核苷二磷酸激酶的酶动力学研究人类红细胞和频率分布在健康受试者和移植受者在中国汉族人群

文摘

核苷二磷酸激酶(NDPK),作为一个辅助蛋白质,包括在各种分子过程包括信号转导、能量和药物代谢。主要目的是研究人类红细胞NDPK动力学和监测的频率分布NDPK活动水平在中国健康受试者和移植受者。方法:在红细胞NDPK活动被验证检测离子对高效液相色谱方法。NDPK动力学进行了系统地研究。NDPK活动水平测定健康受试者在500年,250年250年肾和肝移植受者在中国汉族人群。结果:pH值、热稳定性研究表明NDPK相对稳定在温度30 - 45ºC和pH值6.0 - -9.0。在底物依赖性研究中,明显Michaelis-Menten常数和最大速度(公里)酶反应(Vmax)与底物的浓度增加。与此同时,在产物抑制的研究中,dATP浓度的增加,dADP下降的Vmax常数公里和公里Vmax dGTP增加的常数。NDPK活动水平揭示了7倍可变性和不通常分布在所有组。NDPK活动水平明显移植组(P < 0.05)高于健康组。 Additionally, much higher NDPK activity levels had been shown (P<0.001) in liver transplant recipients when compared to kidney transplant cases. CONCLUSIONS: NDPK kinetics studies indicated substrate dependency of NDPK and a “ping-pong” mechanism for production inhibition. Skewness distributions of NDPK activity levels were shown in the study population. The transplant recipients showed higher NDPK activity levels when compared to healthy subjects.

关键字

核苷二磷酸激酶,Ionpair,高效液相色谱,酶动力学,肾移植,肝移植,中国汉族人口。

介绍

核苷二磷酸激酶(NDPK),最初被认为是公认的转移抑制和需要保持细胞内的核苷酶池(1,2),有几个生化功能:(1)绑定到DNA转录激活或沉默(3]。

(2)作为磷酸转移酶如磷酸化的鸟苷二磷酸鸟嘌呤核苷三磷酸腺苷活性小G蛋白和组氨酸蛋白激酶调节线粒体功能、离子通道、类异戊二烯代谢(4,5]。

(3)发挥作用的3 ' 5 '核酸外切酶在DNA修复和复制维持基因组的完整性(6,7]。

(4)拥有鸟苷三磷酸酶活化,随后激活特定的g和调节胞质分裂时染色体的稳定性(8];

(5)当granzyme A-activated脱氧核糖核酸酶在细胞毒性T lymphocytes-mediated凋亡[9]。此外,它可以作为一个激进的非霍奇金淋巴瘤的预后因素和古典霍奇金淋巴瘤(10,11),能促进急性骨髓性白血病细胞的生长和存活(12]。

此外,发现NDPK可以参与thiopurines代谢,与儿童白血病的治疗功效,排斥反应的发生率在肾移植患者的炎症性肠病(IBD) (13,14]。Thiopurines,如硫唑嘌呤和6 -巯基嘌呤,那些和步进式代谢6-thioguanosine 5 '磷酸(6-TGTP)由不同的胞内酶15),NDPK参与γ-phosphate的转移。他们常用的免疫抑制剂药物治疗自身免疫性疾病,慢性炎性疾病和移植后免疫抑制(15,16]。然而,各种各样的负面影响,如myelotoxicity、肝毒性,和恶性并发症,应用有限,和多态性thiopurine S-methyl转移酶、肌苷三磷酸焦磷酸酶,次黄嘌呤phosphoribosyltransferase可以解释一下(15,16]。根据先前的研究[13),知道NDPK活动会直接影响6-TGTP的浓度与治疗功效。因此,在频率分布的移植受者NDPK活动水平正成为一个日益重要的问题。然而,没有数据可用NDPK活动水平在中国人口的特点,尤其是在移植受者。

