加强生产和描述商业上重要的耐热性的淀粉分解的酶

Sarita沙玛¹Rachana Bhatt)²

Mastera年代学生,微生物学,Patel先生一个N研究生学院Sardar帕特尔大学、印度阿南德
微生物学系助理教授,先生一个N Patel研究生学院Sardar帕特尔大学、印度阿南德

文摘

在目前的研究中,不同土壤样本进行分析,以找到一个强有力的淀粉酶生产国。我们发现自然土壤隔离,命名为假单胞菌sp。B5 -革兰氏阴性短杆,使最大淀粉酶生产(12.79μmole / ml / min)在生产中含3%可溶性淀粉在孵化24小时在150 rpm。进一步描述部分纯化淀粉酶证明它是一种酶的分子量55370 KDa 1.8μmole公里和0.019 U /分钟Vmax。酶显示pH值5与活动的最适条件在广泛的温度范围从30 oC - 100摄氏度。淀粉酶是稳定在100 oC 35分钟。几个抑制剂和金属离子对淀粉酶活性的影响也被检查。EDTA被证明是有害的淀粉酶作为金属离子的存在即Ca + 2和铁+ 3显示的淀粉酶的活性增加。

我的介绍。

淀粉酶是最重要的酶和生物技术具有重要意义,构成一类工业酶酶有大约25%的世界市场。阿尔法(4-D-glucan glucanohydrolase E.C.3.2.1.1)分解长链碳水化合物作为随机位置在淀粉链,最终从直链淀粉麦芽三糖,麦芽糖,或麦芽糖,葡萄糖和“极限糊精”支链淀粉(Das et al ., 2011)。随着生物技术的进步,淀粉酶的应用扩大了在许多领域,如临床、医药和分析化学,以及其广泛的应用在淀粉糖化和纺织、食品、纸、洗涤剂、医药酿造和蒸馏工业。热稳定性是所需的大部分工业酶的特征。耐热性的酶分离出嗜热生物发现了大量的商业应用,因为他们的稳定性。执行酶液化和糖化淀粉在高温下(100 - 110ºC),耐热性的淀粉分解的酶目前已经研究提高淀粉工业过程的退化和感兴趣的生产有价值的产品,如葡萄糖、结晶葡萄糖,葡萄糖糖浆、麦芽糖和麦芽糊精。在这篇文章中,我们对此已进行了隔离和这样一个耐热性的特征从自然土壤分离淀粉酶。

二世。材料和方法

材料

可溶性淀粉、葡萄糖、二硝基水杨酸(DNSA) Folin试剂,醋酸缓冲,克试剂,牛血清白蛋白(BSA)。

中使用:营养肉汤、营养琼脂、淀粉琼脂板和100毫升生产介质组成的可溶性淀粉- 1.2通用、牛肉膏- 0.3通用、琼脂- 3通用、pH值- 7.5。

2.1隔离的淀粉酶产生微生物

隔离的淀粉酶生产生物降解淀粉的能力,土壤样品从不同的网站。Loop-full土壤样本有淀粉琼脂板和孵化37ºC的孵化24小时后24 h。37ºC,单一的殖民地不同大小的选择。殖民地形成明显的光环后的克的碘被确定为淀粉降解菌株。文化有最大退化区被选中作进一步研究。

2.2淀粉降解微生物的识别

文化受到革兰氏染色法和各种生化检测识别。

2.3培养液淀粉酶产生有机体的发展

剂发展50毫升N-broth 100毫升瓶准备和热压处理过的15 psi 15分钟。文化显示出最高的淀粉降解接种了肉汤,瓶培养瓶在150 rpm 24 h。24 h后孵化5毫升的汤在10000转离心10分钟。增长是测量的660纳米的颗粒。生产媒体当时接种通过调整1 / 100毫升的媒介。

2.4生产淀粉酶

上面的培养液是当时接种生产媒体介绍过o。d。邓肯得到最后的1660/100毫升的媒介。生产的玻璃瓶被放养在环境振动器在150 rpm。5毫升样品后退出生产介质24日分别为48和72 h。这些样本然后在10000转离心10分钟。上层清液进一步用于估计淀粉酶测定和蛋白质。这样产生淀粉酶是一种胞外酶。

