以菊粉为包封材料的班巴拉花生分离蛋白/海藻酸盐复合凝聚技术增强鼠李糖乳杆菌GG的活力:响应面方法

摘要

微胶囊被广泛用于稳定益生菌，使其充分发挥功能。本研究的目的是确定班巴拉花生分离蛋白(BGPI)/海藻酸盐和菊粉作为益生菌包封剂的最佳组合;采用响应面方法(RSM)建立了L ac t o b ac ill us r h a m n o su s GG。采用复合凝聚技术，用不同比例的BGPI/藻酸-菊粉壁进行RSM包被。结果表明，BGPI/藻酸盐溶液质量比为1:1的最佳浓度为2.14% w/v，菊粉w/v为3.23% w/v。该配方的包封率为96.64%，冷冻干燥和酸性条件下的成活率分别高达95.76%和94.48%。不仅造成的预测模型的有效性确认但胶囊也提高了细胞的存活率在模拟胃液体(山东)4.88∼日志CFU /毫升3 h后与自由细胞和展示了细胞内释放8.53日志CFU / ml 4 h。裹入细胞的存活率储存在4°C和30°C为6个月(7.82日志×FU /毫升和8日志CFU /毫升,分别)优于那些免费的细胞在相同的条件下,(分别为4.10 log CFU/ml和<1 log CFU/ml)。将益生菌包封在BGPI/藻酸菊粉胶囊中，可提高细胞在冷冻干燥过程、暴露于胃酸性介质和储存过程中的活力。

关键字

鼠李糖乳杆菌GG，复合凝聚，班巴拉花生分离蛋白，胃肠道，冷冻干燥

简介

益生菌在食品和制药工业中发挥着重要作用，因为它们旨在提高其营养和治疗价值[1］．摄入益生菌对人体健康的好处包括控制肠道感染、降低血清胆固醇水平、抑制癌症、改善消化、减轻乳糖吸收不良症状和刺激胃肠道免疫[2-4］．近年来，益生菌对健康的积极影响反过来刺激了食品中功能性益生菌的需求。建议含有益生菌的食物在食用时每克或毫升至少含有106个活微生物[5，6］．然而，现有的益生菌产品往往提供低细胞群，因为活细胞在制造过程、储存和通过人体胃肠道的过程中遇到了恶劣的条件[7］．将这些细菌的活力维持在足够高的水平以产生有益的效果，对制药和食品工业的配方科学家提出了重大挑战[8］．因此，益生菌细胞经常使用挤压、乳化和喷雾干燥等多种技术，在各种聚合物中微胶囊化，以保护益生菌细胞免受环境条件的影响[9，10］．特别是复杂凝聚法，由于其易于实现且成本相对较低，已引起广泛的兴趣[11］．复合凝聚包括从溶液中析出两种或两种以上的生物聚合物，例如电荷相反的蛋白质和离子多糖，从而导致相分离。所形成的凝聚体随后在所合并的固体颗粒或液滴周围沉积，形成表面层或涂层[12］．例如，乳清分离蛋白和阴离子多糖ҡ-carrageenan被成功地用于包封乳杆菌所制备的微胶囊可通过多种干燥技术进行干燥[13］．

各种天然聚合物，如海藻酸盐、果胶、卡拉胶、阿拉伯胶和明胶已被用作封装材料[14，15］．海藻酸钠作为益生菌和益生元的载体，由于其聚合物的生物相容性、可控性、理化性质广泛和成本低廉，在食品工业中被广泛应用[16-18］．最近，包括乳清蛋白、豌豆蛋白、明胶和酪蛋白在内的蛋白质作为益生菌的潜在替代包封材料受到越来越多的关注[16，19，20.］．豆科蛋白质在食品工业中封装各种实体的兴趣源于其食品功能和低成本[21］．从豌豆、鹰嘴豆和大豆中提取的豆类蛋白以前曾与多糖结合，以包裹和保护益生菌细胞免受生产和口服给药过程中遇到的有害环境的影响[22，23］．

