Scriptaid对细胞周期的影响和绵羊的核供体积云细胞组蛋白乙酰化作用和能力支持体细胞核移植胚胎的发展

文摘

令人信服的证据表明组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)影响体细胞核移植的发展(SCNT)胚胎。目前的研究是确定预处理的效果进行捐赠积云细胞Scriptaid小说(HDACi)细胞周期,组蛋白乙酰化和克隆绵羊的胚胎发展。首先,我们优化的效率Scriptaid在剂量(0、0.1、0.2、0.4和0.8μmol / L)和时间(0,12、24、36和48 h)的方式在这些胚胎的发育能力。然后,我们定量地评估了组蛋白H3赖氨酸乙酰化水平的改变9 (acH3K9)和组蛋白H4赖氨酸12 (acH4K12)的积云细胞和SCNT胚胎免疫荧光染色。此外,我们发现的比例在积云细胞G0 / G1期细胞。我们找到了一个显著提高克隆胚胎的囊胚发育率来自捐赠者积云细胞使用温和剂量(0.2μmol / L)的Scriptaid 24小时(21/86(24.39%)与11/85 (12.91%);P < 0.05)。同时,acH3K9的水平和acH4K12也在积云细胞和胚胎SCNT明显改善(P < 0.05)。此外,更多的积云细胞使用Scriptaid在G0 / G1期与对照组相比(84.22%比75.96%,P < 0.05)。总之,捐赠者积云细胞处理Scriptaid有利于SCNT胚胎的早期开发,提升acH3K9 / acH4K12和G0 / G1期细胞比例的积云细胞。 Scriptaid can be used to improve the efficiency of somatic cell nuclear transfer in ovine.

关键字

Scriptaid,积云细胞,体细胞核移植,组蛋白乙酰化作用,细胞周期,绵羊的

介绍

哺乳动物体细胞核移植(SCNT)是一种辅助生殖技术,可以产生大量的基因完全相同价值的后代。因此,这一技术已被证明能提高家畜繁殖[1]。同时,它也是一个有价值的工具,用于研究领域的繁殖和生物医学科学2,3]。然而,克隆效率低已经限制SCNT的广泛使用4]。SCNT低效率的最重要的原因之一是供体细胞核的表观遗传重编程不足(5]。以前的研究已经表明SCNT胚胎结果的不完全重编程异常基因表达模式(6]。因此,克隆胚胎停止发展,随后可能流产(7]。

组蛋白修饰是表观遗传重编程的主要机制,组蛋白乙酰化水平普遍较低在克隆胚胎8]。克服异常的表观遗传修饰,例如,通过人工的组蛋白乙酰化水平,提出了作为手段来提高克隆效率。组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)已被证明是提高乙酰化水平在体细胞或核移植胚胎,因为它使染色质更加灵活从而使转录因子的结合(9- - - - - -11]。Scriptaid,组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂,具有很高的组蛋白乙酰化活动和低细胞毒性(12]。多项研究表明,早期治疗与Scriptaid重构胚胎植入前胚胎发育能力可以显著提高小鼠(13)、猪(14,15)、牛(16)、水牛(17),兔(18和羊19]。尽管许多研究进行了重构胚胎Scriptaid对待,我们所知,没有研究Scriptaid预处理效果的绵羊的供体细胞SCNT胚胎的发展。此外,供体细胞的细胞周期和乙酰化水平使用Scriptaid没有被调查。

本研究的目的是确定(1)Scriptaid的最佳浓度和最佳治疗时间绵羊的捐赠者积云细胞;(2)的影响Scriptaid acH4K12的相对荧光强度和acH3K9积云细胞和acH4K12 SCNT胚胎;和(3)Scriptaid预处理的效果在积云细胞G0 / G1期细胞比例。

材料和方法

所有化学品和媒体购买从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州),除非另有指示。综述了所有和动物实验协议处理程序和批准的实验室动物保健和使用委员会河北。

材料与试剂:以下所有解决方案和媒体使用0.22毫米过滤器过滤(微孔爱尔兰有限公司,Tullagreen Carrgtwohill,有限公司,软木塞)。媒体的渗透性是280 milliosmoles和pH值保持在7.2和7.4之间。细胞培养基是杜尔贝科修改鹰介质(Gibco,宏伟的岛,纽约)补充10% (V / V)胎牛血清(HyClone,洛根,UT)。卵母细胞IVM介质是TCM199 (Gibco)补充10%胎牛血清(HyClone) 10⁵μg FSH /毫升、10⁵μg LH /毫升、10⁴μg /毫升E₂1更易/ L谷酰胺,20 ng / mL EGF。胚胎培养基与氨基酸合成输卵管介质(SOFaa)补充1%不重要的氨基酸,必需氨基酸1%,10 ng / mL EGF, 8毫克/毫升BSA, 1更易/ L谷酰胺。

