微重力对表型、基因组和转录组的链球菌肺炎

文摘

摘要目的:微重力可以影响病原菌通过改变不同的生物学特性。然而,微重力对肺炎链球菌的影响以及相关机制尚不清楚。方法:多重耐药链球菌引起的肺炎应变是在微重力或重力环境中培养16 h。随后,各种表型进行了化验,包括形态、生长曲线、生物膜的形成和酸和碱的压力。结合基因组和转录组分析。结果:与重力和亲本菌株相比,形态学,微重力菌株的生长曲线和生物膜的形成并没有改变,而微重力应变增加了耐弱酸和基础解决方案和利用glucuronamide失去了能力。比较基因组和转录组分析显示,微重力菌株代谢相关基因表达的变化,细胞壁/胶囊和细胞的防御机制。结论:我们的研究揭示了微重力对新陈代谢有重要影响和适应在肺炎链球菌,它表现出极大的灵活性和适应性生存成功地通过多个生理功能的调节和细胞通路。它可能提供新的空间微生物学的理解。

关键字

链球菌引起的肺炎;微重力;表型;基因组;转录组

介绍

微重力是主要的特征区别的环境空间,在地上。细菌在微重力培养可以自适应地改变自己的行为。尽管太空任务是一种适当的方法来研究微重力的影响细菌,所需的费用和技术限制在大多数国家。另外,使用旋转壁容器(RWV)和高纵横比血管(哈里)可用于地面模拟微重力建模低切(LSMMG) [1]。使用这种设备,研究人员报道,微重力条件可以导致细菌生理变化(2]。这些变化包括增长率、酸压力、渗透压力和氧化应激(3- - - - - -5]。此外,毒性、抗抗生素和一些细菌生物膜的形成增加(6,7]。作为太空任务已经变得越来越频繁,这些变化被认为是对人类健康的潜在威胁,尤其是对宇航员。

宇航员在太空飞行中,生活在一个环境,其中包含引力,空间辐射,改变营养状况和焦虑,可能产生不利影响的因素免疫系统函数(8]。在这些条件下,宇航员高感染的风险,包括机会性感染引起的细菌性病原体的扩散通常控制在人类健康的环境与重力(9]。

链球菌引起的肺炎是一个重要的病原体感染会导致在任何年龄的人。这些细菌在鼻咽和可以移动到中耳,血液和肺生长环境的变化时,导致细菌性脑膜炎,败血症和中耳炎10,11]。每年有近100万人死于由于社区获得性肺炎链球菌引起的肺炎感染(12]。现在一天,耐药链球菌引起的肺炎广泛分布在世界各地,可以送往太空的宇航员。然而,目前尚不清楚微重力影响如何链球菌引起的肺炎。在这项研究中,我们使用了RWV诱导低切模拟微重力然后评估表型、基因组和转录组的变化链球菌引起的肺炎在LSMMG环境改变后16 h。

材料和方法

细菌生长情况

一个链球菌引起的肺炎属于血清型的菌株,3,是孤立的肺炎患者的痰。肺炎双球菌在脑心浸液肉汤培养(BHI;Oxoid贝辛斯托克,英国有5%的羊血在37°C ~ 8 h。文化被稀释1:200到50毫升的BHI肉汤,然后放入三15毫升RWVs,一种旋转生物反应器设计的生物物理研究所,中国科学院。是小心,每船完全充满培养基没有任何泡沫创造一个低切的环境。RWV孵化项目的都是维持在37°C的自转速率30 rpm。压力16 h名叫M48,孵化和培养的菌株在重力和亲代菌株被命名为G和P株,分别。

扫描电子显微镜

细菌细胞后被放置在一个铜网被PBS。然后,铜网是固定的(卷/卷)为2.5%戊二醛在PBS 3 h和使用分级乙醇脱水。样本临界点干燥,涂上goldpalladium。范量子FEG 205 SEM扫描电子显微镜(波特兰,俄勒冈州,美国)是用来扫描样品。所有实验至少重复三次。

