烟气中SO2和NO2对小球藻CO2吸附的影响及细胞内微观结构分析。

摘要

研究了CO2、NO2和SO2对藻株C. vulgaris生长和胞内能量物质积累的影响。高浓度CO2-空气混合气体(10%，15% (v/v))能使藻类生长良好，15% CO2-空气混合气体生长一周生物量达到最大值，但由于培养基pH值的升高，5% CO2-空气混合气体培养的藻类更容易积聚脂质。NO2、SO2适量(NO2: 4.4 mg/d;SO2: 0.159 mg/d)对藻类生长无明显抑制作用，但可诱导藻类细胞中碳水化合物和脂类等能量物质的积累，这与微观结构观察和Rubisco活性分析结果一致。因此，适量的NO2和SO2有时有利于高浓度CO2下高能微藻的产生。

关键字

小球藻寻常的、有限公司₂隔离，模拟烟气，微观结构，复合材料分析，Rubisco

简介

大气中化石燃料燃烧产生的烟道气含有NO₂所以₂和有限公司₂元件，其中包括CO₂是微藻生物利用的宝贵资源。CO的生物固定与储存₂通过微藻进行光合作用，转化水和CO₂变成有机化合物，没有额外的能源消耗和二次污染。此外，微藻CO₂固定化具有光合速率高等优点[1]、易于控制的工作环境，光生物反应器培养微藻[2，3.)有限公司₂通过将可再生能源物质加入碳水化合物和脂类中进行固定，从而不产生CO₂向大气层净排放量[4，5］．然而，直接利用烟气进行大规模藻类培养，由于含有一定量的NO，对藻类生长有明显的抑制作用₂所以₂在烟道气中[6-8］．高有限公司₂微藻对环境中的CO的固定能力与核酮糖-1,5-生物磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)的活性有关₂在卡尔文循环中将其转化为有机碳。当Rubisco完全被CO饱和时₂时，光合效率达到最大值。然而，实际的光合效率远低于理想条件下的光合效率。在中等CO下₂水平，Rubisco只能发挥25%的催化能力，因为底物CO的浓度₂低于最高光合作用。藻类中溶解的无机碳含量主要是溶解的CO₂和HCO_3.光合作用，而是CO₂只占可利用无机碳的一小部分。碳酸酐酶(CA)在催化HCO的相互转化中起着至关重要的作用_3.和有限公司₂为了维持正常的光合作用[9-13］．此外，高浓度的O₂与CO竞争₂作为Rubisco的底物[12］．在本文中，我们将讨论烟气组分的影响，如高浓度的CO₂，适量NO₂，和SO₂藻类的生长和能量物质的积累。更详细地说，Rubisco与CO相关的活动₂biofixation由小球藻sp.和适量SO培养藻类的胞内显微结构₂也没有₂被调查。通过对实验结果的分析，探讨了相对适宜的栽培条件。

材料与方法

菌种及培养基

的海藻c .寻常的(FACHB-1227)种子悬液购自中国科学院水生生物研究所(中国武汉)，后将种子悬液转移到BG11培养基中进行维护。BG11培养基含有以下成分(以mg/l为单位):NaNO_3.1500;K₂HPO₄40;MgSO₄•7 h₂O 75;CaCl₂•2 h₂O 36;柠檬酸36;柠檬酸铁铵;EDTANa₂1;Na₂有限公司_3.20;A5溶液(单位:mg/l) H3BO 1 ml_3.2860年,MnCl₂•4 h₂O 1810, ZnSO₄•7 h₂o222, CuSO₄•5 h₂O 79, Na₂MoO₄•2 h₂O 21, Co(NO_3.2•6 h₂500年O。

成分分析

对干燥的生物量进行脂质、碳水化合物和蛋白质的分析。脂质测定采用磺胺磷香兰素(SPV)比色法[14］．而总碳水化合物分析则采用苯酚-硫酸法[15］．采用Lowry法结合Pruvost等人的方法进行蛋白质测定[16，17］．

总脂类分析

采用比色SPV法对总脂质含量进行了改进[14］．将10mg玉米油(Sigma-Aldrich)溶解在10ml氯仿中制备标准脂质原液。在2 ml的试管底部加入不同量的含50 ~ 500 μg脂质的标准液。溶剂在氮气流下干燥以避免氧化。随后，在2 ml试管中加入100 μl去离子水，与已知数量的藻类生物量和一定数量的标准原液混合。加入浓硫酸1.5 ml，旋涡搅拌均匀，100℃加热10 min，冰浴冷却5 min后再次搅拌。取100 μl移液至微孔孔底。测量530 nm处的背景吸光度。每孔加入100 μl香兰素-磷酸试剂(1.2 mg香兰素/ ml 68%磷酸)显色20 min，在530 nm处测定吸光度。