班巴拉花生豆科或豇豆属subterrnanea(豆科)分布于泰国南部、非洲大陆、巴西及西爪哇[24，25］．最近，班巴拉花生乳和从该豆科植物中分离出的蛋白质也可以与乳酸菌一起使用，使益生菌产品具有优势，不仅提高了营养豆科植物的经济价值，而且提高了益生菌在有害环境下的生存能力[26，27］．益生元是一种不可消化的食物成分，能刺激胃肠道内细菌的生长或活动。某些益生元，如菊粉、低聚果糖和抗性淀粉，也被用作共包封材料，以增加在储存期间或摄入后暴露于酸性条件下的细菌的活力[28，29］．

只有少数研究关注豆科分离蛋白和益生元在益生菌包封方面的优势。因此，豆科蛋白和益生元的组合对于同时提高益生菌的保护和刺激胃肠道中传递细菌和驻留细菌的活性是有意义的。在冷冻干燥和暴露于胃肠道酸性条件下时，优化包封材料的组成和工艺对于最大限度地提高包封效率和细胞的活力是必要的。经典的实验方法一次只改变一个参数，这很耗时，而且不包括变量之间的相互作用，也不描述参数对过程的完整影响。在过去的二十年中，响应面方法(RSM)作为一种有效的统计技术，被越来越多的人接受，用于调查各种因素对过程的影响。同时改变几个配方参数，以便在最少实验次数的基础上预测最佳工艺条件[30.］．

本研究的目的是确定BGPI/海藻酸盐和菊粉复合凝聚技术包封鼠李糖乳杆菌GG的最佳组合。预计优化配方将最大限度地提高包封效率，包封细胞在冷冻干燥和储存后以及暴露于模拟胃液和模拟肠液期间的存活率。

材料与方法

菌株

商业益生菌乳酸杆菌鼠李糖GG (ATCC 53013)购自American Type Culture Collection。培养液保存在De Man, Rogosa和Sharpe (MRS)肉汤中(Difco, Sparks, MD, USA)，加25% w/v甘油，温度为-80°C。使用前，将冷冻培养物在MRS培养液中连续培养两次，在厌氧条件下，保持在含有气体-pak微生物Anaerocult®a (Merck, Darmstadt, Germany)的厌氧罐中，37°C培养48小时。

的制备喂食班巴拉花生分离蛋白复合凝聚法制备gg微胶囊

成熟的班巴拉落花生种子来自泰国宋卡的HatYai当地市场。将样品(1公斤)脱壳，使用研磨机(泰国健康草药产品有限公司)研磨，以获得细粉。班巴拉花生分离蛋白(Bambara groundnut protein isolation, BGPI)采用Pastor-Cavada等方法制备。31，并作了如下修改。将20克花生粉悬浮在100 ml 2 g/l NaOH溶液(pH为12)中。在室温(30°C)下连续搅拌2小时，然后在25°C下使用Beckman Model Avanti J-E离心机(Beckman Coulter, Inc.， Fullerton, CA, USA)在6000 × g下离心30分钟。收集上清液，使用6 M HCl将上清液调整至pH 4.5，在此形成沉淀，随后在25°C下6000 × g离心30分钟分离。用10体积蒸馏水(pH 4.5)洗涤所得的颗粒，然后在8000 × g下离心30分钟，并使用冷冻干燥机(型号为df -300 Airvac Engineering Pty Ltd.， Dandenong, Australia)，冷凝器温度为-40°C，冷却20小时。干燥的粉末称为“班巴拉花生分离蛋白(BGPI)”。将BGPI装入密封的聚乙烯袋中，4°C保存至使用。

封装程序

采用复合凝聚技术，将BGPI/海藻酸盐(1:1的重量混合比例)和菊粉包封益生菌细胞。根据下面描述的实验设计，以不同浓度制备BGPI/海藻酸盐和菊粉溶液。将2ml菊粉溶液(细胞密度109-1010 CFU/ml)中的细胞分散液加入8ml BGPI/海藻酸溶液中，缓慢搅拌20分钟。随后，通过缓慢加入10% (v/v)乳酸溶液，将混合物的pH调整为pH 4.5，形成凝聚体，并在室温(30℃)下静置至少30分钟，使相完全分离。随后，将清上清液滗取，得到微胶囊形式的复合凝聚相。微胶囊用去离子水(pH值4.5)洗涤三次，然后按照前面描述的条件冷冻干燥。通过计算冻干前后囊化细胞的存活数量来计算成活率。