有NDPK测定的各种方法,如酶联免疫吸附试验(ELISA) [10),免疫组织化学染色法(17),免疫印迹(18),连续光谱光度测量的试验(19,20.),薄层色谱法(TLC)试验21],enzyme-coupled光度法测定[22凝胶电泳部分),和蓝色的原生聚丙烯醯胺(页面)方法(23]。ELISA可以测量NDPK抗原水平的血清或组织(10]。免疫组织化学染色方法被用来测量当地组织和定位分泌组织(NDPK水平17]。西方墨点法可以确定NDPK蛋白质在组织和细胞表达水平;然而,它是耗时和半定量,同时要求高特异性的抗体(18]。上述方法重要的是,这些只能测量表达水平但不活动。连续光谱光度测量的试验进展三步反应五个反应物的反应速率计算酶活性除了程序的复杂性(19,20.]。与[γ-32P] TLC测定三磷酸腺苷作为衬底和脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)产品,但必须调整原油提取相同的蛋白质浓度和有放射性21]。Enzyme-coupled分光光度分析被应用于分析动力学行为和量化NDPK从各种各样的动物,微生物,植物来源,但NDPK需要净化,需要大量的样本和辅助酶(22]。蓝色本地页面方法可以监视NDPK表达水平和活动,但其过程是复杂的(23]。因此,开发和验证一个降低成本和简化过程与高灵敏度测量NDPK活动是至关重要的。

NDPK的重要性被发现以来,酶动力学NDPK之前已经被研究过的24,25]。的的A和B亚型NDPK最丰富的成员在许多人体组织包括红细胞、不同动力学参数的NDPK-A或者NDPK-B各种核苷酸衬底在回顾总结了25]。此外,一个详细的瞬态动力学分析人类NDPK-A和NDPK-B也进行了研究的半反应NDPK-catalyzed磷酰基转移(26]。因为适当的温度、pH、离子强度是不轻易选择,最前面的动力学研究进行了纯化的酶。然而,NDPK-A和NDPK-B已经明确证明NDPK活动(27),纯化的酶动力学或重组NDPK可能不能反映实际的状态和属性。因此,迫切需要调查的性质和酶动力学NDPK内部环境。

在本文中,一个离子对梯度高效液相色谱(HPLC)分析方法验证的活动NDPK红细胞酶(主要是NDPK-A和NDPK-B),通过测量生成的脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)γ-phosphate转移反应。此外,NDPK属性和酶动力学的系统研究。最后,首次NDPK活动水平的频率分布是研究在健康受试者的红细胞,肾脏和肝脏移植受者在中国汉族人群。

方法

化学药品和试剂

标准化合物的脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP) dGDP, dGTP,肌苷(内部标准),1,4-Dithio-D / L-threitol(德勤),硫酸氢和四丁铵(TBAHS)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,美国)。甲醇和乙腈提供从默克公司(达姆施塔特,德国,HPLC-grade)。KH₂阿宝₄K₂HPO₄,MgCl₂,KOH购自国药控股化学试剂有限公司(上海,中国)。解决方案的德勤(30毫克/毫升)新实验之前就做好了准备。纯水超纯水抛光系统得到(中国成都)。

研究人群

健康受试者(卫生组织)和病人接受免疫抑制剂(环孢霉素和他克莫司)实体器官移植手术后(肾脏和肝脏)招募了2012年3月至6月的体检中心工会医院和同济医院器官移植中心、同济医科大学、华中科技大学(武汉,中国公关)。所有器官捐赠者(肾脏和肝脏)从事故和急诊检索和几个重症监护病房。捐赠资格筛选和测试并没有透露任何禁忌症移植。没有一个移植捐赠者来自脆弱人群和所有捐助者或近亲无偿提供书面知情同意。所有受试者参加本研究符合以下标准:

(1)他们的身体质量指数(BMI)是18.5到24.9公斤/米之间²

(2)他们的年龄从20到60岁不等

(3)他们在良好的健康由完整的体格检查,12导心电图(ecg),胸部x光片,和常规实验室检测,包括常规血液学、血液化学、验尿,和消极的怀孕测试。在移植受者的临床资料关于免疫抑制剂的剂量和持续时间的管理,药品不良反应,筛选和实验室数据评估的病人的医疗记录。这项协议是独立的伦理委员会批准,华中科技大学(许可证号码:2012 - s019、武汉、公关中国)。所有受试者被告知这项研究的临床实验的性质和签署知情同意之前,任何筛选过程。