生长曲线测定

50μl整除后被从RWVs培养16 h,稀释106 CFU /毫升的浓度。然后,10μl稀释细菌的解决方案是添加到96 -微量滴定板。盘子被孵化24小时在37°C, 5%的公司₂300μl新鲜Todd-Hewitt肉汤为0.2% (wt /卷)酵母(你的汤)。光密度(OD)在600纳米测量每2 h。一个空白的只有300年μl你肉汤也包括在内。总共有三个复制每个应变化验。

生物膜的形成分析

进行了生物膜的形成分析根据我们以前公布的方法(13]。细菌在你的肉汤稀释100倍,然后被接种到每个96孔聚苯乙烯的平底的微量滴定板和静态孵化在37°C公司为5%₂洗后24 h。PBS取消独立的细胞,结晶紫(0.1% w / v;σ)添加到连接细胞染色井30分钟25°C。盘子洗了PBS为10分钟,然后晾干;彩色的生物量在1% (w / v) SDS可溶性。的吸光度也决心在OD 600海里。所有实验至少重复三次。

药敏测试

药物磁化率测试(DST)肺炎链球菌菌株进行使用生物群系'rieux VITEK-2 ASTGN13系统制造商的指令如前所述。以下18药物测试:青霉素(P)、头孢曲松(CRO)、头孢噻肟(CTX),头孢呋辛(CXM),阿莫西林/ clavulanate钾(AMC),氨苄青霉素(AMP),氨苄西林/ sulbactam (SAM)、红霉素(E)、阿奇霉素(AZM)、克林霉素(CC), imipenem (IMP),左氧氟沙星(LVX) linezolid (LZD) meropenem (MEC)莫西沙星(MXF),四环素(TE),功效(SXT)和万古霉素(VA)。

的敏感性链球菌引起的肺炎菌株酸碱压力

评估的阻力链球菌引起的肺炎菌株酸碱压力,之前Cumley等报道的方法是使用[14]。菌株在PBS (pH值7.4),然后洗稀释100倍到缓冲区的各种小灵通和孵化37°C 1 h。数量估计连续稀释与电镀的潜伏期,相比之下,最初的生物的数量。磷酸钠种社会缓冲¯¬ed pH值是由混合0.2不₂阿宝₄和0.2 Na₂HPO₄与盐酸在必要时进行调整。所有实验至少重复三次。

碳源利用和化学敏感性分析

一个生物测井GENIII微型板块是用于分析链球菌引起的肺炎94年菌株表型测试,其中包括71年碳源利用率分析和23个化学敏感性分析。实验方法是根据以下步骤:3毫米直径区域的细胞来自虫+ B琼脂板的表面(生物测井、钙、美国)使用无菌cotton-tipped拭子和接种成好事培养液(生物测井、钙、美国)。剂被设定的目标细胞密度90 - 98% T用浊度计(BioMerieux,里昂,法国)。100μl的培养液添加到每个的96年的第三代MicroPlateTM(生物测井、钙、美国)结果是读自动和视觉上使用生物测井标(590海里)在孵化器孵化后24 h和37°C。

全基因组测序、装配和比较分析

基因组DNA提取使用工具包提供的Illumina公司公司根据制造商的说明;为所有三个菌株500个基点图书馆是构建。整个基因组测序进行使用Illumina公司HiSeq 2000系统(美国Illumina公司,圣地亚哥,CA)生产100 bp paired-end读取。原始数据是减少使用FastQC [15)获得高质量的读取,然后读取被组装使用SOAP denovo2 [16]。单核苷酸多态性(SNPs)检测到参考基因组的比较肺炎链球菌加入环流(数量:NC_012466)使用SOAP 2.21 [17),和功能分析是基于应变环流的注释。开放阅读框(orf)预测使用线3,然后注释与NT相比之下,NR和齿轮数据库使用爆炸的价值1 e-5 [18]。抗生素抗性基因预测相比ARDB(抗生素抗性基因数据库)数据库(19]。

