Enzyme-assisted从石榴多酚的提取石榴皮

文摘

摘要目的:本研究探讨enzyme-assisted复苏的多酚类物质从石榴皮使用multi-response优化过程。方法:酶预处理因素(酶剂量、培养时间、温度和pH值)优化了提取产量、总酚浓度(TPC)自由基清除能力(RSC)和trolox等效抗氧化能力(问题)。结果:预处理的石榴皮3.8%的鸡尾酒酶6.7 pH值和41ºC 85分钟生产质量产量为65.89±2.64克/ 100克原油提取(3成倍增加与传统的溶剂萃取相比)总酚类化合物浓度为277.93±6.17毫克GAE / g干重,398.70±3.06μmol trolox等价/ g和73.15±0.69μg /毫升激进淬火能力(IC50)。结论:酶预处理改善从石榴皮多酚的提取效率。

关键字

石榴皮多酚,提取、抗氧化剂,酶预处理。

介绍

石榴(石榴)是一个重要的直接消费水果和果汁提取。石榴皮(石榴皮)构成了超过40%的水果和是一个有价值的来源抗氧化剂(1]。从石榴多酚与许多健康方面的好处包括作用,抗氧化,抗微生物剂,抗炎药,anti-proliferative代理,脂肪酶抑制剂,抑制α-glycosidase [2- - - - - -4]。事实上,石榴皮抗氧化剂被检查作为食品加工和保存的天然成分3]。

试图提高从石榴皮多酚抗氧化剂的提取性最近描述涉及各种溶剂(5,6),超声波辅助提取(7- - - - - -10]或微波辅助萃取(11]。优化调查表明,萃取动力学和效率可能受影响的溶剂的选择、提取时间、温度、皮颗粒大小(8,10,12- - - - - -15]。

在以往的研究中,目前团队成功地优化酶从sweet-lime资助建设提取茶多酚16,西瓜17),还研究了super-fluid提取石榴皮(18]。目前,酶的作用pre-digestion从石榴皮多酚的提取性并没有被报道。本文研究的目标是评估enzyme-assisted从石榴皮多酚的溶剂萃取(缓解)和高效液相色谱法的主要组件,和程度的抗氧化活性。结果评价包括提取产量、总酚浓度(TPC),自由基清除能力(RSC)和Trolox等效抗氧化能力(问题)。

方法和材料

材料和化学物质

石榴皮”Tarnab Gulabi“生态型收集从本地汁处理器在巴基斯坦,用蒸馏水冲洗,干燥环境条件下(35ºC)。样本加工成0.5毫米直径的同质粉末和装进密封袋。所使用的酶制剂包含多种纤维素酶、果胶酶和蛋白酶如前所述[18]。试剂包括2 2-azino-bis——(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic酸)di-ammonium盐(abt), 2, 2-diphenyl-1 - (2, 4, 6 - trinitrophenyl) hydrazyl自由基(DPPH) 6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-carboxylic酸(Trolox) Folin-Ciocalteu试剂(货代),和2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol(二叔丁基对甲酚)和酚酸包括3、4-dihydroxy苯甲酸,对羟基苯甲酸,高卢,亚麻油酸,香荚兰、咖啡p-coumaric,阿魏,syringic和芥子酸从σ购买,圣路易斯(美国)。铵硫氰酸盐,过硫酸钾,亚铁氰化钾,碳酸钠,醋酸由默克公司(达姆施塔特,德国)。超纯去离子水Milli-Q +系统(美国微孔,贝德福德,MA)而96孔酶标使用的费舍尔科学(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)。

实验设计

初步筛选实验建立酶(EC)浓度,温度(T)、孵化时间(T)和pH值影响石榴皮分解和多酚的解放。因素进一步调查的轴向(8分)和阶乘(8分)水平(-α1 + 1,+α)在旋转中心组合设计(α= 1.82)表示表1。五个复制运行中心点(α= 0)估计的主要影响和错误。反应包括提取收益率(收益),总酚类化合物浓度(TPC) trolox等效抗氧化能力(问题)和DPPH自由基清除能力模型使用一个二阶多项式方程使用统计软件设计专家(版本10)。