2.4.1淀粉酶测定

酶测定反应混合物1毫升粗酶(上层清液)和1毫升可溶性淀粉溶液(1%)在37ºC孵化15分钟。反应停在添加1毫升dinitro-salicylic酸(DNSA)。管是煮10分钟。后冷却管和添加7毫升蒸馏水。吸光度是在540 nm和还原糖(葡萄糖)从葡萄糖的标准曲线计算(1毫克/毫升)。这个协议被称为标准协议。被定义为一个单位的淀粉酶活动释放的酶量μmole之一从以上试验条件下可溶性淀粉葡萄糖。

2.4.2蛋白质估计

蛋白质含量是由Folin-Lowry(罗沃利et al ., 2005)方法,以牛血清白蛋白为标准(200μg /毫升)。

2.5文化参数的优化

优化各种参数和媒体的发展是最重要的标准酶的生产过剩。几个参数研究了优化酶生产如下:

2.5.1研究不同培养时间对淀粉酶的影响生产

剂制备了如上所述。生产媒体包含100毫升烧瓶在1 O.D.660/100ml接种剂。生产的玻璃瓶被孵化瓶在150 rpm。最大淀粉酶生产能力的有机体被收割检查样品在24日分别为48和72 h。

2.5.2研究不同接种体大小对淀粉酶的影响生产

准备培养液如上所述。在不同培养液接种生产介质大小;介绍过o。d。邓肯0.5介绍过o。d。邓肯/ 100毫升,1/ 100毫升,介绍过o。d。邓肯1.5/ 100毫升,介绍过o。d。邓肯2/ 100毫升。样本收获在24日,48和72 h。分析了淀粉酶的生产标准协议。

2.5.3研究不同浓度的淀粉在淀粉酶的影响生产

准备培养液如上所述。接种生产中不同浓度的淀粉;0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%和3%。分析了淀粉酶生产在不同的玻璃瓶。

2.5.4研究不同pH值对淀粉酶的影响生产

影响不同的pH值对淀粉酶生产研究了接种生产中不同初始pH值为4,5,6,7,8和9。样本收获在24、48和72 h。分析了淀粉酶的生产标准协议。

2.5.5研究不同温度对淀粉酶的影响生产

不同温度对淀粉酶产量的影响进行了研究。生产中接种和培养在不同的温度下即28ºC, 37ºC和室温。样本收获在24、48和72 h。分析了淀粉酶的生产标准协议。

2.6部分纯化淀粉酶酶:

整个净化过程是在冷却条件和0.1毫米醋酸缓冲(pH值5)除非另有说明。

2.6.1制备粗酶

淀粉酶是使用生产的最优条件。生产中收获,在10000转离心10分钟4ºC。上层清液从而获得被认为是粗酶。

2.6.2硫酸铵沉淀

降水的上层的硫酸铵沉淀酶的方法。硫酸铵添加到酶上层的0 - 20%,20 - 60%,60 - 80%和80 - 100%饱和度。每一步饱和后,介质在10000转离心10分钟4ºC和沉淀从而获得溶解在最小体积的0.1毫米醋酸缓冲(pH值5)溶解的颗粒。当时上层清液用于随后的饱和的一步。

2.6.3透析

透析袋用于删除盐的帮助下0.1毫米醋酸缓冲(pH值5)。常规透析袋的使用涉及删除不必要的低分子量溶质从样例,取而代之的是缓冲区中“透析”。每个分数的硫酸铵饱和度是在单独的透析袋。这些分数是透析过夜在冷却条件下对醋酸缓冲。在透析的整个过程,缓冲是改变了三次。

2.6.4 sds - page

钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳被用于蛋白质分离的基础上的大小和分子量。电泳是在室温下使用Laemmli缓冲系统(Laemmli, 1970)和利用蛋白质分子量标志广泛(Medox-Biotech印度分公司,印度)。

2.7描述的酶

2.7.1酶动力学

整除的储备溶液(1%)被以得到不同的底物浓度(100μg - 1000μg) 2 ml检测系统包含1毫升的纯化酶和水,使最终的体积(2毫升)的试验系统。反应是在37ºC。公里,酶的Vmax从Lineweaver-Burk获得双倒数分析。

