有效的隔离和功能分析自发乳酸链球菌Bacteriophage-Insensitive突变体

文摘

bacteriophage-resistant菌株具有令人满意的技术属性的使用对防止工业噬菌体感染至关重要发酵流程。在这里,我们描述了一个改进的方法隔离自发乳酸链球菌bacteriophage-insensitive突变体(智能化)。的浓度大量美国酸奶次生文化,亚文化在浓度高的脱脂牛奶噬菌体牛奶,他们接种的快速酸化表型在多个通道获得突变体的概率增加的关键,提高分离效率和维护技术性能。我们获得了大量的智能化系统在每一轮的筛选,分离效率超过85%。我们分析了九智能化系统,这些都是类似于他们的亲本菌株s .酸奶相约脱水收缩作用,持水量和表观粘度。对亲本菌株相比,7的9变种具有等价的酸化活动,剩下的两个变量具有出色的酸化性能。一个或两个新的逆电流器相应噬菌体被发现在所有九智能化系统,证明CRISPR / Cas系统负责美国酸奶的噬菌体抗性。

关键字

乳酸链球菌;噬菌体-不敏感突变体;有效隔离;技术性能;CRISPR

介绍

乳酸链球菌是一个重要的启动压力,广泛用于乳制品行业生产的发酵食品,如酸奶和各种各样的奶酪1]。尽管生产技术进步和严格的操作程序,实现的感染美国酸奶与噬菌体继续导致失败或延迟的乳制品发酵过程(2,3]。因此,研究噬菌体感染的策略美国酸奶可以最小化正在进行。目前,使用bacteriophage-resistant起动菌株具有令人满意的技术特性的主要方法是避免噬菌体感染(4- - - - - -6]。

的隔离bacteriophage-insensitive突变体(智能化)及其随后的使用在工业过程是具有挑战性的问题7,8]。自发突变微生物的利率通常很低(大约10−8 - 10−9),bacteriophage-resistant毒株的变异率是更低(9,10]。由于这些变异率低,获取和筛选建筑智能化是费力的过程。传统方法用于隔离智能化系统包括双层琼脂和二级培养法,获得一个真正的女子是件费时费力的苦事。

有四个主要的噬菌体防御机制:抑制噬菌体吸附,抑制DNA噬菌体注入,restriction-modification(-)系统,和流产感染系统(2,11]。然而,根据以前的作品,他们发现几例美国酸奶压力(12]。长期以来一直认为,收购抗噬菌体可以归因于非特异性基因点突变编码细胞受体网站(13]。最近,Barrangou et al。14)发现并描述经常聚集空间短回文的重复序列(CRISPR)和建议CRISPR-associated (Cas)系统与获得抵抗噬菌体。

这里,我们开发了一种高效方法,自发的隔离美国酸奶智能化系统,发现在发酵过程中他们的表现没有不利影响。此外,我们分析了这些智能化系统的技术性能和耐药机制。

材料和方法

噬菌体的细菌培养和传播

美国酸奶死神是孤立于商业增值税直接设置酸奶起动器(丹尼斯克公司,哥本哈根,丹麦)和三种不同的噬菌体,Φ101,Φ102,Φ108以前确认为其毒性噬菌体(15]。死神的美国酸奶总是培养在M17肉汤42°C (Oxoid,英国贝辛斯托克),补充0.5% (w / w)乳糖(LM17汤)。传播噬菌体,美国酸奶在LM17肉汤培养与10毫米CaCl补充₂(LM17-Ca)和噬菌体在细菌生长对数期,直到文化变得明朗。准备的噬菌体溶菌产物是通过过滤器孔径为0.45μm(美国微孔,Billerica的),并受双层斑块滴定法,如前面描述的(16]。

隔离和智能化系统的验证

bacteriophage-sensitive拉伤St1of美国酸奶培养了大量的LM17-Ca 42°C到对数生长期。适当的毒性噬菌体被添加到文化的多重性感染(MOI) 2。大多数的美国酸奶细胞被认为是细胞溶解一旦文化出现清晰;然而,他们进一步孵化24小时42°C。所有的次要文化离心机(9000×g 5分钟4°C),和细胞颗粒resuspended在10毫升无菌12% (w / w)重组脱脂牛奶(RSM)包含高滴度的噬菌体的空斑形成单位(108 /毫升)。样本在42°C的环境,直到牛奶凝固。

凝固的牛奶样本使用的最终浓度为5% (v / v)接种10管,每个都包含20毫升的RSM包含适当的噬菌体的空斑形成单位(108 /毫升)。样本孵化12 h 42°C。10管的发酵牛奶,pH值最低的样品被用来进一步接种10管20毫升RSM含有噬菌体的空斑形成单位(108 /毫升)。子培养持续3 - 5个段落。最后一段后,第一个凝固的牛奶样品,或pH值最低的牛奶样品,连续稀释,飞跑到LM17琼脂板。个别殖民地捡起和被证实的美国酸奶由primer-specific菌株聚合酶链反应(PCR) (17]。我们验证这些隔离的噬菌体抗性使用抑制酸生产测试在脱脂牛奶,和浊度测试在LM17汤(15),浓度高的噬菌体(108空斑形成单位/毫升)使用。