核苷酸的制备标准和内部标准

股票的解决方案的核苷酸(dADP, dATP dGDP, dGTP)准备在超纯水的最终浓度10毫米(dADP和dGTP)和1毫米(dATP和dGDP)和存储在-20ºC。他们在超纯水稀释生成dADP工作方案(6毫米),dATP(0.26毫米),dGDP(0.25毫米),和dGTP(3毫米)。是制备超纯水的最终浓度1毫米和储存在4ºC。

红细胞溶解产物的制备

收集血液样本在EDTA管和准备取血样后6小时内通过在每分钟3000转离心(rpm) 10分钟,洗剩下的红细胞与同等容积的0.9%氯化钠两次。上层清液又立即丢弃和拥挤的红细胞被冻结在-80ºC,直到分析。测定NDPK活动,红细胞被稀释了19卷的磷酸钾缓冲(0.02米,pH值7.4)。

样品制备

NDPK的活动是衡量确定一个特定的数量三磷酸核苷酸(dGDP)生产磷酸的存在供体(dGTP)受体(dADP)耦合的系统。验证方法,以前描述的孵化条件稍微进行了修改(13]。简单地说,反应混合物中含有0.25毫米MgCl₂、0.1毫米德勤NH 270毫米₄H₂阿宝₄缓冲(pH值7.0)、0.1毫米dGTP dADP 0.2毫米,10μL稀释红细胞。孵化后37ºC与温柔摇5分钟,反应在100ºC停止加热10分钟。在冰上冷却后,加入10μL 1毫米,离心10分钟(10000 rpm)在热科学4ºC Sorvall传奇微21 r离心机(Osterode、德国),和随后的上层清液的稀释超纯水(1:1,v / v), 10-μL整除用于高效液相色谱分析检测波长为260 nm。NDPK活动计算每分钟每毫克nmol dGDP生成的Hb (nmol /分钟/ mgHb)。

色谱法

分离条件准备根据先前描述的方法(13]。dGDP的决心,补充在日本岛津公司LC-20AT突出高效液相色谱系统(日本岛津公司公司、东京、日本),由一个二进制泵(LC-20AT),自动取样器(SIL-20A)温控柱室(lgc - 1025 m),和PDA检测器(SPD-M20A)。样品被梯度洗脱分离在对称盾25ºC^TMRP₁₈列(3.9毫米×150毫米、5μm水域,美国)与pre-column(4.0毫米×10毫米,5μm,日本岛津公司,日本)。高效液相色谱操作设备和数据收集由LC-solution控制软件版本1.24(日本岛津公司、日本)。移动阶段包括溶剂(20毫米和5毫米TBAHS磷酸钾)和溶剂B(乙腈)。以下使用梯度:0到2.0分钟,6%到13%的B, 0.50毫升/分钟;2.0到7.0分钟,13% B, 0.50毫升/分钟;7.0到30.0分钟,13% B, 0.80毫升/分钟,10分钟跑后区间在6% B流量为0.50毫升/分钟,直到下一个样本注入。

方法验证

校准曲线与最终样品浓度的1.04,2.08,4.17,8.33,16.67,25.00,50.00μM dGDP每样300年准备μL没有添加dADP和dGTP反应混合物。连续的过程进行如上所述。校准曲线的峰面积比值由策划dGDP是反对dGDP浓度用于最小二乘线性回归分析。准确度和精密度进行了评估,评估QC样品的浓度(n = 6):低(2.92μM),中等(12.50μM),和高(41.67μM) dGDP每个样本,分别。量化的下限(LLOQ)确定最低浓度的校准曲线应该是可再生的,精度20%和120%到80的准确性。提取的效果dGDP测量通过比较峰值区域从稀释红细胞样品没有红细胞从样品准备。