2.7.2 pH值和温度对淀粉酶活性的影响

酶活性测定的最佳条件使用部分纯化酶通过DNSA测定之前所描述的。测定pH值对酶活性的影响,采取1毫升衬底(1%)和1毫升酶,0.5毫升的0.1毫米缓冲:醋酸缓冲(pH值3.0 - 5.0),磷酸缓冲(pH值6.0 - 8.0)和孵化37ºC。温度对酶活性的影响确定范围内的30 - 120ºC。水浴被用来维持的温度检测系统。

2.7.3不同培养时间对淀粉酶活性的影响

酶活性测定的最佳条件像之前描述的那样使用由DNSA纯化酶试验。测定不同培养时间对酶活性的影响,采取1毫升衬底(1%)和1毫升酶和培养不同时间间隔从30分钟在100ºC(最佳温度)。

第2.7.4抑制剂的影响,金属离子对淀粉酶活性

即影响抑制剂(10毫米);十二烷基硫酸钠(SDS)、HgCl2砷酸钠、尿素、ethylenediaminetetraacetate (EDTA)、淀粉酶检查活动。影响不同的金属离子(10毫米)即;Ca + 2毫克+ 2 Mn + 2,锌+ 2、铁+ 2、NH4 + 2淀粉酶活动也被检查。

三世。结果与讨论

3.1隔离的淀粉利用生物

初步筛选的淀粉利用生物体,两个不同的土壤样本收集和接种在淀粉汤有1%淀粉。烧瓶的孵化环境振动器在150 rpm 24 h。淀粉利用微生物殖民地获得了裸奔的丰富淀粉平皿上肉汤孵化24小时37ºC。不同淀粉利用生物显示淀粉降解区。淀粉酶生产淀粉平皿上证实了洪水与碘溶液的盘子。最初板块获得深蓝的颜色,几秒后,一些细菌菌落周围的深蓝的颜色开始显示清楚区细胞外分泌淀粉酶的细菌菌株淀粉降解紧随其后。一个孤立的细菌表现出最高的酶活性进一步选择研究。

3.2形态特征和生化鉴定分析

文化是革兰氏阴性短杆和确认测试的初步识别属于假单胞菌的家人和被称为假单胞菌sp, B5。

3.3文化参数的优化

各种物理和化学因素会影响生产淀粉酶等孵化时间,接种体大小、pH值、温度、不同淀粉浓度等。

一)研究不同培养时间对淀粉酶的影响生产

优化的孵化时间最大淀粉酶生产样本收获在24小时间隔72 h从生产中、在10000转离心10分钟。上层清液用于蛋白质中描述的淀粉酶测定方法和评估(罗沃利et al ., 2005)。文化的发展也介绍过o。d。邓肯的检查结果如下图所示(图)。从图得出最大淀粉酶生产结束时(0.41μmole)观察24小时,它随着时间的增加减少。

b)研究不同接种体大小对淀粉酶的影响生产

接种体大小的影响最大淀粉酶生产检查。不同培养液大小如介绍过o。d。邓肯0.5介绍过o。d。邓肯介绍过o。d。邓肯660/100毫升,1 660/100毫升,1.5 660/100毫升,介绍过o。d。邓肯2 660/100毫升接种在生产中、样本收集间隔24,72 h。获得的结果如下图所示(图2)。以来最大酶生产获得了24 h,图形表示酶和蛋白质的生产24小时结束时只被描述。

从图中得出培养液介绍过o。d。邓肯0.5的大小/ 100毫升是最大最优酶生产(6.40μmole /毫升/分钟)。增加剂,观察细胞外蛋白质含量增加,但没有发现类似的模式对淀粉酶的生产。

c),研究不同浓度的淀粉在淀粉酶的影响生产

亚太区et al .,(1989)报道,碳源极大地影响淀粉酶生产和最常用的基质是淀粉。在本文中,不同浓度的可溶性淀粉在淀粉酶的影响生产进行了研究,在这项研究中生产中不同浓度的淀粉准备。增加我们的应变显示稳定的酶生产淀粉浓度的增加。淀粉酶量最高(6.77 U)产生了3%的淀粉生产中(图3)。

d)来研究不同pH值对淀粉酶的影响生产

生产媒体设置在不同初始酸度为了检查的影响由假单胞菌对淀粉酶生产sp, B5。不同初始pH值从4到9进行了测试。我们的压力使酶活性最高5 pH值,产生良好的酶初始pH值范围5 - 7。结果如下图所示(图4)。

