诱变与基因工程相结合的培氏链霉菌单步发酵生产表阿霉素

摘要

表柔比星是一种具有重要临床意义的蒽环类抗肿瘤药物，其工业化生产过程是一个繁琐的化学半合成过程。在这里，我们通过菌株突变和代谢工程的组合策略，开发了一种高效的表柔比星生物合成的工程链霉菌。首先，通过阿霉素耐药筛选方法培养出阿霉素过剩菌S. peucetius SIPI-DU-1557，并作为宿主菌株进行基因改造。其次，通过比较各种外源tdp -4-酮还原酶的蛋白序列发现，来自拟Amycolatopsis orientalis的EvaE显著增加表柔比星的产量。随后，采用代谢工程策略，通过共表达关键生物合成途径基因dnrS/dnrQ和desIII/desIV来增强表阿霉素的代谢通量，从而提高表阿霉素的产量。表柔比星在烧瓶和5 L发酵罐中的最终浓度分别为270 mg/L和252 mg/L。这是报道的最高水平，表明经过工程改造的peucetius在利用可再生资源直接发酵生产绿色表柔比星方面具有潜在的工业应用。

关键字

链霉菌属peucetius表柔比星，代谢工程，限速基因

简介

表阿柔比星和阿柔比星是蒽环类抗肿瘤抗生素，广泛用作治疗各种癌症的化疗药物[1，2］．表柔比星由于其较低的心脏毒性而在临床应用中得到更广泛的应用，这是由于daunoamine的C-4羟基的构型差异[2］．目前，表柔比星的工业化生产涉及以天然柔比星为原料进行化学半合成，过程繁琐，产量低，生产成本高[3.，4］．因此，表柔比星价格昂贵(约15万美元/公斤)。相比之下，微生物生产工艺可以使用低成本和可再生资源，如淀粉或葡萄糖，是满足日益增长的市场需求的更可持续的替代方案。因此，开发一种具有成本效益和绿色生产表柔比星的直接生物合成工艺具有商业价值。

新兴的合成生物学技术提供了独特的机会，通过利用生物合成酶和途径的信息来创造天然产品类似物[5，6］．阿霉素及其前体柔红霉素的生物合成途径链霉菌属peucetius特征为[7］．如图1，该途径的第一阶段是由dpsABCDGEFY基因编码的Ⅱ型聚酮合成酶(PKS)生物合成ε-rhodomycinone (RHO) [8］．RHO与dnmLMUTJV基因合成的脱氧糖TDP-daunosamine连接形成rhodomycin D [9-11]，然后经过后期修饰(甲基化、脱羧和羟基化)，通过柔红霉素形成阿霉素[12，13］．

得到表柔比星及其前体4 ' -表柔比星美国peucetius，哈钦森[14]通过将aveBIV引入dnmv阻断的阿霉素产生体突变体，构建了一个工程菌株，美国peucetius写明ATCC 29050。aveBIV基因是阿威链霉菌阿维菌素生物合成基因之一，与夹竹桃C-4酮还原有关，与TDP-daunosamine生物合成中dnmV调控酮还原的立体选择性相反[15］．但转基因菌株的表柔比星产量仅为9.7 mg/L，且仅有微量表柔比星，不具备工业化应用潜力。最近，通过对柔红霉素产生菌株链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的基因工程获得了一株4 ' -外柔红霉素产生菌株，但发酵液中仅检出少量的4 ' -外柔红霉素[16］．据我们所知，没有进一步的关于代谢工程合成表柔比星的报道。

为了通过直接发酵有效合成表柔比星，应用具有过剩生产特性的宿主菌株是一个新兴趋势[5，17］．经基因改良的工业高产菌株，如红糖多孢菌和阿维菌酵母，可产生红霉素和阿维菌素类似物，其数量远高于野生型菌株[18-20.］．的美国peucetiusATCC 29050菌株仅产生9 mg/L的阿霉素[13]，这就解释了基因改造后表柔比星产量低的原因。因此，阿霉素生产过剩的菌株应该是构建表阿霉素生产菌株的更合适的宿主。其次，为了最大化表柔比星的生物合成潜力，采用代谢工程策略增强生物合成途径关键酶的表达，将代谢通量推向表柔比星。在本研究中，我们试图从过量生产阿霉素的菌株中构建一个高表阿霉素产量的重组菌株美国peucetius菌株突变与代谢工程相结合。

