柑桔花作为鱼类水解产物蛋白酶新来源的评价

摘要

由于蛋白酶在植物生理学、治疗和生物技术过程中的潜在应用方面的重要作用，从几种非传统植物来源中筛选蛋白酶在研究、医药和食品加工中越来越重要。柑桔花中含有高浓度的蛋白酶，并对其作为一种新的蛋白酶来源用于鱼类水解产物生产的潜力进行了评价。采用SDSPAGE法测定pH(4,7和9)和柑桔蛋白酶(CPs)浓度(2.5和5% E/S)对罗非鱼(Oreochromis sp.)肌肉蛋白质水解的影响。在不同的pH下观察到不同的蛋白质降解模式。在pH为4时，使用5.0% CPs浓度(E/S)在50°C水解2小时后，观察到对鱼肌蛋白的非特异性更高的蛋白质降解，生成低分子量(<10 kDa)的多肽。在中性pH下，CPs优先水解肌原纤维蛋白(肌球蛋白和肌动蛋白)，释放约31和10 kDa的肽片段。在pH值9时观察到的降解蛋白模式较弱。在不同水解条件下观察到的罗非鱼肌肉蛋白的不同降解模式，为利用柑橘花CPs生产蛋白质水解物作为功能成分和/或生物活性肽提供了可能性。

关键字

采购产品生物活性肽，蛋白质水解物，多肽酶，植物蛋白酶，功能特性，鱼类水解物。

简介

植物是人类和动物公认的营养食物来源。如今，更多非传统的植物来源被包括在我们的饮食中，因为它们含有宝贵的必需营养素，食用后对健康有益。此外，功能分子，如酶，可以被分离出来，并用作生物工艺过程中的加工助剂[1-4］．在植物中，就像在所有生物中一样，不同的酶自然存在，在不同的生物过程中发挥着重要作用。植物的某些部分(例如叶子、花、根、种子和果实)含有高浓度的蛋白酶，在新的植物来源中筛选它们的存在在研究、医药和食品工业中越来越重要[4］．蛋白酶在一些工业过程中被用作加工助剂，目前占酶全球销售额的60%以上[5］．蛋白酶在食品加工中最常见的应用包括奶酪生产、肉类嫩化和蛋白质水解产物生产。酶法水解蛋白质被认为是一种很有前途的方法，可用于修饰或增强食品蛋白质的溶解性、乳化性、起泡性等功能特性。6］．

一些鱼类，如鲑鱼(Salmo salar)、太平洋白鳕(Merluccius产品)、鲭鱼(Scomber austria)和罗非鱼(Oreochromis sp.)，已被用于生产具有功能性或生物活性的蛋白质水解物[7-9］．酶法水解蛋白质涉及多种条件的选择，如酶类型、酶/底物(E/S)比、pH值、温度和水解度(DH)。此外，所使用的蛋白酶类型是决定水解产物性质和确定其作为功能成分或生物活性化合物用途的最重要参数之一。常用来生产蛋白质水解物的商业蛋白酶包括Alcalase、flavourase、Neutrase和proteamex，这些蛋白酶主要是由选定的曲霉菌和芽孢杆菌菌株发酵而成[5］．有关使用植物蛋白酶生产水解产物的信息仍然很少，或仅限于木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和菲辛的使用[9，10］．

我们实验室之前的研究报告称，柑橘植物是蛋白酶的一种新来源，在生物技术过程中具有潜在用途(例如，蛋白质水解产物的生产)[4］．因此，本研究目的是通过SDS-PAGE分析不同水解条件(pH和E/S比)下从柑橘花中提取的柑橘蛋白酶(CPs)对罗非鱼肌肉蛋白的作用，以确定CPs在鱼类蛋白水解物生产中的潜在应用。

材料与方法

柑桔花蛋白酶提取物的制备

柑桔花蛋白酶(CPs)提取物是通过将一份来自酸橙树(Citrus aurantium)的干花与10份冷缓冲液(Tris-HCl 0.02M, pH 7.0) (w/v)混合，使用450-10型Oster搅拌机(Sumbeam Mexicana SA de CV，墨西哥)获得的。使用奶酪布过滤均质液，并在4°C下以7000 × g / 30分钟的速度离心，使用型号为D-375的台式离心机(德国赛默飞世尔科学公司)。CPs提取物冷藏(4°C)并于当天使用。

蛋白定量

使用DC蛋白测定试剂盒(Biorad Laboratories, Hercules, CA)测定CPs提取物中的蛋白质含量。使用OPSYS MR酶标仪(DYNEX Technologies, USA)和牛血清白蛋白(BSA)作为标准，记录590nm处的吸光度。

蛋白水解活性测定

蛋白水解活性采用Kunitz法测定。11以牛血清白蛋白(BSA)、血红蛋白、酪蛋白、偶氮白蛋白和偶氮白蛋白为底物。简单地，将450 μL 1 g/100 μL蛋白底物溶液(100 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0或50 mmol/L乙酸钠，pH 4.0)与50 μL花提物混合，在50℃下孵育60 min，孵育结束后，加入500 μL 50 g/L三氯乙酸(TCA)停止反应。对照样品以同样的方法制备，但在孵育前加入TCA，并在冰中保存相同的时间。将混合物进行涡流处理(Mini VortexMV 1)，放置在冰上30分钟，并使用5417R型Eppendorf离心机以20,800xg的速度离心20分钟。使用Cary 50Bio分光光度计(Varian, Palo Alto, CA, USA)在280nm(偶氮蛋白为440nm)处测量光密度(OD)。一个单位的酶活性(U)定义为在所述条件下使吸光度增加一个单位的蛋白质量。