RNA-seq和比较转录组分析

总RNA样本孤立使用RNeasy植物迷你包(试剂盒、钙、美国)。测序进行了使用一个Illumina公司Hiseq 2000系统。Paired-end读取的基因组序列映射到应变M48使用SOAP 2.21 [17]。读取映射到每个基因的数量计算使用PERL脚本。RPKM(读/ kb每百万读)值提供了能够比较不同样本之间的相对转录丰度(20.];然后映射计数数据规范化,使用R 3.2.1用于基因表达差异分析(21]。

结果

三个菌株的表型差异

微重力菌株的形态M48,重力菌株G和父母的压力P使用光和扫描电镜观察。所有三个菌株被安排为链,观察微重力和重力之间没有区别菌株(图1一个)。这表明没有明显改变后的形态特征应变LSMMG培养。

生长曲线和生物膜这三个菌株的形成还显示没有显著差异(图1 b和1 c)。此外,我们的研究结果表明,这些菌株具有很强的生物膜的形成能力。药敏测试表明,父母的压力P耐红霉素,阿奇霉素,克林霉素,四环素和功效,耐药性的菌株G和M48保持不变(补充表1)。

关于酸碱压力的敏感性分析,我们的研究结果表明,存活率提高接触后的M48应变pH值6和8磷酸钠缓冲区,而P和G菌株没有明显的区别在孵化后存活率与缓冲区与三个不同的pH值(图2)。为了更好地理解这些菌株的代谢变化,我们也进行碳源利用率和化学敏感性分析使用96 -生物测井的第三代微型板块。我们发现M48应变失去了利用的能力glucuronamide与P和M48染色相比,而G菌株获得的能力利用肌苷。M48和G菌株成为能够使用甲基丙酮酸与P压力。23,化学敏感性分析中没有观察到明显的变化在三个菌株。

基因组序列的一般特征

所有三个菌株的全基因组测序。P应变,共有286个支架是由2226957个基点的总长度和平均GC含量为40.01%。全基因组测序数据所示表1。基因组与参考基因组的细节肺炎链球菌环流的显示为一个圆形表示基因组功能(图2)。

表1。统计全基因组测序。

基因组的比较

P应变作为参考应变分析snp。与P株相比,共有15个snp在G和M48菌株被发现。其中,7是同义突变,和8个非同义突变。所有这些snp映射到14个基因和功能注释中列出表2。只有一个SNP菌株G和M48之间的不同,这是坐落在一个假设的蛋白质。图3显示的一个圆形表示基因组功能,包括单核苷酸多态性,GC扭曲,GC含量,齿形带注释的编码序列。

表2。SNP G和M48应变信息;#;+:上游的cd, -:下游的cd $: *:终止密码子

转录组序列的一般特征

最初读数字压力P, G和M48 22837384;20926330;和12115562年,分别为(表3)。总清洁读取的数字是19320026;16897612;和9985094年的压力P, G和M48分别。映射读取的数量和分布的所有三个菌株RPKM值显示在补充数据。所有基因的表达水平和差异表达基因中确定P G和M48菌株(褶皱变化> 2)所示图4和5。P和G菌株有相似度,但从应变M48显著不同。

表3。统计全转录组测序。

比较转录组分析

基于RPKM(度)的差异表达基因有494中确定菌株与菌株相比M48 P和G .我们分类根据其齿轮功能菌株的度(包括:压力P与M48和G比M48)。而压力P,许多基因参与氨基酸、碳水化合物和脂质运输和代谢在应变M48差异表达。氨基酸和碳水化合物运输的主要基因和代谢差异,而脂质运输和代谢基因被抑制。此外,许多基因参与细胞壁/膜/信封生物起源、复制、重组、修复和ABC-type多重运输系统被上调菌株与菌株相比M48 P和G。