材料与方法

菌株、质粒和培养条件

本研究中使用的菌株和质粒列于表1．美国peucetius将其衍生物在28°C的液体Tryptic Soy Broth (TSB)培养基中培养，用于菌丝体制备和总DNA分离。以大肠杆菌DH5α为亚克隆宿主构建质粒。用大肠杆菌ET12567/pUZ8002进行偶联转移美国peucetius．大肠杆菌菌株在37°C的溶菌发生肉汤(LB)中培养。必要时添加抗生素(25 μg/mL氯霉素、25 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL阿普霉素、50 μg/mL萘啶酸)。

表1:本研究中使用的菌株和质粒

向量构造

大肠杆菌DNA的分离和操作链霉菌属peucetius采用标准方法[23］．用于构建质粒和菌株的引物见表2．敲除dnmV (GenBank登录号AF006633)美国peucetius，扩增出一段3.5kb的dnmV突变DNA片段，其中终止密码子TAG是在dnmV起始密码子下游252bp处通过核苷酸置换产生的美国peucetius通过重叠扩增PCR检测SIPI-DU-1557基因组DNA，引物为dauv - hindi - f, dnmV-252-R和dnmV-252-F, daum - xbair。利用pSET152- xbai - f和pSET152- hindi - r引物从pSET152质粒中扩增出3.1 kb DNA片段。3.5 kb和3.1 kb DNA片段用XbaI/HindIII酶切后连接生成dnmV敲除质粒pΔdnmV

表2:本研究中使用的引物。

表达aveBIV (GenBank登录号AB032523)美国peucetius，利用ave-NdeI-F和ave-BamHI-R引物扩增出含有aveBIV完整序列的1 kb DNA片段，并克隆到pET-22b(+)载体中，得到pave-22b。将含有PermE*启动子和核糖体结合位点(RBS)的0.4 kb合成DNA片段插入pave-22b的XbaI/NdeI位点，得到pPerm-ave-22b。将包含PermE*、RBS和aveBIV的1.4 kb XbaI/BamHI片段插入pSET152载体的相应位点，得到pAveB。

表达evaE (GenBank登录号AJ223998)美国peucetius，利用evaE -NdeI- f和evaE -BamHI- r引物从orientalis NRRL 18099的基因组DNA中扩增出包含evaE完整基因序列的1 kb DNA片段，并将其插入到pAveB的NdeI/BamHI中获得pEvaE。

与evaE一起过表达dnrS/dnrQ (GenBank登录号L47164)美国peucetius， PCR扩增出含有完整dnrS/dnrQ基因序列的1.2 kb DNA片段美国peucetius采用dnrS/dnrQ-EvaE-F和dnrS/dnrQ-BamHI-R引物克隆到pEvaE的BamHI位点，采用无缝连接法(ClonExpress®II One Step Cloning kit)克隆得到pEQS。

为了表达desIII/desIV (GenBank登录号:AF079762)， dnrS/dnrQ与evaE在美国peucetius利用desIII/IV-dnrS/Q-F和desIII/IV-EcoRV-R引物从委内瑞拉链霉基因组DNA中扩增出包含desIII和desIV完整序列的2 kb DNA片段，并克隆到pEQS的EcoRV位点，得到pEQSd。

表柔比星生产菌株的构建

为了构建dnmv破坏株，将pΔdnmV引入美国peucetiusSIPI-DU-1557在MS介质上28°C偶联18-20 h [24］．用1 mL 50 μg/mL阿普霉素和50 μg/mL萘啶酸覆盖培养基，28℃孵育7 d。首先筛选出耐阿霉素的膨出剂，在不含阿霉素的TSB培养基中传代培养，得到对阿霉素敏感的菌株。