实验设计

要求得到预期的响应结果，即包封效率(EE， %)、益生菌细胞在pH为2.0的酸溶液中的存活率(%)和冷冻干燥后的存活率(%)。两个主要因素包括生物聚合物混合比例为1:1制备的1-3% w/v的BGPI/海藻酸水溶液和1-5% w/v的菊粉溶液。如表1，为基于中心复合设计(CCD)的优化程序准备了13个不同的组合，以研究两个因素对上述响应的影响。

表1:包囊剂bambara groundnut protein isolation (BGPI)/海藻酸盐和菊粉的组合处理按照中心复合设计，对包囊率、耐酸条件下的成活率和冷冻干燥后的成活率进行了实验和预测喂食GG。

采用f检验检验模型是否有统计学意义，并对拟合的二次多项式模型进行方差分析。实验设计、数据分析和优化程序采用design Expert软件(试用版9.0.3.1;stats - ease，明尼阿波利斯，美国;www.statease.com)。

对于预测模型的准确性，用R来确定实验数据与预测值回归方程的充分性₂和绝对平均偏差(AAD)，计算公式为:

在y_我exp和y_我，cal分别为实验响应和计算响应，p为实验运行次数。

自由单元格和封装单元格的枚举

将囊化后的微胶囊加入0.1 M的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，在室温下剧烈搅拌30 min，使聚合物壁破裂，细胞完全释放到缓冲液中。一定的顺序稀释，以达到计数细胞数。细菌细胞在37°C厌氧条件下镀在MRS琼脂上48 h，同时也同样列举了游离细胞。

包封率的测定

封装效率(%)计算如下:

封装效率(%)=[log N/log N0] × 100

其中N是从总凝聚质量中释放(用于枚举)的细胞数，N0是添加到用于微胶囊化的混合聚合物溶液中的初始细胞数。

pH 2.0酸性溶液中包封基质对细胞活力的影响

包封基质对酸性溶液中细胞活力的保护作用采用Lee和Heo [32]如下。将游离细胞和包被细胞加入含0.2% w/v NaCl的酸液中，pH为2 (0.1 N HCl调节)，37℃，孵育2 h。孵育后，立即换液，用消毒的生理盐水冲洗两次，以缓解酸应激。用上述方法对微胶囊中的游离细胞和释放细菌细胞进行计数。

包膜细胞的光镜和扫描电镜

新鲜的微胶囊样品转移到玻片上，然后在光学显微镜下检查(Olympus, Tokyo, Japan)。使用扫描电子显微镜(JSM-5800LV, JEOL, Japan)获得进一步的形态学信息。冷冻干燥的样品使用双面胶带和涂有金的溅射安装在铝存根上，然后在15kv下观察。

游离细胞和包被细胞在模拟胃液中的存活

模拟胃液(SGF)按照Gbassi等描述的方法制备[33作了修改。配制浓度为9 g/l的生理盐水溶液，用1 M HCl调整pH值至2.0。121℃高压灭菌15 min，加入胃蛋白酶(Sigma-Aldrich, USA)，浓度为3.0 g/l，经0.22 μm无菌膜过滤。将游离细胞或包被细胞转入SGF, 37°C, 160 rpm摇眶孵育3 h。孵育结束后，分别于0、30、60、120、180 min取样品，按上述方法枚举活菌。在采样间隔内比较游离细胞和包被细胞的存活率。