收集卵母细胞体外成熟:绵羊的卵巢收集从一个当地屠宰场和后3小时内收集、运送到实验室30°C生理盐水含100单位/毫升青霉素和链霉素0.05毫克/毫升。卵泡直径3到6毫米的切片使用刀片。cumulus-oocyte复合物(COCs)卵泡液排放卵泡液的收集37°C;只有COCs超过三层的均匀分布的积云细胞和卵质均匀IVM的选择。在IVM COCs已经洗了三次后介质,80 COCs放入每一个四级的细胞培养板(Nunc、鲁开德、丹麦)包含500μL IVM媒体的平衡在一个5%的股份有限公司₂孵化器至少4小时。COCs都成熟了19小时38.5°C和5%股份有限公司₂在湿润的气氛。一般来说,卵巢和孵化的平均时间间隔收集COCs 4.5小时。

供体细胞的制备:积云细胞从成熟卵母细胞收集使用0.1%透明质酸酶在杜尔贝科的PBS (Gibco)与0.5% FCS (HyClone)。在300×g离心后5分钟,细胞被播种和井的培养24 -板包含DMEM (Gibco)与10% FCS (HyClone)为38.5°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。融合达到时,连接细胞分离与0.5%胰蛋白酶DMEM 3分钟,恢复细胞在300×g离心5分钟。由此产生的颗粒在上述介质和亚文化resuspended (1×10⁴细胞每24-well板)。个人积云细胞(通道2)获得0.5%胰蛋白酶消化,被用来作为供体细胞。

可控硅的治疗:可控硅(目录没有。S7817)溶解在二甲亚砜(DMSO溶液;目录没有。D2650)实现一个解决方案在500μmol / L,储存在-20°C和添加到合成oviductal流体使用串行(SOF)在不同浓度梯度稀释。任何剩余的股票的解决方案被储存在4°C不超过2周。确定最佳的治疗浓度,绵羊的积云细胞治疗0,0.1,0.2,0.4,0.8μmol / L Scriptaid 24 h。来确定最佳的治疗时间,绵羊的积云细胞被培养为0.2μmol / L Scriptaid 0, 6、12、24和48 h。

核移植、激活、胚胎培养:IVM 19小时后,COCs被剥夺了他们的积云细胞0.1%透明质酸酶在杜尔贝科的PBS补充0.5% FCS,和化学辅助去核进行报道(20.),小的修改。短暂,与可见卵母细胞第一极具尸体被孵化为38.4°C 30分钟修改杜尔贝科的PBS含0.5%胎牛血清和0.5μg /毫升秋水仙碱在精密控制。第一极体和胞质突起被荧光显微镜下配有显微操纵器单元的操作介质(杜尔贝科的PBS补充2% BSA) 37°C。成功摘出术证实了赫斯特33342染色。微量吸液管形状的玻璃在我们实验室进行了毛细血管。微量吸液管(15 - 20μm内径)包含介绍了供体细胞通过狭缝的透明带在摘出术,带之间的插入细胞和细胞质膜促进近膜接触和随后的融合。雷竞技网页版

细胞质和积云细胞电融合使用埃普多夫Multiporator(埃普多夫,汉堡,德国)融合介质由0.3 mol / L甘露醇,0.05 L CaCl更易₂和0.1 L MgSO更易₄(描述的21]。重构胚胎手动对齐一对铂微电极之间的融合室,以便联系膜的细胞质和供体细胞平行电极,和一个双直流脉冲的1.25 kV /厘米40毫秒间隔1秒的应用。雷竞技网页版

重构胚胎最初接触到2.5更易与L ionomycin室温下1分钟,然后孵化为38.5°C下5%的股份有限公司₂在湿润的空气2更易与L 6-dimethylaminopurine 2小时(22]。激活后,重构胚胎在胚胎培养的培养基为38.5°C下5%的股份有限公司₂调湿大气中不同时间间隔,然后转移到SOFaa介质后清洗三次。一般来说,30到50个胚胎培养四级500毫升中每口井的盘子。一半的培养基代替每一个48小时和文化的总持续时间是168小时。