鱼蛋白水解产物的生产

罗非鱼(Oreochromis sp.)从当地鱼市获得单独真空密封的冷冻鱼片。将解冻的鱼片切碎，在95°C下用体积(w/v)的去离子水均质。均质肌肉在95°C下保持15分钟，以灭活内源性鱼肌肉蛋白酶。然后，将样品浸泡在冰水中冷却。样品分别用2M HCl或NaOH在pH 4.0、7.0和9.0进行调整。样品加热至50°C, CPs提取物加入到最终浓度为2.5或5.0% (E/S)的蛋白质水解。为了监测水解过程，在0、30、60、120和240分钟收集样品，并立即在100℃下加热15分钟以使CPs失活。最后，将样品置于冰水浴中冷却并准备SDS-PAGE分析。

sds - page分析

在本分析中，将水解的鱼类样品溶解在9体积(w/v) 5.0% SDS溶液(含0.1% 2-巯基乙醇)中，并使用振动水浴在80°C下加热15分钟。然后在室温(25℃)下，以5000 × g离心15 min。SDS-PAGE分析采用Laemmli [12]按照Shamloo描述的程序[8]，使用15%的聚丙烯酰胺分离凝胶。

结果与讨论

柑桔花提取物的蛋白酶在较宽的pH值范围内具有活性，这表明存在不同类型的蛋白酶。柑橘蛋白酶(CPs)能够在不同程度上降解不同的蛋白质底物[4］．在不同的蛋白质底物和pH条件下，CPs提取物的总蛋白水解活性显示在表1，支持蛋白质活性取决于所评估的蛋白质底物和pH条件。为了评价CPs提取物用于鱼类水解产物生产的潜力，对罗非鱼肌肉进行了不同条件下的水解。如图1，随着培养时间的增加，肌肉蛋白逐渐降解。正如预期的那样，增加酶浓度(从2.5到5%)，观察到更高的蛋白质降解。所用蛋白酶的浓度和类型决定了水解的程度以及所产生肽的特性。非特异性蛋白水解活性会产生短肽片段，这些短肽片段可能会对所产生的水解物的某些功能特性产生负面影响[13］．然而，一些小肽可以显示某些生物学特性，可以显示对消费者健康的有益影响，使其能够在医药和食品工业等领域使用[9，14］．在本研究中，在不同pH下CPs孵育的样品中观察到不同的蛋白质降解模式。在酸性条件下(pH 4.0)，观察到主要鱼类肌肉蛋白质的广泛蛋白质降解模式，表明CPs在此条件下具有高度的蛋白水解性(图1一个而且D)．先前有报道称，在pH值为4时CPs具有较高的蛋白水解活性[4］．在此条件下，CPs释放出低于10 kDa的低分子量蛋白片段(SDS-PAGE中可见为涂片区)，属于大部分肌肉蛋白的降解(图1一个而且D)．由于生物活性肽在高血压、肥胖、糖尿病、癌症等健康问题上的有益作用，在不同蛋白质来源中存在的生物活性肽序列增加了人们对其通过酶解过程释放和在新型功能食品设计中的应用的兴趣。[9，15］．因此，在本研究中，在pH值为4的鱼类肌肉水解物中观察到的小肽片段的存在，将代表和选择生产生物活性肽。但其生物活性的评价还有待进一步研究。

表1:蛋白质底物对柑桔花蛋白酶粗提物水解活性的影响。

另一方面，中性pH下CPs对罗非鱼肌肉蛋白的水解效果低于pH 4。一些肽片段约31kda和10kda (* in标记)图1 e)在5% (E/S) CPs水解120和240 min后，其浓度增加，这可能与肽键的特定偏好有关。该片段可能来自肌球蛋白(MW约。200 kDa)或肌动蛋白(MW左右)。42 kDa)，因为两个波段都在时间内降低了强度。一般情况下，高特异性的酶通过SDS-PAGE分析可以清楚地分辨出分子量相似的片段，如木瓜蛋白酶在肌球蛋白分子头部附近裂解释放尾部(分别为S1和S2亚片段)[15］．蛋白质水解产物的生产被广泛用于生产食品工业中具有吸引力的食品配料。水解产物中大肽片段的存在可以改善其功能特性[7］．因此，在这种条件下生产的罗非鱼水解液中存在的大肽可以显示功能特性。

在pH值为9时，CPs对肌肉蛋白质的作用也没有特异性(图1 f)，但与pH 4.0和7.0相比，蛋白水解的强度较低(图1 d而且E分别)。同样，这与之前报道的CPs的蛋白水解活性相一致，即观察到pH 4.0时的活性高于中性区域，而pH高于9.0时则有增加的趋势[4］．

使用选定的蛋白水解酶制剂的酶促工艺被认为是一种具有吸引力的技术，在经济上可行，可增加价值并从鱼类副产品中回收蛋白质[15］．在酶促过程中使用CPs是生产具有功能性和/或生物活性的鱼蛋白水解物的一个有吸引力的选择，是取代传统酶的一个有吸引力的选择。

结论

柑橘蛋白酶可以降解不同来源的蛋白质底物，为生产鱼蛋白水解物提供了可能。柑桔花提取物中多种蛋白酶的存在在很宽的pH范围内具有活性，是一种替代传统酶在功能成分或生物活性肽生产等生物工艺过程中的选择。CPs使用的选择条件决定了产生的水解物的性质。中性pH下CPs对鱼蛋白的有限的蛋白水解会损害改善的功能特性，而在酸性pH下观察到鱼蛋白的广泛蛋白水解，释放出具有生物活性的小肽片段。

致谢

作者感谢墨西哥国家科学技术委员会(CONACyT)对这项研究的支持。

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