总碳水化合物分析

以已知的藻类生物量量为碳水化合物量，采用苯酚-硫酸法[15］．1.8 ml 1 M H₂所以₄将0.4 ml上清液或标准葡萄糖溶液加入2 ml 5%苯酚溶液中，放入2 ml试管中，在95℃水浴中加热2 h，冷却至室温，14000 rpm离心10 min。随后迅速加入浓硫酸1ml，立即旋涡搅拌均匀。在室温下冷却管30分钟显色后，在490 nm处测量吸光度。

总蛋白分析

藻类样品的蛋白质溶液按照Pruvost等人的描述制备[17，并作了一些修改。向样品中加入1 ml 1 N NaOH，旋涡搅拌均匀，在95°C水浴中加热10分钟。用NaOH碱解后，用0.5 ml 1.6 N HCl中和混合物。然后将样品冷却至室温，以14000 rpm离心10分钟。上清液用Lowry法测定蛋白质[16］．

藻类细胞中核酮糖-1,5-生物磷酸羧化酶加氧酶(Rubisco)的分析

海藻样本中rubisco的提取：以5000rpm离心相同浓度和体积的新鲜藻类培养物5分钟，制备从不同培养条件下收集的等量细胞样品。将上清液倒出后，向湿样品中加入1 ml预冷粗酶萃取液(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 ml M EDTA, 50 mM NaHCO_3.， 2 mM DTT, 10 mM MgCl₂)，在160 W超声作用下分别干扰3 min。然后，在3000 g下再次离心5分钟后，收集上清液用于后续Rubisco活性的测定[18］．

Rubisco活性测定：Rubisco活性用Rubisco试剂盒相关的微孔板吸光度仪测定。Rubisco试剂盒购自上海基业有限公司。本实验基于双抗体夹心法分析Rubisco水平。将纯Rubisco抗体固定在48微孔板上制备不溶性抗体，将标准Rubisco溶液和样品溶液分别加入48微孔板中，37℃孵育30分钟，生成抗体-抗原复合物。用洗涤液洗涤5次后，加入HRP(辣根过氧化物酶)标记的Rubisco抗体溶液，形成抗体-抗原标记酶复合物，再用洗涤液洗涤5次，在37℃反应30分钟后加入底物四甲基联苯胺(TMB)，在酸性条件下呈蓝色，随后呈黄色。最后加入止损缓冲液灭活相应的酶活性。用微板吸光度仪在15分钟内读取光密度(OD)值。因此，Rubisco活性可以通过计算450 nm处吸光度相关方程来量化。

统计分析

对实验数据进行方差分析和多重比较。包括NO在内的个体因素的显著性₂,所以₂和有限公司₂以及它们对脂质、碳水化合物、蛋白质以及Rubisco活性的相互作用，采用方差分析进行鉴定。

微观结构分析

扫描电镜观察样品制备：将收获的新鲜海藻细胞离心，用蒸馏水清洗三次，确保细胞清洁。然后，取足量样品(2ml试管中约1cm高的沉淀物)，分别用15,50和100% (v/v)乙醇离心(每次3分钟)逐渐脱水。用于脱水的乙醇梯度使我们能够显著缩短加工时间。去除部分上清液，剩余部分作为保护层。脱水细胞在残留的100%乙醇中使用涡流振荡1分钟。样品很快被分散到铝箔片上。为了快速蒸发乙醇，将含有细胞的薄片在90°C的烘箱中干燥不到10分钟。然而，干燥样品时间过长会破坏藻类细胞附着在薄片上;干燥的含有细胞的铝箔片被切成直径为2厘米的圆形样品，然后用碳胶带将其安装在显微镜存根上。采用日本日立公司(Hitachi, Tokyo, Japan) S-4800场发射扫描电子，电压0.8 ~ 1.0 kV，电流10.0 μA，对细胞形态进行成像。

TEM观察样品制备：按上述方法采集和制备样品。然后，细胞沉积在2ml试管中，用0.1 mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，得到的样品固定在0.1 mol/LOsO中₄-磷酸盐缓冲液在4℃下浸泡3小时，乙醇浓度增加10%逐渐脱水。然后将样品包埋在环氧树脂中，用超微切片(LKB-NOVA)进行切片。切片用枸橼酸铅染色，在透射电镜下观察(日立7000)。