检测组蛋白乙酰化水平供者细胞和胚胎SCNT:汇合的积云细胞通道2和SCNT胚胎都有和胚泡阶段被用来评估他们的组蛋白乙酰化水平。积云细胞/ SCNT胚胎与抗体应用acH3K9(细胞信号技术,贝弗利,MA)和acH4K12(纽约北部的生物技术,普莱西德湖)如前所述[19]。短暂,积云细胞/胚胎在磷酸缓冲盐(PBS)洗,然后用4%多聚甲醛固定在PBS 30分钟,特里同x - 100和permeabilized 0.5% PBS / 30分钟。细胞胚胎被封锁在1%牛血清白蛋白(BSA)在室温下PBS 60分钟。此后,积云细胞治疗anti-acetylated H3K9(1:200)或H4K12抗体(施用)为12小时在4°C, SCNT胚胎处理acH4K12抗体(施用)。然后细胞/胚胎被洗了三次5分钟在PBS和孵化1 h在1:10 0稀释异硫氰酸荧光素(FITC)标记的第二抗体(山羊antirabbit免疫球蛋白,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。DNA是沾10μg /毫升赫斯特33342(积云细胞)或10μg /毫升propidium碘(SCNT胚胎)10分钟。作为一个消极的控制,没有主要的抗体进行免疫染色。另外三个洗后,积云细胞/胚胎被安装在幻灯片和荧光检测尼康光谱共焦扫描显微镜(尼康公司(日本东京)。使用20个目标图像获得的。系统设置是对所有考试保持不变,并分析每组重复了三次。

荧光强度的量化使用EZ-C1免费查看器软件(尼康)所描述的23),做了一些调整。短暂,荧光测定的像素值在一个固定的区域从核区和胞浆区,从核和胞质值减去价值是每个积云细胞的荧光强度。至少30 / 10的胚胎细胞每次测量。

积云细胞治疗和细胞周期流仪分析:细胞周期分析了流式细胞术(描述24,25]。简而言之,积云细胞(5×10⁴)暴露在6-well Scriptaid,平底的盘子24小时。总细胞,悬挂和附着,收集,清洗,悬浮在寒冷的PBS。细胞被固定在冷冻70% (v / v)乙醇和染色在PBS含有0.1% (v / v)特里同x - 100, 0.1毫克/毫升的核糖核酸酶A和0.05毫克/毫升的propidium碘(π),15分钟37°C。细胞周期分布是衡量fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)石中剑流式细胞分析仪(加利福尼亚州圣何塞,正欲)。数据分析使用修改计划(真实软件,美国)。所有实验独立进行至少三次每实验一式三份点。

统计分析:实验至少重复三次。卵母细胞成熟在同一天被用来在每个复制删除批处理效果。所有值都呈现意味着标准差除非另有指示。反正弦转换和转换的比例数据规范化值分析单向方差分析结合费舍尔最显著差异测试使用SPSS 19.0统计包(SPSS, Inc .,芝加哥,IL)。除非另外注明,P < 0.05被认为是显著的。

结果

积云细胞治疗效果与Scriptaid绵羊的核转移胚胎的体外发育潜力:积云细胞治疗0.2μmol / L Scriptaid囊胚和桑椹胚的形成率增加(168小时;P < 0.05;表1)而没有治疗。然而,卵裂率没有明显不同Scriptaid-treated和未经处理的(控制)组。囊胚率和桑椹胚形成积云细胞治疗0.2更易与L Scriptaid 24或36小时高于治疗组(表2)。然而,Scriptaid各种治疗持续时间对卵裂率没有显著影响。

Scriptaid对表观遗传标记的表达的影响在积云细胞(acH3K9和acH4K12):积云细胞治疗后24小时,有0.2μmol / L Scriptaid强度的两个组蛋白乙酰化表观遗传标记(acH3K9和acH4K12)测量。0.2更易治疗/ L Scriptaid 24小时acH3K9荧光信号的增加和acH4K12积云细胞(图1)。acH3K9和acH4K12信号控制组降低(P < 0.05)。

积云细胞暴露于Scriptaid后细胞循环分析:分析了scriptaid-treated和未经处理的细胞的细胞周期通过流式细胞术分析(图2)。积云细胞培养24小时的Scriptaid显示积累在G0 / G1期(0.2μmol Scriptaid / L)的细胞周期。总共75.96±0.19%的未经处理的积云细胞,而84.22±0.33%的细胞培养0.2μmol Scriptaid / L,在G0 / G1期(表3,P < 0.05)。这些结果表明,积云细胞的治疗与Scriptaid导致逮捕细胞G0 / G1期细胞周期。

Scriptaid对绵羊的SCNT胚胎的表观遗传标记的表达:调查的乙酰化水平SCNT胚胎,acH4K12强度因子和胚泡阶段SCNT胚胎测量。与对照组相比,荧光信号的acH4K12 SCNT胚胎供体细胞治疗后显著增加0.2μmol / L Scriptaid 24小时(P < 0.05;图3)。