标准储备溶液的稳定性存储在-20ºC, 1星期4ºC评估一式六份。dGDP的稳定在室温和4ºC内的混合物是由六个复制的QC样品做准备,这是24和72小时后立即注入高效液相色谱系统。此外,稳定的红细胞NDPK活动三个冻融循环后调查以及在冰上放置6小时后稳定。红细胞NDPK活动的稳定在-80ºC是研究样本的调查分析之前和之后的存储在-80ºC 3, 6和12个月。

酶动力学研究NDPK红细胞

孵化实验

选择合适的培养条件,生成之间的关系进行调查dGDP和NDPK数量从0.05到0.88 mgHb或孵化时间从1到30分钟或孵化温度从20到85ºC。所有实验进行了一式三份。

温度和pH稳定性分析

的温度和pH值稳定NDPK红细胞,新鲜的稀释红细胞被允许的地方2小时在不同温度范围从20到85ºC在水里洗澡,或反应混合物准备不同的最终pH值从4.0到9.0不等。所有实验进行了一式三份。

底物的依赖研究

确定衬底依赖10μL整除的稀释红细胞被添加到反应混合物与不同浓度的dADP(0.05 - -0.80毫米)在不同的固定dGTP浓度(0.025 - -0.40毫米),以及dGTP(0.025 - -0.40毫米)作为变量衬底和dADP将固定底物(0.05 - -0.80毫米),最后一卷300μL上面描述的相同的条件下。最初的速度都是化验在相同条件下根据前面描述的方法。所有实验进行了一式三份。初始速度测定的时间点不超过5%的基质被消耗。动力学参数,包括明显Michaelis-Menten常数(K_米)和酶反应的最大速度(V_马克斯),计算基于Michaelis-Menten用最小二乘回归方程。Lineweaver-Burk情节,也称为双重相反情节,来自最初的利率。

产物抑制研究

产物抑制研究不同固定浓度的dATP准备,从0.0到2.0毫米,随着产品抑制剂的存在各种dADP浓度从0.1到0.8毫米或各种dGTP浓度从0.05到0.4毫米。初始速度测量如上所述。所有的分析都是一式三份。

测定NDPK活动在人类红细胞在中国汉族人群

基于验证离子对梯度高效液相色谱法,测定红细胞中的NDPK活动500年实体器官移植受者(移植组),其中包括250例肾移植(肾组)和250年(肝组)移植的肝移植手术,和500年种族和地理位置匹配的健康受试者(卫生组织)。分析性别和年龄的影响NDPK活动,我们健康的人分为两组根据年龄性别和四组。同样,分析NDPK活动和疾病的免疫抑制剂的影响,不同的群体相互比较。都在重复的样本进行了分析。

统计分析

值作为意味着±SD或平均值(范围)中指定的结果。数据分布的方法测试Kolmogorov-Smirnov(钴)测试。为对比组的数据没有显示正态分布、非参数分析是由Mann-Whitney U测试。数据拟合和分析使用图垫Prism 5.0版本软件(美国圣地亚哥,CA)。统计学意义是定义为P < 0.05。

结果

色谱法

达到优化色谱分辨率、清晰度峰值和信号强度,各种流动相不同的pH值,列温度和几个梯度洗脱程序进行评估。优化的信用证条件是一个流动相组成的20毫米磷酸盐缓冲剂和5毫米TBAHS水梯度洗脱。在这种情况下,保留时间大约4.0,13.5,16.0,19.0,23.5分钟,dGDP, dADP, dGTP和dATP分别。所有感兴趣的化合物的峰没有其他干扰的山峰在红细胞

试验验证

酶催化的反应是专门NDPK,取决于两种基质的存在(dGTP和dADP)。在方法验证分析,校准曲线线性浓度范围的1.04到50.00的dGDPμM r²1.04 = 0.9998,LLOQμM (CV < 20%)。的CVs——天内不到5%在QC浓度(表1)。