表1。酶预处理条件(实际和编码)和相应的调查观察到的反应;编码值“0”、“+ 1”和“+,-”表示中心轴和阶乘点分别K, L, M和N是反应以g / 100 g, mgGAE / g,µmol TE / g和µg /毫升(IC₅₀)。

Y和响应优化角度在哪里,拦截(b),线性效应变量(bX),二次效应(bX吗²)和交互(整体)

提取过程

酶辅助溶剂萃取(缓解),5 g的石榴皮混合10毫升的缓冲所需的pH值和混合酶条件下如前所述表1。合成混合物加热在90ºC停用酶鸡尾酒。比较,相同数量的石榴皮粉是稀释10毫升磷酸盐缓冲剂的pH值7,孵化120分钟的37°C。解放了多酚类物质被收集的震动与80%含水乙醇轨道振动器(英国Gallenkamp) 1小时。所有获得的提取物都集中使用一个旋转蒸发器(EYELA、n n系列、日本东京)减压。干提取量体重,计算百分比产量和储存在4°C到用于分析。

总酚类化合物浓度(TPC)

TPC评估使用Folin-Ciocalteu试剂(19与修改)。短暂、5毫克提取和各种浓度的没食子酸(10 - 200 ppm)分别与1.5 mL去离子水和混合处理50μL 20% Folin-Ciocalteu试剂。20%的整除涨跌互现300μL碳酸钠(w / v),孵化20分钟40ºC,在冰浴冷却以及部分(200μL)被转移到96板。吸光度测量在755 nm使用96板的读者(Biotek - mqx - 200, Biotek,高地公园,美国)。各种没食子酸浓度的吸光度绘制校准曲线(R²= 0.9986)和酚醛内容被计算为毫克没食子酸当量(mg GAE) / g的石榴皮提取物。

酚类化合物的高效液相色谱分析

产物提取石榴皮的分析与修改(如前所述20.使用二极管阵列检测器(RP-HPLC-DAD)]。短暂,50毫克的粗提物溶解在5毫升的酸化甲醇(1%盐酸v / v),和回流95ºC 90分钟。二叔丁基对甲酚(0.5毫克/毫升)作为防腐剂添加了抗氧化剂。最终的解决方案是在5000转离心10分钟;上层是用5分钟去除气泡。提取通过0.45μm(微孔)过滤和接受

使用Shimdadzu LC-10A高效液相色谱系统,配备了一个爸爸(爸爸G1315B)探测器和Shim-Pack CLC-ODS C-18列(250×4.6毫米;5μ粒度;默克公司达姆施塔特,德国)。两种溶剂(A和B)用于梯度洗脱。溶剂(94:6 v / s water-acetic酸混合物)和溶剂B(乙腈,100%)。溶剂洗脱图涉及一个梯度0-15分钟15% B, B和B . 30 - 45分钟100%的峰值15 - 30分钟45%洗脱监控在280 nm和量化使用CSW32 (dataapex)色谱站/数据处理软件。

DPPH•清除试验

之前报道的自由基清除实验(21)是修改为了使它适用在微观层面。短暂,110μL 1000、100、10和100 ppm提取混合了μL刚做好的DPPH的解决方案(1000 ppm) 96孔板。板块在35°C孵化了15分钟,然后吸光度(A)为517 nm使用96板读者(Biotek - mqx - 200, Biotek,高地公园,美国)。

half-maximal抑制剂量的提取(IC₅₀)获得一块抑制百分比诗句各种浓度的石榴皮提取物。

Trolox等效抗氧化能力分析(问题)