光生物反应器藻类培养：藻类细胞在250ml的瓶中培养，瓶中含有200ml改良的BG11培养基。烧瓶被放置在25±1°C的轨道激振器上。光强约为72 μmol/m²在连续的冷白色荧光灯下，在烧瓶表面加热/s。过滤含CO的环境空气₂用自制装置(图1)，以得到不同浓度的一氧化碳₂在混合流中(v/v)。所以₂通过将浓硫酸溶液注入Na₂所以_3.粉(图2一个)．SO的曝气时间₂刚开始在烧瓶的出口气体使紫红溶液褪色。SO的流速(气泡/分钟)₂通过调节浓缩SO的注入速度，对燃气发生器出口的温度进行监测₂钠溶液₂所以_3.粉。没有₂在吸瓶中滴入浓缩HNO_3.铜粉溶液(图2 b)．记录在NO出口气体颜色变为棕色时的充气时间₂使pH试纸变红。在烧瓶中的培养溶液中加入CO₂-空气混合气体以一定的气体流速(0.25 vvm)连续流动。除此之外,所以₂也没有₂发电机产生的气体在一定流速下通过硅胶转移到藻类溶液中，剩余的废气在需要时被氢氧化钠溶液吸收。每天从烧瓶中采样适量的藻类溶液，以确定藻类的生长情况，并通过细胞计数来监测。用pH计(pH - 3c)直接测定培养液的pH值。培养结束后，采集藻类样品进行生化分析和微观结构分析。

SO的数量及相关计算₂也没有₂气泡:气泡形式的气体

所以的₂也没有₂可由自安装装置生产(图2)．没有₂发电机的设计如下图2 b化学反应方程:Cu HNO Cu NO H O 3 3 2 2 2•4•()•2••2

本实验对产生纯NO具有较高的灵敏度₂通过气体的棕色变化可以很容易地判断反应的开始。所以₂发电机的设计如下图2一个和化学反应方程:Na SO H SO Na SO SO H O_{2 3 2 4 2 4 2 2}•4•()•2••2

SO的量₂也没有₂是由NO₂所以₂溶解于培养液中。气体的速率被控制为每秒一个气泡。为了了解气泡的确切质量，应按照以下步骤测量气泡的体积。首先用注射器准确吸入5ml空气，将针头浸入水中，然后小心地推动注射器活塞。其次，计算在水中形成的气泡，直到注入的空气完全排干。第三，对气泡的平均体积进行三次以上的处理。以大气(101.325 × 103 Pa)和温度(298 K)为条件，根据理想气体方程，计算出SO的每个气泡质量₂分别为0.22 mg和0.159 mg₂．

结果与讨论

不同浓度CO对藻类的培养₂-空气混合气体(v/v)

它可以从图3一， 5% (v/v) CO对藻类生长的影响₂-空气混合气体在初始细胞密度(4 × 106/ml)下不适应，迅速达到稳定生长状态，即5% CO₂-空气混合气体对藻类生长的抑制作用不大。而在另外两种生长条件(10%和15%)下，藻类在进入快速生长状态前有3天的适应期。最后，三种培养条件下一周内细胞密度分别达到11.8 (106/ml)、26.72 (106/ml)、28.25 (106/ml)。观察了3种栽培条件下pH值的变化图3 b．5% CO培养液的pH值₂-空气混合气体在整个生长过程中一直在增加。特别是pH值在3天后出现跳跃式上升，这反映了CO的供应₂不足以使藻类快速生长，从而导致CO的溶解减少₂在文化中。但在10%和15% CO浓度下，pH值明显下降₂-空气混合气体，然后反弹到pH 7.0以上。pH值的变化与藻类的生长趋势一致，说明两者的初始生长均受到高浓度CO的抑制₂混合气体，导致CO含量丰富₂在培养基中溶解形成离子H+。当藻类克服抑制作用，开始强劲生长时，CO溶解₂被藻类同化，导致培养基pH值明显升高。

CO对藻类的培养₂-空气,有限公司₂空气的密度大,所以₂、有限公司₂-air-NO₂混合气体(v/v)

为了研究微量气体含量对藻类生长的影响，研究了微量气体含量对藻类生长的影响₂也没有₂采用气泡注入实验(第2.6节)进行控制。没有₂所以₂注射20个泡(20 × 0.22 mg=4.4 mg)和1个泡(1 × 0.159 mg=0.159 mg)，每天1次(过量SO₂也没有₂在预实验中导致藻类死亡)，在10% CO的连续培养中，每秒产生一个气泡的速率为₂-空气混合气体。我们可以从图4一为10% CO生长的藻类₂-air-NO₂和10% CO₂空气的密度大,所以₂与10% CO相比，混合气体的生长抑制更为明显₂-前五天播出。前两种混合气体的指数生长期较长，直到第9天。然而，在后一种混合气体中，哪一种是在一周内完成的。ph值在第4和第5天也有小幅下降，之后达到最大值(图4 b)．NO的浓度_3.-在用适量NO培养时迅速反弹₂第五天加油。这将被解释为NO₂溶解在介质中，并参与化学反应产生一些NO_3.-在水溶液中。3. no•h o•2no••no•2