只有一个验证BIM在一轮筛选随机选择。智能化系统获得了第一,第二,第三轮的筛选与噬菌体Φ101Φ102,和Φ108指定BIM1-1, BIM1-2, BIM1-3, BIM2-1, BIM2-2, BIM2 - 3, BIM8-1, BIM8-2和BIM8-3分别。对于这些九建筑智能化,我们分析了稳定的噬菌体抗性,其技术性能,其抗力移转噬菌体Φ101,Φ102,Φ108,其耐药机制。

抗菌素耐药性的稳定性

稳定的噬菌体抗性九智能化系统是由培养这些突变体在LM17-Ca肉汤20代,与升压剂对应的噬菌体(10⁹空斑形成单位/毫升)添加在每个通道。斑块化验和浊度测试是重复以确保噬菌体抗性表型的维持。

孤立的智能化系统的技术性能

我们分析了美国酸奶死神和九智能化系统对他们的发酵能力,容易脱水收缩作用(STS),持水能力(通车),表观粘度性能和抗力移转到其他噬菌体。我们消毒12% (w / w) RSM在110°C,持续15分钟。一旦RSM样品冷却到42°C,他们接种美国酸奶死神或者一个智能化的5×10的浓度⁶CFU /毫升。样品的pH值是确定酸碱计420(美国马热猎户座、贝弗利)接种后12小时。样本的pH值也监控使用Cinac系统(联盟仪器、Mery-Sur-Oise、法国),每5分钟自动记录pH值超过24小时而发酵。发酵终止一次样品的pH值为4.5。发酵的牛奶样本搅拌(500 rpm, 5分钟)使用机械搅拌器(RW20;德国IKA, Staufenim),然后储存在4°C 24 h。

发酵的牛奶样品的表观粘度测定在20°C使用R180粘度计(proRheo Althengstett,德国)与2号轴在64 rpm。STS和决心如前所述通车18]。STS结果计算使用公式:

STS (%) = V1 / V2×100

在V1的体积乳清收集后排水和V2是发酵的牛奶样品的体积。通车是使用以下公式计算:

通车(%)= (1−W1 / W2)×100

W1后质量的乳清在哪里离心分离和W2总发酵牛奶质量。

抗菌素耐药性的机制

溶原性和吸附率测定的九个智能化系统(如前所述)(19]。的存在-机制研究等副总裁的方法比内蒂。20.]。基因组序列对应CRISPR阵列进行了九个建筑智能化和父母美国酸奶死神的压力。总DNA是获得使用phenolchloroform提取过程21]。获得的DNA被量化电泳0.8% (w / v)琼脂糖凝胶(擤鼻涕,巴塞罗那,西班牙)。基因组序列对应于三个CRISPR位点被使用引物PCR对CR1放大——向前(5′tgc TGA广汽AAC CTA GTC TCT颈- 3′)和CR1-Reverse (5′TAA ACA呕吐有条件现金援助CCC答CC-3′), CR2-Forward (5′-TTA GCC有条件现金援助ACC ATA GTG CTG-3′)和CR2-Reverse (5′- TTA GTC TAA CAC TTT玻纤棉酚GC-3′),或CR3-Forward (5′- CTG AGA TTA ATA GTG CGA TTA CG-3′)和CR3-Reverse (5′gct GGA TCG答答AAC ATG TC-3′),概述Horvath)等。22]。反应进行总量的50μL用pfu聚合酶(Transgen有限公司、北京、中国)。纯化扩增子是一个ω周期——纯工具包(美国GAωbio-tek, Norcross),和桑格进行DNA测序。

南部印迹分析

我们获得biotin-labeled单链寡核苷酸根据新的间隔序列探针合成生命科技有限公司、上海、中国)。我们使用南部印迹分析噬菌体的基因组DNA根据标准协议(23]。噬菌体基因组DNA提取的过程Zinno et al。3]。绑定使用化学发光探针检测Biotin-labeled核酸检测设备(Beyotime、上海、中国)。

统计分析

所有实验一式三份,结果被表示为平均值±标准偏差(SD)。数据进行方差分析使用Statistica 9.2 (Stat柔软,Inc .,塔尔萨,美国)。比较方法是使用图基的显著差异进行测试,在假定值小于0.05被认为是具有统计学意义。