将pAveB、pEvaE、pEQS和pEQSd分别导入dnmV-disrupted中，构建表柔比星生产菌株美国peucetiusΔdnmV通过偶联，筛选出耐apramycin菌株。

发酵的美国peucetius

美国peucetius重组菌株在固体培养基(麦芽糊精20 g/L、酵母浸膏15 g/L、酶解酪蛋白5 g/L、葡萄糖4 g/L、大豆蛋白胨2.5 g/L、KH₂阿宝₄1.5 g/L，碳酸钙_3.2 g/L，琼脂20 g/L, pH 7.0)在28°C下放置7天。将菌丝接种到250 mL的瓶中，瓶中含有20ml的种子培养基(玉米淀粉5 g/L葡萄糖5 g/L，大豆粉30 g/L，酵母粉1 g/L, NaCl 1 g/L, KH₂阿宝₄1 g/L, MgSO₄•7 h₂O 1 g/L, pH 7.2)在28°C, 220转转2天。接下来，2.5 mL种子培养物接种到同样的250 mL烧瓶中，其中含有25 mL发酵培养基(麦芽糊精120 g/L，酵母粉30 g/L, NaCl)₂g / L, CaCl₂3 g/L，碳酸钙_3.3 g/L, pH 6.2)， 28°C, 220转，7天。为了在5 L发酵罐中生产表柔比星，菌株在100 mL种子培养基中培养，在28°C下750 mL烧瓶中，在220 rpm的震动培养箱中。40小时后，100 mL种子培养基转移到含有2 L发酵培养基的5 L发酵罐(BIOTECH-5BG-7000A，宝兴生物工程设备有限公司，中国上海)。培养物在28℃条件下生长，通过1 vvm(每体积空气量每分钟)的曝气和不同的搅拌速度使溶解氧水平保持在20%以上。

基因突变与筛选美国peucetius

两毫升菌丝体悬浮液美国peucetius将无菌蒸馏水中的SIPI-D-30转移到无菌板上，在距离紫外灯(波长254 nm，功率30 W) 30 cm处进行紫外线照射2 min。将菌丝悬浮液平撒在含40 ~ 275 mg/L阿霉素的固体培养基上，摇瓶培养，测定阿霉素产量。

HPLC分析方法

为了分析阿霉素和表阿霉素的产量，用无水乙醇提取发酵液，用6 mol/L HCl调节pH至1.5 ~ 1.8，在10000 g下离心5min。上清液采用Agilent C18柱(4.6 × 150 mm;3.5μm)。以流动相A (0.1% TFA)为H₂O)和B (0.1% TFA在乙腈中)和0-5 min的程序，75% a /25% B至70 a /30% B;5-20分钟，70% A/30% B至55% A/45% B;20-23 min, 55% A/45% B至10% A/90% B;23-24 min, 10% A/90% B至75% A/25% B;24-30分钟，75% A/25% B，流速为0.8 mL/min, 254 nm处采用Agilent 1260 HPLC系统进行紫外检测。通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析确认了化合物的性质。

结果与讨论

阿霉素高产菌株的突变与筛选

阿霉素是表阿霉素类似物，因此我们假设阿霉素过量产生菌将是代谢工程表阿霉素产生的理想宿主菌株。许多研究通过基因工程来提高阿霉素的产量，以获得阿霉素过剩生产者[25］．例如，全局调控基因afsR和抗性基因的表达美国peucetius分别导致阿霉素过量生产4倍和5倍[26，27］．同样，过表达结构糖和糖基转移酶基因可使其产量提高5.6倍[28］．然而，在这些研究中，阿霉素滴度仍低于20 mg/L。

通过传统诱变来改善菌株的数据很少。虽然与基因工程相比，其筛选效率较低，但通过适当的筛选方法可以增加获得高产菌株的机会。考虑到阿霉素是一种细胞毒性次生代谢产物，可抑制生产菌株的生长和代谢，可以采用阿霉素耐药筛选方法对突变菌株进行筛选。图2概述了突变和筛选程序。