亚太区et al。(1989)报道,地衣芽孢杆菌的增长TCRDC-B13 pH值发生在3 - 11日,尽管细菌生长开始减少随着pH值的增加。他们还发现,最佳酶生产获得pH值6到9。细菌培养等。细小,B。地衣芽和B。amyloliquefacience所需的初始pH值7.0 (Syal et al ., 1986)。Rhodothermus marnies据报道,产生良好的酶水平初始pH值范围7.5 - 8 (Carlsen et al ., 1996)。

(e),研究了不同温度对淀粉酶的影响生产

温度对细菌生长的影响和淀粉酶的生产从假单胞菌sp。B5进行了研究。酶测定在不同温度下的生产;28日0 c, 37 0 c和室温(32 0 c)和最佳酶生产在室温下观测。结果如下图所示(图5)。

齐藤et al ., 1973年研究了芽孢杆菌licheniformies应变产生淀粉酶在温度约50 0 c和从来没有产生这种酶在温度低于45 0 c但假单胞菌sp。B5显示最高淀粉酶生产和细胞生长在室温下(11.45μmole / ml / min),酶生产也观察到28日0 c(9.09μmole / ml / min)和37 0 c(9.78μmole /毫升/分钟)。

3.4。局部净化过程的淀粉酶酶

两步蛋白质纯化协议之后。这两个步骤包括;总蛋白沉淀的汤用硫酸铵沉淀,其次是透析除盐的帮助下0.1毫米醋酸缓冲。假单胞菌产生的淀粉酶sp。B5只是部分纯化酶的总收率9.22%的最后60%饱和度硫酸铵的上层清液。1.32(表1)的纯度褶皱年底达到60%硫酸铵沉淀步骤。

3.5。淀粉酶的描述:

3.5.1:活动染色和分子量测定的部分纯化淀粉酶

本地页面是为了找到淀粉酶在凝胶上的确切位置。

图6显示了活动执行本机电泳后的凝胶染色。清除区水解淀粉的可视化在孵化后的本地电泳凝胶淀粉琼脂板上10分钟加载样品确认淀粉酶的存在,它的位置在聚丙烯酰胺凝胶上。

sds - page分子量测定。部分纯化酶样品显示大约四个乐队的变性聚丙烯酰胺凝胶(图7)。净化PHB解聚酶的分子量被发现约55350 KDa相比基于Rf值(表2)。

淀粉酶的分子量约55370 KDa进一步发现稳定在100ºC。

3.5.2酶动力学

淀粉酶热稳定性和pH值等配置文件的属性是需要阐明为了有其工业应用。因此,应用程序创建的多样性需要寻找新的和改进的属性与淀粉酶。淀粉在淀粉酶水解的速度取决于许多工艺条件如温度、pH值、和底物的性质、底物浓度、酶浓度。因此,部分纯化酶进一步表征。

一)不同的淀粉浓度对淀粉酶活性的影响部分纯化的酶

莱恩威弗-伯克情节(Fig.8)显示,1.8公里的淀粉酶值μmole Vmax价值为0.019 U /分钟。

b) pH值和温度对部分纯化淀粉酶活性的影响

纯化淀粉酶是活跃在酸性pH值酸度范围从4.0到5.0 (Fig.9)。最优活动得到缓冲(0.1醋酸缓冲)pH值5.0。从图得出初始酶活性降低酸度与酶活性增加4 5,随后下降。所以淀粉酶给的最大酶活力酶活性在pH值5。酶的最佳活动在低pH值(pH值4.5 - -5.0)在pH值- 5.0稳定性好是非常重要的从工业应用的角度(Sajedi et al ., 2005)。

不同温度对酶活性的影响,研究了通过孵化酶和底物等温度范围30º100 oC。结果如图所示(图10)。温度30摄氏度到100摄氏度支持最大活动100 oC的酶活性(图10)。它是可取的,淀粉酶应该活跃在高温凝胶化(100 - 110ºC)和液化(80 - 90ºC)节约过程。因此这部分纯化酶已经被证明是商业领域的重要酶在应用程序需要更高的温度。从图发现假单胞菌sp。B5给最大酶活性在100ºC。纯化淀粉酶显示活动广泛的温度从而使这种文化强大的生物用于应用程序需要在高温下的工业应用。随着活动在高温热稳定性是同样重要的。这个属性可能是有利的对传统酿造和食品加工工业操作(斯坦福et al ., 2001)。因此酶的进一步表征了其热稳定性。 This was done by incubating the enzyme at higher temperatures for a long period of time and then checking its activity.