表1。测定的精密度和准确度2年代;-deoxyguanosine-5’二磷酸(dGDP)在人类红细胞。

的平均精度(%)dGDP QC浓度分别为106.14,97.86,和95.00,分别为(n = 6)和100.36,98.04,和97.86,分别为(n = 18)。均值提取dGDP复苏(%)的质量浓度分别为100.49,99.68,和113.45,分别为(n = 6),与简历不到5%。提取复苏(%)的浓度16.7μM 97.65 CV不到5% (n = 18)。股票的标准解决方案dADP、dGDP dGTP, dATP至少1周保持稳定在-20ºC。的解决方案保持稳定至少4ºC。QC样品在室温下稳定24小时和72小时4ºC。NDPK活动水平稳定三个冻融循环后,在冰上放置6小时,存储在-80ºC至少1年。

酶动力学NDPK红细胞

孵化实验

dGDP生成之间的关系和Hb透露的线性增加dGDP代0.88 mgHb (r > 0.99) (图1一个)。为了节省红细胞的数量,确保反应效率,10μL稀释红细胞(相当于0.18 mgHb)选择测量NDPK活动。

生成的dGDP和培养时间的关系揭示了线性增加dGDP代20分钟的相关系数(r) > 0.99,然后略有增加(图1 b)为了节省时间,确保最佳的反应速率,5分钟孵化时间选择。

5所示(图1 c),生成的dGDP直孵化温度从20增加到40ºC,稍微增加从40到45ºC,然后用温度略有下降从55到80ºC。确保高活动和接近人体环境,孵化温度37ºC被选中。总之,最优培养条件选为1:20 10μL稀释红细胞在37ºC孵化5分钟。

热稳定性

NDPK活动提出的热稳定性图2一个。活动保持在30ºC 2小时的温度被认为是引用(100%)。高原发生在保温温度范围从30到45ºC与剩余活动率超过90%。剩余活动率降低到50%左右,当温度增加到55ºC。此外,几乎没有活动发现当温度增加到65 - 80ºC。

pH稳定性

的pH稳定性NDPK活动提出了图2 b。NDPK的酶活性明显增加,pH值范围从3.0到6.0,而酶活性略有下降与pH值从6.0增长到9.0。因此一个相对顶点最大活动形成6.0 pH值。同时,酶似乎不稳定的较低的pH值,而且几乎没有活动发现当pH值调整到3.0。因此,我们可以得出这样的结论:NDPK是在碱性环境中更加稳定。

底物的依赖

底物的依赖NDPK活动提出了图3,dADP的浓度和dGTP独立变化。提出了一系列平行线当策划初始速度的倒数与浓度的倒数dGTP dADP在不同浓度(图3一)。分析GraphPad棱镜的软件,他们的山坡上没有明显不同(P > 0.05)。基本上得到了类似的结果当策划的初始速度对互惠互惠dGTP dADP浓度在不同浓度(图3 c)。

此外,这些台词的拦截的改建图3一反对的倒数dGTP浓度显示线性关系(r > 0.99) (图3 b)。类似的结果提出了改建的1 /速度(1 / v)截获的平行线图3 c对互惠dADP浓度(图3 d)。x和y轴截距图3 b和图3 dK代表_米和V_马克斯。因此,K_米和V_马克斯dGTP被确定为1.94毫米和111.35 nmol /分钟/ mgHb,分别和K_米和V_马克斯dADP被确定为1.26毫米和111.41 nmol /分钟/ mgHb,分别。

此外,全球的双驱替机理的初始利率速度方程和速度方程进行顺序机制,表明数据符合最好的乒乓机制(28]。这些结果与红细胞NDPK反应的概念是乒乓机制。观察趋势朝着更高的价值明显的V_马克斯和K_米随着浓度的底物浓度的调查(0.025毫米到0.800毫米)。

产物抑制

产物抑制的研究,提出了一系列的融合线当策划初始速度的倒数与dADP浓度在不同浓度的倒数dATP所示图4一,这表明非竞争性抑制的典型模式。同时,竞争性抑制是获得产品dATP反应物dGTP表明dATP和dGTP相互竞争相同的形式和结合位点的酶图4 b。随着浓度的增加dATP(0.0到2.0毫米),V_马克斯与常数K dADP下降_米和K_米V dGTP增加的常数_马克斯。