提取物的抗氧化潜力评估的问题后,先前描述的方法(16]。Trolox作为积极控制和抗氧化潜力表示为μmol Trolox / g的石榴皮提取物。

统计分析

分析实验设计为每个反应是使用设计专家(stat容易版本10日,Inc .,明尼阿波利斯,美国)调查酶浓度的影响,温度、培养时间、pH值和它们之间的交互。方差分析(方差分析)应用于屏幕显著(p < 0.05),与(p > 0.05)。进行方差分析后,非重要条款被删除从二阶多项式方程的准确性。从这些精致的方程,三维(3 d)响应表面绘制说明并讨论任何两个因素之间的交互作用。同样,某些其他测试(缺乏合适、变异系数和系数的决心)也观察充分性评估模型。最后,验证实验来验证统计实验设计的有效性。

结果和讨论

模型适当检查

初步调查表明,鸡尾酒治疗酶混合物包括多种纤维素酶、果胶酶和蛋白酶(50:25:25)改进的重量可抽出的原料皮(提取收益率)比其他酶配方。进一步的调查被扩展的阶乘(编码值1和+ 1)和轴向点(编码值-α和+α)可旋转中心合成设计得到洞察交互和二次预处理的影响参数(表1)。的一个可靠的方法来检查健身应用模型方差分析(方差分析)。方差分析比较变化由于治疗条件的变化与变异由不确定的错误。一个概率p值< 0.05表明,应用设计符合得很好。

健康检查模型的另一种方法是使用一个“缺乏适合”测试。十分显著(p > 0.05)缺乏合适的概率(表2)是一个迹象表明,选择的模型拟合给定的实验条件。变异系数较低(CVs)值的0.97 - 3.35%的验证结果是可靠的和可再生的22]。因此,所有的反应包括提取产量、TPC,问题和RSC生成的多元回归模型。参数(EC, T, pH值和T)或传授他们的交互与(p < 0.05)影响是删除从最后修改方程(1 - 4)。条款有积极的迹象显著(p < 0.05)提高了反应(提取产量、TPC、问题和RSC)条款随后负号导致减少在特定的反应;在下面的关系表达=酶浓度,B =温度,C =反应时间、pH值D =反应。

表2。方差分析(方差分析)产量和总酚类化合物浓度石榴皮* (p)值的概率< 005显示统计学意义而言,TPC =总酚类化合物的浓度。

大确定系数(R2),观察提取收益率(0.9766),TPC(0.9978),问题(0.9976)和DPPH(0.9939)表明,选择模型适合在特定实验条件下的响应。同样,调整R2大于95%(0.95)确认好协议预言与观测值之间的反应。多元回归方程(1 - 4)给有趣的细节独立变量的影响可以看到的大小和符号(+ ve或负)系数。例如,交互条款BC(温度x时间),CD(时间x pH值)曾预测对提取率和产生负面影响表2显示这样的相互作用将显著(P < 0.05)。注意,其他可能的交互条款(AB、交流和广告)预计微不足道的对萃取率的影响(表2),因此不会出现在方程(1)。

酶浓度的影响(EC;一)

组装结果的方差分析(表2和3)和多元回归方程(1 - 4)很明显,EC(方程1)术语“A”有显著(p < 0.05)的积极影响对提取产量而降低抗氧化提取物质量(TPC、问题和DPPH);类似的交互之前(23]。之间的交互EC和温度、pH值和孵化时间表示使用三维图(图1)。图1一个是块提取收益率(g / 100克)与EC和温度的变化,同时保持其他两个参数(培养时间和pH值)在最可行的水平。很明显从图1一个和1 bEC高达3.5%,温度等于45‹šC和孵化时间65分钟大幅增加提取产量进一步提高在这些参数并没有导致并行效果。

表3。方差分析(方差分析)问题值石榴皮提取物。

温度的影响(B)