一种假设是:首先，藻类吸收了NO_3.-在头四天中。经过一段时间的NO₂曝气时，NO的量增加_3.在培养基中NO的含量超过藻类的要求，导致NO的浓度反弹_3.-第5天，NO的浓度_3.的数量急剧下降，因为藻类细胞的数量翻了一番。另一种解释可能随之而来。在初始阶段，藻类吸收了NO_3.在培养基的前四天以及NO产生的NO₂与H反应₂介质的O。经过一段时间的NO₂适应，藻类更喜欢利用NO而不是留下NO_3.在介质中引起NO浓度的反弹_3.-第5天，NO_3.-当藻类细胞数量翻倍时，其数量也会增加。第二种解释由Nagase等人得出(图5) [19］．

CO对Rubisco酶活性的影响₂-空气,有限公司₂所以₂、有限公司₂-不₂混合气体

柱状图(图6)表明，10% CO培养的藻类₂空气的密度大,所以₂混合气体和10% CO₂-air-NO₂第9天时混合气体的细胞内rubisco活性高于仅含10% co的₂-空气混合气体，这意味着藻类有更强的CO₂培养一段时间后用微量气体进行固定。此外，结果与成分分析和微观结构分析一致(章节3.4,3.5)。因此，中等浓度的SO₂也没有₂气体可能产生CO₂藻类固定。

复合材料分析

它是从图7藻类生长时含有10%的CO₂-空气混合气体中碳水化合物含量最高，其次为15%和5% CO₂-空气混合气体。但5% CO培养的藻类的脂质含量₂-空气混合气略有增加，这是由于pH升高到8.5，抑制了藻类的生长，导致脂质积聚。10%和15% CO₂均有利于藻类的生长(图3一)．此外，10% CO₂是碳水化合物和蛋白质积累的较好选择。它以柱状图(图7 b)那不₂所以₂有助于培养一段时间后脂肪和碳水化合物的积累。

微观结构分析

扫描电镜图像(图8)在含10% CO的环境中生长的藻类₂-空气(a1, a2)， 10% CO₂空气的密度大,所以₂(b1, b2) 10% CO₂-air-NO₂(c1, c2)混合气体在图8．与a2相比，b2和c2的藻细胞表面更加光滑细腻，b1和c1的藻细胞形态更加饱满圆润，这说明为了适应新环境，藻壁被诱导变得更厚、更致密。例如:低pH和SO引起的影响₂,没有₂与a1、b1和c1图像相比，b1和c1两幅图像中藻类细胞的大小略大于a1图像。在10% CO培养的细胞中，发现类芘的图像₂-空气混合气体在TEM图像中几乎消失(图9)，但在10% CO培养的藻类细胞中，类芘的图像₂空气的密度大,所以₂和10% CO₂-air-NO₂在B1、B2和C1、C2的TEM图像中仍能分辨出混合气。上述现象可能解释了类芘是存在于植物叶绿体中的亚细胞微区室小球藻与碳浓缩机制(CCM)的运行有关。高浓度CO₂环境可以满足藻类生长的要求，不需要依赖CCM提供更多的CO₂二磷酸核酮糖羧化酶。因此，在高浓度CO条件下，类芘体消失，类囊体疏松₂［20.-22］．因此，图A1和图A2符合上述结论的结果。而在B1、B2、C1、C2中出现较为清晰的类芘，可能是NO导致培养基pH急剧下降的原因₂所以₂也减少了水中CO₂这将导致CCM获得足够的CO₂来自酸性介质。此外，还含有丰富的淀粉颗粒和脂质体

从图像C1中可以观察到细胞中类囊体变得更加密集和有序。

结论

过度的不₂所以₂可以抑制藻类的生长，这是由Tatsan等人的工作所见证的。[23)，他报告说聚球藻属sp.和小球藻sp不能忍受较高的NO暴露₂所以₂除非在培养基中加入三acontanol和碳酸氢钠。NO引起培养基pH迅速下降₂所以₂是不可避免的，因为补充过量。蒋等。[24报告说美国dimorphus能忍受高浓度的一氧化碳吗₂通过添加CaCO, NO_3.配合间歇保留法将pH调至7.0左右。在这项工作中，我们发现适度NO₂所以₂present对CO有正向影响₂海藻适应酸性气体环境后的封存过程。这是因为藻类在适应酸性环境的第3天pH值反弹到7.5左右，整个过程可以自行调整pH值，无需考虑其他培养优化。此外，适量NO₂所以₂有助于能量物质的积累。因此，如果低暴露水平的NO₂所以₂在此过程中被准确控制，藻类能够耐受NO₂所以₂开始时，开始快速生长，后来的NO水平更高₂所以₂可以认为是利用工业烟气作为能源材料的潜在特性。

确认

本项目由中央高校基本科研业务费项目(2013QNA13)资助，煤基CO重点实验室科研基金资助₂捕获与地质封存江苏(中国矿业大学)(2015B01)。

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