c)在100 oC淀粉酶热稳定性:

为了检查假单胞菌产生的淀粉酶热稳定性的sp, B5,部分纯化酶首先是保持在100 oC水浴和整除1毫升是在每5分钟间隔,然后酶试验是在100 oC。图中所示的结果是(Fig.11)。从图可以看出,酶给最大活动(7.2 U)在20分钟左右。然而,活动后开始递减。但部分纯化酶显示相当大的活动,因此热稳定性即使被保持在100 oC 35分钟。考虑的一点是,孵化时间酶测定也是15分钟也在100 oC。因此部分纯化酶显示良好的热稳定性,因此可以说是工业上重要的酶。

d)不同培养时间对酶活性的影响:

不同培养时间对酶活性的影响,研究了通过孵化酶和底物5、10、15、20、25分钟。结果图中所示图12所示。发现培养时间15分钟是最佳的酶活性。

e)不同抑制剂对酶活性的影响

金属螯合剂和化合物的影响有助于研究酶的特点。金属螯合剂的抑制效应表明某些金属离子对酶活性的要求。这些研究通过添加抑制剂如HgCl2(10毫米)、砷酸钠(10毫米)、尿素(10毫米),SDS(10毫米),EDTA与es(10毫米)解决方案,找出相关的活动。结果显示在图Fig.13。我们收到了一些杰出的结果分析。假单胞菌产生的淀粉酶sp。B5显示相对较高的活动HgCl2,砷酸钠、尿素以及SDS。这些化学物质被证明是许多酶抑制剂是无效的淀粉酶。然而,这些研究结果还需要进一步探讨。EDTA降低酶的活性,证明了需要特定的金属离子对淀粉酶的活动,当EDTA螯合,减少活动。找到哪些金属离子的存在增加了假单胞菌产生的淀粉酶活性sp B5。然后,我们进一步认为研究不同金属离子对淀粉酶活性的影响。

f)不同金属离子对酶活性的影响

大多数金属ion-dependent酶淀粉酶是已知的,即像Ca2 +二价离子,Mg2 + Mn2 + Zn2 + 2价,NH4 +等(Panday et al ., 2000)。的影响,研究了金属通过孵化这些金属离子与es解决方案,找出%相对活动在图所示。

从图14可以看出,不同金属离子对淀粉酶活性有不同的影响。离子钙+ 2和铁+ 3是活动增强剂而Mg + 2, NH4 + 2,锌+ 2以及铁+ 2抑制剂对淀粉酶对淀粉。Ca2 +报告增加α-amylase活动alkaliphilic杆菌sp。ANT6 (Burhan et al ., 2003)。Ca2 +的稳定影响酶的热稳定性是解释为疏水残基的盐析Ca2 +的蛋白质,因此,导致采用结构紧凑(Goyal et al ., 2005)。

四。结论

淀粉酶是一种最工业探索和重要的酶。在这个工作自然土壤分离假单胞菌产生的淀粉酶sp。B5详细研究。假单胞菌sp。B5给最大淀粉酶生产(12.79μmole / ml / min)在生产中pH值(5)含3%可溶性淀粉在室温下孵化的时候,150 rpm 24 h。进一步描述部分纯化淀粉酶证明它是一种酶分子量约55370 kDa和1.8公里的μmole Vmax约0.019 U /分钟。酶显示pH值最适条件的5活动广泛的温度从30到100 oC。最突出特点的假单胞菌产生的淀粉酶sp。B5 35分钟是稳定在100 oC,给了相当大的活动。几个抑制剂和金属离子对淀粉酶活性的影响证明了EDTA是有害的。金属离子的存在即Ca + 2和铁+ 3显示的淀粉酶的活性增加。假单胞菌sp。B5可以被认为是商业上可行的应变和产生的淀粉酶菌株具有广阔的工业应用由于其剩余财产活跃在广泛的pH值和温度。因此从自然土壤淀粉酶产生隔离,假单胞菌sp B5。是一个商业上重要的淀粉分解的酶。

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