讨论

众所周知,太空环境有影响微生物(22]。大量的研究报道,细菌发送到空间或孤立的宇航员有耐药性的变化,生长曲线和压力适应(23- - - - - -25]。这些变化增加了细菌生活在空间环境的适应性。因此,感染疾病仍是一个健康威胁到宇航员。例如,大量的微生物包括结膜炎和急性呼吸道感染和口腔感染发生在1995年3月至1998年6月在俄罗斯空间站米尔(26]。肺炎链球菌是最常见的病原体引起社区获得性肺炎(12]。最近,耐药性的广泛分布链球菌引起的肺炎可以采取飞船的宇航员和空间环境的影响。在这项研究中,我们报告表型的变化链球菌引起的肺炎培养下LSMMG 16 h。使用基因组和转录组的分析我们发现,微重力环境影响了代谢相关基因表达和适应的链球菌引起的肺炎。

形态学研究表明微重力应变M48保持亲代菌株的形态观察P和重力培养菌株g .我们先前的研究肺炎克雷伯菌太空飞行后显示,压力变成细长和附着形式(13]。链球菌引起的肺炎有更厚的细胞壁比gramnegative肺炎克雷伯菌还有一个胶囊,导致细胞结构更加稳定。此外,我们发现微重力对生长曲线没有影响或生物膜的形成。antibiotic-related基因的突变是主要原因链球菌引起的肺炎已获得性耐药能力。在我们目前的研究中,与ARDB相比,父母的压力被证明拥有多个基因与耐青霉素、红霉素、四环素和甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲恶唑。然而,链球菌引起的肺炎没有失去抵抗这些药物在微重力环境中,突变基因也没有改变。

许多研究发现,碳源的利用率可以显著的改变空间环境(27- - - - - -29日]。这是因为细菌在极端环境中自发调节新陈代谢增加自适应能力。在我们的研究中,利用glucuronamide M48应变失去了能力。基因组和转录组序列显示,许多基因参与氨基酸和碳水化合物的运输和代谢差异。研究艾伦哈里模拟LSMMG用于培养链球菌引起的肺炎。RNA的微阵列分析还表明,基因在细胞被膜和新陈代谢都——或衰减30.]。

后文化在微重力环境中,生存的压力M48更耐弱酸和磷酸基的解决方案。以前的研究显示,沙门氏菌生长在低切微重力条件下显示增加抗酸因为某些基因的表达的变化3]。在我们目前的研究中,与压力P和G相比,我们发现基因参与细胞防御机制差异,尤其是ABC-type多重交通系统相关基因。ABC-type多重交通系统被发现参与抵抗的Lactococcus lactis胆汁酸(31日]。此外,荚膜多糖生物合成相关基因蛋白在应变M48差异。的胶囊链球菌引起的肺炎可以保护细胞免受环境压力。

比较转录组分析显示,基因表达的菌株P和G相似,但与应变M48不同。此外,尽管M48和G应变共享相同14个SNP, M48应变有另一个SNP。比较基因组和转录组分析建议M48应变经历了微重力下的更多的压力比G应变在重力条件下栽培。大部分差异表达基因的菌株M48,相比之下,两个菌株G和M,被发现参与各种代谢途径,包括下面的齿轮类:氨基酸运输和代谢;碳水化合物的运输和代谢;细胞防御和复制;和重组和修复功能。这些发现表明,在应对环境压力,病原菌表现出极大的灵活性和适应性生存成功地通过多个生理功能的调节和细胞通路。

基因分析表明,G应变有14个snp根据P压力。和差异表达基因参与碳水化合物的运输和代谢;转录;翻译,核糖体结构和生物起源被发现G和P之间的压力。我们推测,G应变随机突变,同时,对其基因表达的监管时培养for16 h。

总之,利用表型、基因组和转录组分析,研究多重耐药肺炎链球菌培养LSMMG表明LSMMG-related压力对新陈代谢有重要影响和适应在这个压力。我们目前的研究可以作为疾病风险评估的基础和替代治疗方法旨在预防或治疗感染在太空飞行任务。

确认

这项工作得到了中国国家基础研究计划(973计划)2014号cb744400,中国国家自然科学基金81350020号和2015号国家重大科学基金zx09j15102 - 003。

竞争的经济利益

作者宣称他们没有竞争的经济利益。

基因组和转录组序列的三个肺炎链球菌菌株已经沉积在基因库加入数字SRP062448 SRS1036287 SRS1036288。

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