。浙江中医药大学医院中心实验室的每一位老师都给予了我们指导帮助。