结果

隔离的智能化系统

我们培养美国酸奶相约在一个1 LΦ101体积,Φ102或Φ108噬菌体。中等文化离心机将任何可能呈现智能化系统,进一步浓缩。我们获得了大量的智能化系统在每一轮的筛选和确认隔离效率大于85%。随着通道数量的增加,分离效率相应提高(表1)。之后的五个段落筛查和丰富的适当的噬菌体,100个独立殖民地从LM17琼脂板几乎是智能化系统随机选择。

表1:智能化系统获得美国酸奶某菌株与其特定的噬菌体n_P假定、智能化系统隔离;n_R,证实了智能化系统隔离;隔离是n效率_R/ n_P×100%。

噬菌体抗性稳定和抗力移转

抗噬菌体是高度稳定的九个智能化系统调查。智能化系统的所有衍生品保持bacteriophage-resistant表型超过20代(数据未显示)。

抑制酸生产测试和浊度测试显示所有建筑智能化cross-resistant在这项研究中使用的其他各种噬菌体。即BIM1-1 BIM1-2, BIM1-3对噬菌体Φ102噬菌体Φ108,虽然BIM2-1, BIM2 - 2, BIM2-3对噬菌体Φ101Φ108。此外,BIM8-1 BIM8-2, BIM8-3对噬菌体Φ101Φ102。

智能化系统的技术性能

代表酸化曲线为美国酸奶死神和智能化系统确定的三组(图1)。我们确定的九个建筑智能化,七展出酸化活动类似于亲本菌株,与大多数的智能化系统拥有一些酸化活动。BIM3-3酸化曲线和BIM8-3最初4 h发酵是很相似的美国酸奶相约在同一时期。然而,这两个建筑智能化的酸化率从4 - 24小时的发酵更迅速比美国酸奶相约(图1)。突变体BIM3-3和BIM8-3也表现出显著(P < 0.05)降低pH值美国酸奶相约在12 h(表2)。

表2:技术性能美国酸奶St1and智能化STS,易脱水收缩作用;通车,水容量。pH值在12 h。所有测量值的均值±SD三个复制。不同在同一列上标字母表示显著性差异P < 0.05。

所有九个智能化系统和美国酸奶相约展出STS的值50%,通车值约为16%。脱水收缩作用和广阔没有显著差异(P > 0.05)美国酸奶死神和九智能化系统(表2)。九个智能化系统也相似粘度美国酸奶相约。十成熟的发酵牛奶样品的表观粘度从0.237到0.248不等(表2);不同粘度的BIM菌株和家长压力未达到统计上的显著水平(P > 0.05)。

噬菌体抗性机制的分析

九个智能化系统孤立的文化美国酸奶死神并没有噬菌体能够感染亲本菌株的肉汤培养上清液(表3)。这一发现表明,抵抗表型没有与溶原性。明显抑制噬菌体吸附在不被察觉的情况下对这些变异,作为他们的意思是吸附率大于94.5%。没有明显差异(P > 0.05)的吸附率建筑智能化与亲本菌株之间(表3)。因此,很明显,抑制噬菌体吸附不是噬菌体抗性机制受雇于我们孤立的智能化系统。我们测试了所有为- 9建筑智能化系统,发现所有的变异没有形成明显的斑块的能力时特定的噬菌体感染的莫伊2(表3)。因此,沉默-机制很可能缺席美国酸奶相约。

表3:Bacteriophage-resistance机制分析美国酸奶智能化系统“-”代表没有检测到。所有值的三个复制±SD。不同在同一列上标字母表示显著性差异P < 0.05。

我们发现10个新CRISPR间隔序列的九个智能化系统(表4),所有这些属于CRISPR1轨迹。与其他研究结果表明CRISPR1是最活跃的轨迹对集成新的逆电流器(22,24]。10个新的逆电流器显示相同报道美国酸奶噬菌体基因组(表4)。我们南方印迹结果表明,额外的间隔序列来自特定的噬菌体(图2)。这些结果说明,新间隔收购CRISPR / ca系统,随后导致了bacteriophage-resistant这些菌株的表型。这些结果与以前的研究涉及相对应美国酸奶(14,24,25]。

表4:分析新CRISPR间距器美国酸奶智能化系统

讨论

食品级基因工程的发展微生物bacteriophage-resistant仍然在工业生产在某些地区有争议的中国和欧洲等26]。然而,智能化系统由自发突变可以解决各种问题的政府和食品生产行业使用。

有一些缺点传统技术用于智能化系统的隔离。包括智能化系统的低产量、分离效率低、智能化系统的技术性能,最终减少孤立。等副总裁作为一个例子,比内蒂。7]报道低nR(0-26)和隔离效率低(22.6%)为真正的智能化系统获得敏感的菌株美国酸奶。