测定…的电阻美国peucetiusSIPI-D-30对不同浓度的阿霉素(10、20、30、40、50 mg/L)进行电泳。结果表明，SIPI-D-30不能耐受40 mg/L以上的阿霉素浓度。因此，采用40 mg/L的阿霉素培养皿进行紫外光处理筛选耐药突变体。在突变体中，有一种菌株美国peucetiusD-37的阿霉素产量较原菌株(110mg/L)提高110%。菌株D-37不能耐受的阿霉素浓度增加到100 mg/L。因此，要进行筛选美国peucetius对阿霉素耐受性较高的，阿霉素浓度增加，以确保下一次紫外线诱变处理的100%致死率。经过5轮紫外诱变，从含275 mg/L阿霉素的平板培养基中获得突变体SIPI-DU-1557。SIPI-DU-1557突变株的阿霉素产量为535mg /L。与基因工程方法相比，传统的菌株诱变改良方法仍然是一种重要、可靠、经济的方法。

表柔比星产生菌株的基因工程美国peucetiussipi - d - u - 1557

为了构建表柔比星产生菌株，dnmV首先在菌株中失活美国peucetiusSIPI-DU-1557菌株通过插入距离dnmV起始密码子下游252 bp的停止密码子获得美国peucetiusΔdnmV (图3一)．如图3 b， HPLC分析美国peucetiusΔdnmV发酵液显示完全消除阿霉素，并形成中间diate rhodomycionoe作为主要产物，表明dnmV基因被破坏。

将强启动子PermE*控制下的aveBIV基因克隆到质粒pSET152中构建pAveB并导入美国peucetiusΔdnmV通过站点特定的集成美国peucetiusΔdnmV基因组(图3一)．通过对阿霉素抗性的筛选来生成膨出剂美国peucetiusEPI-1。如图3 c,美国peucetius通过HPLC和LC-MS分析，EPI-1产生47 mg/L表红霉素，这与Hutchinson的研究报告的产量相比有了相当大的改善[28]，表明具有高阿霉素产量的宿主菌株是高表阿霉素产量的基础。

虽然美国peucetiusEPI-1产生了相当数量的表柔比星，发酵液中积累了大量的中间RHO (414 mg/L)，而亲本菌株SIPI-D-U-1557中RHO仅为32 mg/L (图3 c)．为了将更多的RHO转化为表柔比星，引入了另一个副本aveBIV美国peucetiusEPI-1，但表柔比星生产率没有显著提高(数据未显示)。

随着基因组测序技术的发展，人们发现了大量次生代谢物生物合成途径的遗传信息[29，30.]，为通过生物信息学分析获得多种tdp -4-酮己糖还原酶提供了新的途径。在此，我们试图寻找除AveBIV之外的新的tdp -4-酮还原酶，以增加tdp -表柔比星池，进一步提高表柔比星的产量。AveBIV蛋白序列被用作Universal protein Resource (UniProt)数据库中blast相似序列的参考。结果获得了200多个蛋白质序列。从与AveBIV序列相似度较高的不同微生物中筛选出5种酶进行进一步研究(图4)．通过对生物合成途径和酶催化产物的详细分析，选择了与AveBIV氨基酸同源的东方Amycolatopsis orientalis中的EvaE。EvaE被认为是一种在氯霉素生物合成途径中催化tdp -6-脱氧糖C-4酮还原的酶[31］．催化产物tdp -外胰氨基与tdp -外胰氨基在化学结构上相似，只是在C3′处不同。tdp -外联氨基在C3 '上有一个甲基，而tdp -外联氨基在同一位置上有一个氢。因此，我们假设EvaE也可以在dnmv突变株中产生TDP-epidaunosamine。