模拟肠液中的释放研究

封装的释放配置文件喂食在模拟肠液(SIF)中研究了BGPI/藻酸菊粉微胶囊中的GG。SIF由1 g/l胰酶(Sigma-Aldrich, USA)和3 g/l胆盐(Sigma-Aldrich, USA)在12.5 g l-1 NaHCO3中组成，用1 M NaOH将其pH调整为7.0 [34］．溶液经0.22 μm无菌膜过滤。含BGPI/藻酸菊粉微胶囊喂食将GG添加到含有预热SIF的锥形塑料管中，在37°C下以160转/分钟的转速震动孵育。每隔0、30、60、120、240 min收集100 μl的释放液，并用等体积的新鲜培养基代替。提取的样品立即进行了活菌数测定喂食GG细菌按照上述程序释放，并根据时间绘制累计释放量。

囊化细胞在储存过程中的存活

将游离包封的冻干型益生菌细胞(400 mg)人工装入明胶1号胶囊。胶囊被放置在一个密封的琥珀色玻璃瓶里，玻璃瓶里装有硅胶干燥剂，用一团棉絮紧紧地压紧。游离和封装的储存稳定性好喂食GG在4°C和30°C下每隔一个月进行一次测试，按照上述方法检测游离细胞和包被细胞的活力，持续6个月。

结果与讨论

拟合模型的建立与检验

采用响应面法研究了壁浓度(BGPI/海藻酸盐)和菊粉用量对益生菌细胞在酸性条件和冷冻干燥后恶劣环境下包封率及存活率的影响。在壁浓度小于1% w/v的单因素实验中，不仅微胶囊产量低，包封率低，酸内和冷冻干燥后存活率低。另一方面，较高的BGPI/海藻酸盐浓度(>3% w/v)导致微胶囊形态不规则，粒径较大，且难以进一步加工。因此，不建议将这些益生菌微胶囊用于制备和进一步应用。菊粉的浓度选取自其他研究的结果[35，36］．因此，壁浓度(BGPI/藻酸盐)和菊粉应分别在1-3% w/v和1-5% w/v范围内进行优化。

为优化益生菌凝聚微胶囊的制备工艺，采用CCD在RSM中设计了13个实验。在实验和预测响应的益生菌细胞包封效率，在酸性条件下和冷冻干燥后的存活率表1．两个自变量与三个响应之间的关系由以下回归方程给出:

封装效率

Y₁b = 65.5982 + 19.1932 + 6.8048 - 4.2170 - 0.4533 - ab -₂-0.9165 b2

酸性条件下益生菌的存活率

Y₂b = 62.1788 + 18.6950 + 7.2726 - 3.9366 - 0.4595 - ab -₂-0.9574 b2

冻干后益生菌存活率

Y_3.b = 61.9174 + 20.2120 + 7.6579 - 4.2550 - 0.6597 - ab -₂-0.9676 b₂

在Y₁Y₂和Y_3.(%)为包封率，细胞存活率喂食GG在酸性条件下和冷冻干燥后，A和B分别为BGPI/藻酸盐和菊粉的浓度水平变量。

采用方差分析对回归模型、各模型系数及拟合不足进行显著性检验。方差分析和缺乏相关系数拟合检验的结果显示在表2．系统地，模型的适应度由模型的显著性(p<0.05)和不拟合的不显著性(p>0.05)决定。由决定系数R表示₂，量度可由自变量解释或解释的回应变量的百分比，如先前的研究所概述[32，37］．对于模型的良好拟合，Joglekar & May [38建议;建议;₂值应该至少为0.80。

表2:二阶响应面模型的方差分析(ANOVA)。

配方变量对益生菌细胞包封率的影响

给出了与捕集效率相关的响应面图图1一个．2(0.9845)较高，说明二次模型拟合充分。系数的大小以及它所携带的符号，即多项式回归中的正或负，使人们能够绘制变量的显著性。封装的可行性喂食BGPI/海藻酸(A)对GG的影响最大，菊粉(B)的影响最小。在相互作用的情况下，随着BGPI/藻酸盐和菊粉浓度的增加，包封率逐渐增加，直至达到最大值。如果BGPI/海藻酸盐的w/v值进一步增加到2.14%以上，则对包封效率的影响很小。与BGPI/藻酸盐浓度的影响相似，菊粉浓度的增加可提高包封效率，但当菊粉浓度高于3.23% w/v时，其提高幅度较小。