概率列(表2和3)表明,线性温度(B)的影响显著(p < 0.05)对提取产量和TPC但不是对问题和DPPH。这一趋势表明,结构和酶的活性对温度很敏感。然而,解放了多酚类物质的抗氧化能力不受温度影响,即45 - 70°C (24]。有趣的是,温度交互与其他参数(cf。公元前和BD,英航和BD, BC和BD,英航和双相障碍表2和3)预测(p < 0.05)影响提取产量、TPC、问题和DPPH。合作体现了大幅边坡三维块提取收益率(g / 100克),EC和温度高达50ºC (图1一个)。有趣的是,高原图1 d50岁和1 eºC表示,温度升高会降低提取收益率。类似的行为为其他TPC已经预测,问题和DPPH(方程3和4)。

pH值和培养时间的影响

pH值(D)和培养时间的影响(C)对多酚类物质及其抗氧化特性的解放可以很容易地估计的方差分析数据(表2和3)和随后的多重回归方程(1 - 4)。显著影响的pH值和观察培养时间(p < 0.05)的反应调查除了DPPH自由基清除能力。的大幅曲率图1 e和1 f透露,pH值主要控制多酚的解放。轻微的pH值低于或高于6.5的转变产生了显著降低提取收益率可能因为酶对pH值变化非常敏感25]。在图1 d和1 f,进一步延长培养时间超出了58分钟没有改善提取收益率。多元回归方程(1 - 4)表明孵化时间(C)影响所有响应积极但pH值的影响可能是积极的还是消极的。同样,二次效应引起的这些参数减少观察反应。

优化的条件及其验证

在所有观察到的结果显示差异预测集的反应条件。例如,酶浓度的增加(EC)改进提取产量但反向影响抗氧化行为。温和的酸性条件保留抗氧化特性(方程式。1 - 4),但提取收益率下降。这些证据需求另一种优化方法生产最优提取收益率与大量的总酚含量和足够的水平在体外抗氧化能力。

在目前的情况下,所有的反应都设置为最大化但DPPH抑制的值设置为最小化(IC₅₀)。高期望的合成解决方案(0.9)一直在策划图2和2 b。中央轮廓(愿望> 0.9)表明最合适的实验条件可以产生好的数量的石榴皮提取物在不影响酚醛树脂和抗氧化剂的水平字符(图3)。总的来说,解决方案以最大的愿望(0.9)预测预处理的石榴皮3.8%的酶鸡尾酒pH值在6.7和49ºC 85分钟会产生67.44克/ 100克含297毫克的石榴皮提取物GAE / g (~ 29% w / w)总多酚394μmol TE / g和7365μg /毫升RSC (IC₅₀)。

一套新的实验来验证最优条件和观测结果(表4)在这种情况下,验证了模型预测的最优条件是内联同意实际观察到的结果。与传统的溶剂萃取相比轻松提取收率提高了三倍半(表4)以及总酚含量和abt激进淬火的价值。然而,激进的淬火活动缓解样本以减少集成电路₅₀(DPPH浓度,抑制了50%)。

表4。验证实验的细节与最理想的缓解为石榴皮多酚萃取实验条件;反应观察,大写字母表达(K) g / 100 g, mgGAE / g (L), (M)μmol TE / g (N)μg /毫升(IC₅₀)。

石榴提取物的组成

分析RP-HPLC-DAD数据显示(表5)的存在范围的酚类成分类似于其他地方描述(18)值得注意的是,香草酸、阿魏酸、绿原酸和Syringic酸。绿原酸(一种强有力的抗糖尿病的)、阿魏和香草酸(抗癌和化疗预防)证实石榴皮提取物可能是一个来源的酚酸值添加在食品和制药行业2- - - - - -4]。

表5所示。酚醛树脂化合物经过身份验证的石榴皮提取物得到缓解;ND:没有检测到

结论

本文提供了一个全面洞察multi-response优化酶辅助溶剂萃取(减轻)的抗氧化剂酚醛树脂从石榴皮(石榴皮)。这是观察到酶浓度的增加可以提高提取产量、总酚类提取的内容,表达了对于abt自由基淬特征。HPLC-DAD分析披露的存在酚醛酸主要组件和验证优化酶预处理不恶化或降低宪法酚醛树脂。