频率分布的NDPK活动水平在中国汉族人群

研究人口的一般特征评估。所列的表2。

表2。中国健康受试者和移植受者的特点

三组有类似的平均年龄(40.38±9.47年健康组,39.98±10.37年肝脏肾脏组和42.96±9.31年的集团),分别,以及类似的男性性别比例(70.2%健康组,70.8%肾组织,70.4%,肝组织,分别)无显著差异(P > 0.05)。此外,柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验分析,在所有组的受试者的年龄正态分布(P = 0.20)。

NDPK活动水平在每组的红细胞使用验证离子对梯度高效液相色谱测定方法。NDPK活动水平范围从1.50到7.87 (±SD: 3.16±0.80;中位数:3.01 nmol /分钟/ mgHb健康组和1.13到7.71 (3.19±0.67;中位数:3.14 nmol /分钟/ mgHb移植组,分别。此外,NDPK活动水平范围从1.14到7.71 (3.10±0.72;值:3.10 nmol /分钟/ mgHb肾组,和范围从1.13到5.06 (3.28±0.61;值:3.17 nmol /分钟/ mgHb肝组,分别。此外,NDPK活动水平在人类红细胞的所有组我们不是正态分布(P < 0.05, (图5)与非参数(Mann-Whitney)测试分析,NDPK活动之间的健康组和移植组明显不同(P < 0.05)。重要的是,有显著性差异(P < 0.001) NDPK肾组和肝组之间的活动。

评估NDPK活动水平是否相关的性别或年龄、男女根据年龄被分为四组,也就是说,年龄1(为20 - 29年),2岁(30—39年),3岁(40至49岁)和年龄4(50 - 60岁)。然而,非参数测试分析,没有年龄之间的显著差异,女性和男性在四个组之间无显著差异(P > 0.05)。

讨论

我们的分析提出了一个可行的方法来确定NDPK活动在人类红细胞生成通过测量dGDP与dGTPγ-phosphate转移反应和dADP作为底物。这是值得注意的方法有点不同于以前的方法(13),NDPK活动是通过测量得到的产品dATP金额计算。第一次,本研究另一个产品成功用于计算dGDP NDPK活动在人类红细胞。通过验证分析,这种离子对梯度高效液相色谱方法有很好的线性,选择性、专一性、精度、准确性、复苏,稳定,可用于常规临床实践的病人评估治疗疗效和不良反应。

作为一个方便的组织,红细胞被认为跟高浓度的可溶性NDPK尤其是NDPK-A和NDPK-B,和完全释放,减少破坏在提取过程29日]。然而,细胞核苷酸在红细胞内稳态可能与其他细胞在血管很大的不同。因此,任何变化红血球的NDPK可能不是必然伴随着类似酶的变化,在血管内皮或造血细胞,反之亦然。

与前面提到的方法不同,NDPK活动以这种方法显著的混合物NDPK-A和NDPK-B红细胞而非纯化单体的原因很多。首先,我们的主要目的是确定NDPK活动体内深造thiopurines药理学和不利影响。其次,四个同功酶显示提供了类似的动力学参数(27]。最后,它测量的有效活动而不是表达水平可以更好地反映参与thiopurines新陈代谢。值得注意以及主要的细胞内定位,某些部分催化地活跃NDPK也可以表达在细胞表面(30.,31日),也自由循环血液中的可溶性酶(32]。

人类红细胞NDPK被确认在高浓度。我们的研究表明,人类红细胞有足够NDPK dATP催化合成。这些发现符合观察从其他实验室,哺乳动物的红细胞有显著的能力合成核苷酸(29日]。它应该是值得注意的,在目前的研究中,NDPK活动决定人类红细胞应被视为近似值,因为红细胞含有大量的atp酶活性,降低可靠性(29日]。此外,可能还有其他的酶能够磷酸化的核苷二磷酸如丙酮酸激酶、肌酸激酶、磷酸甘油酸酯激酶,丁二酰-激酶、磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase和adenylosuccinate合成酶(33,34]。然而,很明显,红细胞NDPK活动是10倍比其他酶的活动多磷酸盐核苷酸和核酸合成的途径29日]。