讨论

虽然成功克隆出大量物种使用SCNT技术,克隆效率仍然极低(26]。相关研究已经提供了很多证据表明,低效率SCNT技术是由不完全重编程的供体细胞27- - - - - -29日]。组蛋白乙酰化是表观遗传重编程的主要修改模式之一。与正常受精,受精卵SCNT胚胎的乙酰化水平下降(8,19]。因此,预处理的供者细胞HDACi预计将导致改善重组的成功率和SCNT效率。Kishigami et al。9)报道,trichostatin (TSA)组蛋白脱乙酰酶抑制剂治疗供者细胞明显改善克隆胚胎的发展能力没有明显异常的老鼠。然而,这仍然是一个争论是否SCNT HDACi与否确实是增加了使用效率。一些结果表明,改善SCNT胚胎的发展已经通过核移植前的预处理与TSA供者细胞(30.,31日由于高毒性的TSA)。所以另外一个策略是找到减少有毒的药物来治疗体细胞。

先前的研究表明,Scriptaid是一种新合成的化合物,常见的结构,但有一个相对较低的毒性比TSA (12]。也被报道,供者细胞的组蛋白乙酰化水平可以修改Scriptaid治疗,从而提高员工的发展克隆胚胎囊胚在牦牛32]。在目前的研究中,我们调查的影响绵羊的捐赠者积云细胞接受Scriptaid绵羊的SCNT胚胎的体外发展潜力。我们发现SCNT胚胎的囊胚发育率显著增强的预处理与0.2μmol / L Scriptaid供体细胞24小时。因此,Scriptaid增强克隆绵羊的胚胎的发育潜能的HDAC抑制剂。

供体细胞核的组蛋白乙酰化作用具有重要影响SCNT产生的克隆胚胎的发育潜能。H3K9和H4K12都是组蛋白乙酰化作用的重要网站。在染色质免疫沉淀反应实验中,组蛋白H4 hyperacetylated在活跃基因的启动子区域(33)和H4K12乙酰化是必不可少的胚胎基因激活(34]。此外,H3K9的乙酰化形成与一个活跃的染色质配置(35]。因此,anti-acetyl-histone H4K12和H3K9抗体被用来确定乙酰化水平的积云细胞和胚胎SCNT为了评估表观遗传重编程能力。在目前的研究中,供体的乙酰化状态积云细胞治疗Scriptaid明显改善(图1)。因此,我们推断,Scriptaid供者细胞的乙酰化模式修改。此外,我们发现acH4K12强度都有和胚泡期也明显增加(图3和4)。研究结果表明,更高级别的组蛋白乙酰化作用在供体核可以继承克隆胚胎,随后增强SCNT胚胎的发育能力。我们的结果是一致的报告,组蛋白hyperacetylation体细胞可以显著提高牛的囊胚率(36],bufflo [37]和狸子[38]SCNT胚胎。这种表观遗传标记的重组可以改善绵羊的SCNT胚胎的胚胎植入前发展能力。

供体细胞的细胞周期阶段影响SCNT胚胎的发展是一个重要的因素(4),因为供体细胞和受体卵母细胞的细胞周期协调是至关重要的维持DNA倍性和防止损坏(39]。因此,G0 - g1期细胞的细胞周期已经使用在几乎所有成功的报告(40),虽然在MII卵母细胞有丝分裂期的细胞也可以重新编程(41]。它也被报道,SCNT胚胎由G0 - g1期细胞显示无显著差异在胚泡的效率和足月的发展(42- - - - - -44]。因此,我们调查的比例G0 / G1期细胞周期的积云细胞治疗0.2μM Scriptaid 24小时(表3)。细胞周期分析显示,G0 / G1期细胞的相对百分比Scriptaid-treated组(84.22±0.33%)明显高于治疗组(75.96±0.19%,P < 0.05)。先前的研究表明,Scriptaid-induced细胞周期阻滞在很大程度上与海拔p21WAF1和p27KIP1 [45),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,有重要的作用在阻断细胞周期G1期(46]。这表明,治疗积云细胞Scriptaid有利于细胞周期阻滞于G0 / G1期(图2)和促进克隆胚胎发展(表1和2)。

总之,目前的研究表明,组蛋白脱乙酰酶抑制剂Scriptaid修改供体细胞组蛋白乙酰化状态,逮捕捐赠者积云细胞G0 / G1期,进而提高核重编程和绵羊的SCNT胚胎的发展潜力。结果表明Scriptaid-treated积云细胞可以作为适合绵羊的体细胞核移植的供体细胞。

确认

这项工作是支持的中国河北省自然科学基金(没有。C2014204119),中国河北省教育委员会重点项目(没有。ZD2014002)。作者感谢医生杰克以利沙Octura明道戴(东京大学)和医生(东京大学)校对的手稿。

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