配方变量对植物生存力的影响喂食酸性条件下的GG

给出了酸性条件下活性的三维响应面图图1 b具有良好的决定系数(R₂值为0.9837)。这些参数的分析表明，BGPI/藻酸盐是影响藻活力的最有效因素喂食GG在酸性条件下，再加入菊粉。图为酸性条件下不同浓度的BGPI/海藻酸盐和菊粉对益生菌活力均值的影响。以BGPI/藻酸盐和菊粉为均值时，细胞活力最高。

配方变量对植物生存力的影响喂食冷冻干燥后GG

研究了BGPI/藻酸盐和菊粉浓度对黄颡鱼活力平均值的影响喂食介绍了冷冻干燥后的GG图1 c．结果表明，冷冻干燥后细胞活力明显降低喂食随着BGPI/藻酸盐和菊粉浓度的增加，GG稳定增加，达到其平均值，但超过这些浓度后GG下降。决定系数(R₂)为0.9685。

预测模型的验证

为确定统计模型的有效性，采用BGPI/藻酸盐2.14% (w/v)和菊粉3.23% (w/v)为最优浓度的保护材料处理。在此优化条件下，预测的成活率喂食在酸性条件下GG的包封率、冷冻干燥后的成活率分别为96.64%、94.48%和95.76%。实验结果表明，在最佳工艺参数条件下，包封率为95.92%，酸浸后的成活率为93.69%，冷冻干燥后的成活率为96.21%。实验结果验证了模型的有效性，实验值与预测值吻合较好。包封率、酸性条件下的成活率和冻干后的成活率与均值的偏差分别为0.75%、0.84%和0.46%。三次试验的平均值与预测值接近，在可接受的范围内，这表明所选模型的充分性。

形态学分析

如在图2一个， BGPI与带相反电荷的海藻酸盐相互作用形成复杂凝聚，形成包住菊粉和菊粉的大分子网络喂食GG细胞。光学显微镜显示相当均匀的球形喂食采用复凝聚法制备GG微胶囊，粒径范围为124 ~ 352 μm。用扫描电镜观察了冷冻干燥微胶囊的形貌图2 b表明高团聚，导致球形形状的丧失，并产生各种大小的片状结构。在更高放大倍率(5000x)下，图2 c发现微胶囊表面和内部均有细菌细胞嵌套。

微囊化存活喂食模拟胃液中的GG细胞

某些细菌在酸性环境中运行一种防御机制，质膜中的质子泵或质子/阳离子交换系统补偿质子的流入，以保持细胞质接近中性pH。然而，在高酸性条件下，细胞的pH调节机制无法充分发挥作用，导致细胞内酸化导致生存能力丧失。当自由喂食将GG细胞和在优化配方条件下用BGPI/海藻酸盐和菊粉复合凝聚包裹的细胞暴露于37℃的模拟胃液(SGF, pH 2.0)中，处理3 h后，未被包裹的细胞数量显著减少(对数减少5.98对数CFU/ml)。相比之下，囊化细胞的活力损失相当小(1.05 log CFU/ml)，如图所示图3，与Sheu和Marshall的工作一致[39]、李、许[32]和钱德拉莫利等人。[40］．目前的研究结果强调了胃环境对未受保护的益生菌细胞的显著有害影响，以及开发的基于复杂聚合的微胶囊技术在保护细胞免受不利外部环境影响方面的效率。喂食GG似乎被BGPI/藻酸盐和菊粉相互作用产生的凝聚物有效地包围。在SGF的酸性环境中，蛋白质的可电离基团(BGPI)被质子化，多糖(海藻酸盐)的解离羧基减少，因此细胞可能位于紧凑的聚合基质中，这为SGF的极端pH提供了高效的屏蔽。此外，菊粉作为益生元存在于微胶囊基质中，可能通过物理阻塞基质的孔隙来提高对益生菌细胞的保护，从而阻碍SGF向胶囊的扩散。菊粉对暴露在胃条件下的藻酸盐包裹的益生菌的保护作用以前有报道[41］．