将质粒pEvaE导入美国peucetiusΔdnmV通过共轭产生美国peucetiusEPI-2 (图3一)．表柔比星产量美国peucetiusEPI-2达到170 mg/L，改善2.6倍美国peucetiusEPI-1。同时，RHO产量降至195 mg/L (图3 c)．结果表明，EvaE催化tdp -3-氨基-4-酮-2,6-二脱氧- l -葡萄糖转化为tdp -表柔比星的效率高于AveBIV，细胞间tdp -表柔比星的缺乏是限制表柔比星生物合成的关键因素。

dnrS/dnrQ和desIII/desIV的共表达进一步促进表柔比星的产生

虽然表柔比星的产量在美国peucetiusEPI-2，其前体RHO仍然积累在发酵液中，这表明后续的遗传操作对于提高表柔比星的产量至关重要。宋的研究[27表明tdp - daunoamine的形成和糖基化是阿霉素生物合成的限速步骤。阿霉素生物合成(图1)， DnrS催化TDP-daunosamine糖基化生成RHO，形成rhodomycin D, dnrQ编码糖基化所需的酶[11］．在tdp -豆诺胺生物合成所需的酶美国peucetius，两个基因dnmL和dnmM被认为是前两个步骤所必需的[9］．DnmL和dnmM分别编码葡萄糖- 1-磷酸胸苷基转移酶和tdp -d -葡萄糖4,6-脱水酶。然而，过表达dnmL和dnmM对阿霉素的产生没有影响。委内瑞拉链霉菌中的DesIII和desIV催化与dnmL和dnmM相同的酶促反应，形成共同的中间产物tdp -4-酮-6-脱氧-d -葡萄糖[32］．在desIII/desIV存在或不存在的情况下，dnrS和dnrQ的过表达可显著增加阿霉素的产生。阿霉素和表阿霉素的生物合成途径大多相似，除了最后一步是糖块合成，这启发我们通过同样的策略进一步增强表阿霉素。

我们试图通过过表达dnrS/dnrQ来提高表阿霉素滴度美国peucetiusEPI-2。的美国peucetius将dnrS/dnrQ整合到EPI-3菌株中美国peucetiusEPI-2 (图3一)．表柔比星收率为212 mg/L (图3 c)，增长了3.5倍美国peucetiusEPI-1。然而，在EPI-3发酵过程中RHO的轻微下降可能表明tdpepidaunoamine供应不足。因此，我们引入了包含evaE、dnrS/dnrQ、desIII/desIV的pEQSd美国peucetiusΔdnmV构建重组菌株美国peucetiusEPI-4产生表柔比星273 mg/L，相比增加4.8倍美国peucetiusEPI-1 (图3一而且图3 c)．这一结果表明表柔比星生物合成途径相关基因的共过表达进一步提高了表柔比星的产量，tdp - daunoamine的形成和糖基化也是表柔比星生物合成的限速步骤。但是，当引入额外的dnrS/dnrQ和desIII/desIV副本时美国peucetius由于工程菌株生长不良，EPI-4、表柔比星和RHO产量均急剧下降。

表柔比星在5l发酵罐中的生产

表柔比星的生产美国peucetiusEPI-4菌株在5 L发酵罐中孵育192 h。如图5，总糖在孵育期间持续下降，说明糖是细胞生长维持和表柔比星产生的主要需求。整个期间的稳定pH值是表柔比星生产的一个贡献因素。表柔比星的产量随着包装菌丝体积(PMV)的增加而增加，这表明为了增加PMV并获得更高水平的表柔比星，未来需要优化发酵条件。表柔比星产量在168小时内达到最大值252 mg/L，与在烧瓶中发酵的结果相似。这些结果表明美国peucetiusEPI-4在直接发酵生产表柔比星方面具有潜在的工业应用价值。

结论

这是一个代谢工程美国peucetius菌株被开发为潜在的具有成本效益的表柔比星生产。通过对高表柔比星生产菌株的宿主适应性筛选和表柔比星生物合成途径的代谢工程，实现了高表柔比星产量。EvaE能比aveBIV更有效地催化tdp -3-氨基-4-酮-2,6-二脱氧- l -葡萄糖合成tdp -表柔比星，可用于表柔比星生物合成，并可通过蛋白质工程获得更高的活性。表柔比星生物合成关键基因的共表达提高了表柔比星产量。在烧瓶和5 L发酵罐中，表柔比星的最大滴度分别达到270 mg/L和252 mg/L，这是基因工程中报道的最高产量美国peucetius到目前为止。

确认

国家重大新药开发科技专项(2014ZX09201001-005-001)资助。

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