确认

目前的工作是部分由巴基斯坦高等教育委员会在本土博士奖学金计划。加州大学戴维斯分校奖学金某人是承认的。

引用

1. Nasr CB, et al。石榴皮多酚含量的定量测定。Zeitschrift毛皮Lebensmittel-Untersuchung大幅减退和1996;203:374 - 378。
2. 法的生物活性和Calhau c .石榴:对健康和疾病的影响。关键评论2011年雷竞技苹果下载食品科学与营养;51:626 - 634。
3. Tanveer,。,et al. Pomegranate Extracts: A natural preventive measure against spoilage and pathogenic microorganisms. Food Reviews International 2015; 31:29-51.
4. 说明年代,et al .石榴皮和皮提取物:化学和食品特性。食品化学2015;174:417 - 425。
5. Negi PS, et al。石榴皮提取物的抗氧化和抗诱变因素的活动。食品化学2003;80:393 - 397。
6. Masci, et al .评估不同的萃取方法从石榴整个水果或皮和多酚的抗氧化和抗增殖活动分数。食品化学2016;202:59 - 69。
7. 潘Z, et al .连续和脉冲ultrasound-assisted从石榴皮提取物的抗氧化剂。超声波声化学2011;18:1249 - 1257。
8. 所以Tabaraki R, et al。优化超声辅助提取石榴皮(石榴l .)抗氧化剂通过响应面方法。分离和纯化技术2013;98:16-23。
9. Kaderides K, et al。过程将石榴皮变成有价值的食品原料使用ultrasound-assisted提取和封装。创新食品科学和新兴技术2015;31:204 - 215。
10. Moorthy搞笑等al.Response表面优化超声波辅助提取石榴皮的果胶。国际生物大分子杂志2015;72:1323 - 1328。
11. 郑X, et al .微波萃取和从石榴皮总酚类化合物的抗氧化活性。《药用植物Research2011;5:1004 - 1011。
12. 瞿W, et al。从石榴皮含有花青素的萃取动力学和属性。国际食品工程杂志2014;10:683 - 695。
13. 凸轮M和冰冷的数控。酚醛树脂的石榴皮:提取优化中心合成设计和α-葡糖苷酶抑制的潜力。食品科学杂志和Technology-Mysore 2015;52:1489 - 1497。
14. Sood和M Gupta。石榴皮中生物活性化合物的提取工艺优化。食品生物科学,2015;12:100 - 106。
15. 齐米M等al.Optimization酚醛树脂的脉冲ultrasound-assisted技术提取石榴皮叶品种:Punicalagin和羟基酸。食品化学2016;206:156 - 166。
16. Mushtaq M, et al .优化enzyme-assisted重新估算价值的甜石灰(柑橘limetta risso)皮酚类抗氧化剂。生物2014;9:6153 - 6165。
17. Mushtaq M,等。基于RSM优化enzyme-assisted提取抗氧化剂酚醛树脂从充分利用西瓜(Citrullus lanatus研究)皮。J食品SciTechnol 2015;52:5048 - 5056。
18. Mushtaq M, et al . Enzyme-assisted超临界流体提取石榴皮的酚类抗氧化剂。2015年《超临界流体;104:122 - 131。
19. 总酚类的单例六世,等。分析和其他氧化基质和抗氧化剂通过Folin-Ciocalteu试剂,在氧化剂和抗氧化剂Pt a . 1999;152 - 178。
20. Aaby K, et al。描述草莓中酚类化合物(草莓属×ananassa)水果不同的液相色谱检测器和贡献的单个化合物总抗氧化能力。农业与食品化学杂志》2007;55:4395 - 4406。
21. Kedare某人和辛格r . DPPH的起源和发展的抗氧化测定方法。食品科学与技术杂志》2011;48:412 - 422。
22. 只要BD和崔KK。一个新的可靠性优化设计响应面方法。电脑&结构2004;82:241 - 256。
23. 李BB,等。从柑橘皮提取酚醛树脂:II。Enzyme-assisted提取方法。分离和纯化技术2006;48:189 - 196。
24. Arabshahi DS,等。抗氧化活性评价的一些植物提取物及其热、pH值和储存稳定性。食品化学2007;100:1100 - 1105。
25. Ramirez-Coutino L, et al . pH值的影响在生产几丁质(甲壳素)消化酶的Verticillium fungicola在水下文化中生物资源技术2010;101:9236 - 9240