我们开发了一个用于生成智能化系统的有效方法美国酸奶随着工业开始。我们的技术提供了许多优点与目前用于BIM隔离。在我们的方法中,大量的美国酸奶文化被离心收集和集中。一般来说,的浓度美国酸奶在指数期的增长大约是10⁸CFU /毫升。bacteriophage-resistant突变体的自发突变率低可下,然后,从理论上讲,1 BIM应该产生1毫升美国酸奶二次文化。然而,如果文化卷0.1 - 1.0毫升用于传统的双层琼脂和二级培养法,它不太可能,一个女子可以获得10个重复。因此,它是必要的,大量的细胞用于突变体的自然发生的概率大大增加成功获得突变体。

此外,建筑智能化是筛查和浓缩在发酵过程中,使用高滴度的噬菌体和多个段落。连续子培养在存在噬菌体排除假阳性变异效价高,而真正的智能化系统逐渐成为主导文化的压力,显著提高分离效率的方法。

许多先前的研究结果表明,只有少数变异表现出良好的技术性能可以作为改善起动菌株工业过程(6,7]。主要的挑战在于保持或改善自发的智能化系统的技术性能。在目前的研究中,pH值最低的牛奶样品被选为连续的亚文化屏幕上的变异最大的酸化能力和耐酸性。胞外负责酸奶中的蛋白质的丝状关系矩阵组织(27]。技术性能,如脱水收缩作用、广阔、胞外多糖和表观粘度,与生产。我们用来确定噬菌体抗性筛选方法主要集中在自然选择;因此,这是不足为奇的智能化系统表现出最小差异在STS,通车,表观粘度相比那些父母的压力。我们观察到九智能化系统孤立保留亲代菌株的基本性质,表明他们是适用于工业应用。

很少有报道抗菌素耐药性的机制美国酸奶初学者来说,这个物种的细菌被认为是有限的天然噬菌体防御机制(28]。一些研究人员表示,耐溶原性是常见的在lactococci和乳酸杆菌,但并不常见美国酸奶(6,28]。我们评估可能的机制负责bacteriophage-resistant表型的智能化系统。我们的研究结果证实了这些以前公布的结果(6,28]。我们观察到溶原性和bacteriophage-resistant表现型之间无显著相关性。吸附试验,我们发现噬菌体粒子的吸附率为所有智能化系统是正常的,这表明噬菌体吸附bacteriophage-resistant菌株的细胞不受影响。-系统强大的防御机制,主要是发现的质粒一些lactococci [13]。一些噬菌体抗性机制已报告美国酸奶(20.]。人们认为美国酸奶可能缺乏-系统。

它已被证明美国酸奶可以将小说间距器集成到其CRISPR位点在回答噬菌体攻击(14,25]。我们发现1 - 2新间隔器在每个我们孤立的建筑智能化;这些间隔从相应的噬菌体用于诱导这些智能化系统。我们的研究结果表明,CRISPR / Cas系统美国酸奶可能负责抗菌素耐药性的机制。限制消化模式和结构蛋白分析表明,噬菌体Φ101Φ102,Φ108互相显著不同(15]。然而,我们所进行的分析表明,所有九个建筑智能化cross-resistant三个噬菌体。它是可能的,这些噬菌体同源和一些间隔序列同时出现在三个噬菌体。作为一个例子,S2 proto-spacer被确认为一个额外的新垫片BIM1-1, BIM1-2, BIM2-1(表4)。这proto-spacer也展示在噬菌体Φ101和Φ102(图2)。

美国酸奶在发酵过程中容易受到感染的噬菌体,可以严重影响发酵乳制品的生产和质量。自发的高效隔离美国酸奶phage-insensitive突变体用适当的技术性能将是一个有效的方法克服这种种噬菌体感染的易感性。然而,通过单一的噬菌体具有进化的能力核苷酸多态性,导致细菌噬菌体的规避防御机制(11]。Bondy-Denomy et al。29日)发现phage-encoded anti-CRISPR基因可能逃避CRISPR系统,允许对噬菌体入侵宿主。智能化系统的高效筛选在改善我们的理解是至关重要的噬菌体与宿主共同进化的。

结论

自发突变的速度产生耐药性的噬菌体非常低微生物。尽管这个障碍,我们研发了一种改进了的方法,生成的概率增加真正的自发的智能化系统。我们成功获得真正的智能化系统在每一轮的筛选,并演示了隔离效率超过85%。一般来说,我们孤立运行的智能化与父母相似的方式美国酸奶应变对技术性能、参数估计,如STS,通车,表观粘度。综上所述,我们的结果表明,我们设计的修改二级培养法是有效的BIM生成和筛选。我们的分析授予噬菌体抗性的机制表明,CRISPR / Cas系统而不是溶原性,吸附干扰,或-类型系统很可能负责赋予其抵抗噬菌体美国酸奶。

确认

这项工作是支持中国的国家关键技术项目在第12个五年计划期间(2013 bad18b01)。

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