在目前的研究中,根据热稳定性的结果,一个高原发生在保温温度范围从30到45ºC,显示稳定的混合物NDPKs的温度范围内。然而,几乎没有活动时检测到的温度增加到65 - 80ºC。根据之前的报道,NDPK-A NDPK-B是非常不稳定的热处理和60 - 65ºC, NDPK-C 85ºC, NDPK-D高度不稳定对热灭活在50% pre-incubation 40ºC [35]。结论可以得出,我们的方法测量主要的活动NDPK-A NDPK-B,符合以前的报告(35]。

pH值的基础上稳定的结果,NDPK酶稳定当pH值范围从6.0到9.0,从5.0到3.0不稳定。它不跌至活动当pH值下降到3.0。这一现象表明,NDPK酶稳定在碱性环境中首先报道,在人体内部环境的一致性。

Bisubstrate酶催化反应机制可分为三种类型,顺序命令机制,顺序随机机制,和乒乓机制。初始速率方程顺序命令和顺序随机反应机制非常相似。然而,由于没有包含互惠的基质浓度,乒乓球的初始速率方程反应机理有很大不同。图形化,双倒数情节bisubstrate顺序命令或顺序随机机制是一个家庭的直线相交纵轴在不同的点。

然而,乒乓机制导致双倒数的家庭平行线,而不是交叉线(36]。在目前的研究中,获得互惠块数据在初始速度的研究中,与dADP变量衬底和dGTP固定底物的变化,产生了一系列平行线。基本上得到了类似的结果当dADP取代dGTP将固定底物。因此,这些发现符合乒乓球反应机理。

一致,Lineweaver-Burk情节,竞争性抑制线相交于一个单点的轴,说明这类抑制剂不影响V_马克斯。类似地,非竞争性抑制线相交于一个单点的轴,显示这些抑制剂不影响K_米。在目前的研究中,es动力学分析表明NDPK酶的底物的依赖,和产品dATP抑制的研究表明,一个典型的模式为dGTP dADP和竞争性抑制,非竞争性抑制透露“乒乓球”机制的NDPK Mourad的一致性研究。Mourad [29日)使用丙酮kinase-lactic脱氢酶耦合分析和耦合hexokinase-glucose-6-P脱氢酶测定研究NDPK动力学包括底物特异性、初始速度和核苷5 ' -monophosphates抑制。

在目前的研究中,使用验证离子对梯度高效液相色谱方法,我们报道,第一次的频率分布NDPK活动水平在1000年中国汉族人口,其中包括500实体器官移植受者和500种族和地理与健康受试者。在本研究人群,NDPK活动水平具有分散的范围从1.13到7.87 nmol /分钟/ mgHb和显示偏态分布在人口和每个子群。此外,病例和控制组织有相似的人口统计特征(性别、年龄、吸烟和饮酒),健康组和移植组之间的NDPK活动水平显示显著差异,提出疾病或免疫抑制的可能改变NDPK活动。同时,肾脏组和肝组之间的活动水平显示显著差异,表明不同的疾病也可能改变NDPK活动课程。在进一步的研究中,我们将获得详细的信息在底层主要肾脏或肝脏疾病患者的移植,而照明协会分析NDPK活动对肾脏或肝脏疾病的因素,如炎症和自身免疫性疾病。此外,它是非常重要和必要的结论的具体贡献免疫抑制剂在NDPK活动的水平。迫切需要进一步的基因功能的研究来证实和澄清这些初步数据。重要的是,本研究将提供一个基础进一步功能研究,以揭示的生物学和分子功能NDPK活动实体器官移植。

结论

总之,NDPK酶动力学研究表明基质NDPK依赖性和“乒乓球”生产抑制的机制。我们所知,这是第一个报告,NDPK活动水平同时在健康受试者和实体器官移植受者评估在中国汉族人群。重要的是,NDPK活动水平揭示了7倍可变性和我们不是正态分布在人类研究中红细胞数量。越高NDPK活动被发现在移植受者与健康受试者相比,这可能会影响免疫抑制剂的管理或疾病。然而,进一步的调查需要澄清这个问题。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(批准号81273591)。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突

引用

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