被封装的释放特性喂食模拟肠液GG

小肠和结肠中被包裹的益生菌细胞的有效递送和释放对于生长和定植赋予健康功能至关重要。封装的发布配置文件喂食在含有胰蛋白酶的模拟肠液(SIF, pH 6.8, 37°C)中，超过4小时的时间周期显示为图4．

在30分钟测量的活细胞总数约为6.68 log CFU/ml，随着时间的推移，数量逐渐增加，4小时达到约8.53 log CFU/ml。细胞释放机制可能是由于SIF中bgpi -海藻酸网络的膨胀侵蚀，钠离子(Na⁺)，这可能会破坏蛋白质-藻酸盐网络的稳定。Smidsrod和skjakbrek [42]证明钠离子的存在导致海藻酸水凝胶的快速分解，交联的Ca₂⁺，通过离子交换的过程。此外，SIF中存在的胰酶可能会消化BGPI并加速微胶囊的分解。免费的喂食GG细胞在4小时后存活率从9.49 log CFU/ml下降到7.34 log CFU/ml，可能是由于暴露于SIF释放介质中的胆盐导致细胞壁完整性丧失。Klemmer等人[23]先前报道，在含胆盐的SIF中，包封的益生菌细胞比游离细胞的存活率更高。

自由和封装的储存稳定性喂食GG

游离和包封的存活率喂食图5A和图5B分别显示了BGPI/藻酸菊粉微胶囊在4℃和30℃下储存6个月的GG细胞。在4°C贮存温度下(图5一个)，贮存6个月后游离细胞存活数由9.10 log CFU/ml下降至4.10 log CFU/ml。另一方面，在相同条件下，囊化细胞数量略有下降，从9.55 log CFU/ml下降到7.82 log CFU/ml。根据所示的结果图5 b在含游离菌的对照组中，细胞计数在贮存过程中下降，在30℃贮存4个月后减少4.26 log CFU/ml, 6个月后无计数。在BGPI/藻酸菊粉的情况下，包被细菌在6个月后仅显示出约3对数的细胞数量减少。储存过程中游离细胞的大量减少可能是由于冷冻干燥过程中形成的冰晶对膜的结构损伤和破裂的影响。贮藏过程中，细胞生理状态的改变导致脂肪酸氧化速率增加。在包封细胞的情况下，包封材料，即BGPI，海藻酸盐和菊粉可以保护细胞免受冰晶在冷冻过程中的有害影响。此外，包膜壁形成了对氧的屏障，而BGPI中的含硫氨基酸有助于维持低氧化还原电位，并作为氧清除剂，提高细胞在储存期间的存活率。雨果等人。43]也有报道称，在储存期间，用氯化钙基质包裹在大豆分离蛋白中的益生菌细胞的存活率高于游离细胞。因此，BGPI/藻酸菊粉微胶囊是一种很有前景的提高益生菌细胞活力的微胶囊体系。

结论

益生菌喂食采用复合凝聚技术成功地将GG包裹在BGPI/藻酸菊粉中。验证实验表明，RSM在模型建立、因素优化、交互效应分析等方面是可靠的。最佳工艺条件为:BGPI/海藻酸盐共液(w/v) 2.14% (w/v)，菊粉共液(w/v) 3.23% (w/v)。与未保护的游离细胞相比，在最佳条件下制备的微胶囊具有更高的细胞包封效率，并能较好地保护被包封的细胞免受冷冻干燥过程、胃条件和储存条件的有害影响。微胶囊还能有效地释放模拟肠液中的益生菌细胞。因此，利用BGPI/藻酸盐与菊粉壁基质复合凝集技术生产益生菌微胶囊在制药和功能食品工业中具有潜在的应用价值。

确认

这项研究部分得到了泰国高等教育研究促进和国家研究型大学项目、高等教育委员会办公室和泰国宋卡王子大学药学院的支持。我们感谢Allan Coombes博士对英语的建议和纠正。

利益冲突

所有作者都没有利益冲突需要声明。

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