研究和评论:食品和乳品雷竞技苹果下载技术杂志》上
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ISSN: 2321 - 6204
+ 1-845-458-68821农业研究理事会和经济学(克雷亚),动物生产研究中心(克雷亚PCM),通过Salaria 31日Monterotondo, RM 00015意大利。
2罗马大学Sapienza,环境生物学,P。le莫罗5,意大利罗马,00161年。
收到日期:05/08/2015接受日期:22/08/2015发表日期:31/08/2015
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本研究的目的是评估的潜力threecomponent植物提取提取作为防腐剂的新鲜零售肉。的代谢组学指纹提取获得了高性能薄层色谱法。提取对腐败细菌的抗菌活性:Carnobacterium maltaromaticum, Brochothrix丝菌,大肠杆菌、荧光假单胞菌、乳酸菌curvatus和l . sakei肉在汤模型评估系统。细菌生长抑制区(mm)范围从27.33±0.68,30.00±1.00,与100年被发现的盘扩散试验μL提取、100μL环丙沙星(wt / v)积极控制和100μL无菌蒸馏水作为消极的控制。减少细菌增长百分比范围从86.31±1.15,90.51±1.15;从78.79±1.00,91.53±2.08;从61.18±1.30,69.21±0.50;从36.56±1.10,62.83±1.33肉汤中采用不同提取方法稀释1:100,000 (1:10)。可行的细菌细胞中发现experimentally-contaminated肉末治疗后第二天(每10 g 100μL提取肉),除了c . maltaromaticum和p .荧光检测到第四天,通过PCR和嵌套PCR propidium monoazide (PMA™)染料。报道结果tri-component工厂的基础上派生的提取应考虑作为一个潜在的防腐剂对新鲜零售肉。
三分量的植物提取精华,天然防腐剂,新鲜零售肉腐败,肉的质量。
1,8-cineol (PubChem CID: 12031);月桂酸(PubChem CID: 3893);芳樟醇(PubChem CID: 6549)被视为商业产品标记化合物从hydro-alcoholic提取(phytocomplex)的月桂树(月桂nobilis l .)浆果,棉花糖(蜀葵属植物officinalis l .)根和英语薰衣草(Lavanda angustifolia轧机)花。
防腐剂是用于加工肉类食品安全、保质期和食品技术原因。它们的使用除了抑制微生物的生长,同时保留新鲜的红肉的颜色和外观。防腐剂的使用是根据政府法规因为某些防腐剂对人体健康产生不良影响。肉类中硝酸盐和亚硝酸盐的含量是受限制的,因为他们可以转换公认的致癌化学成份。二氧化硫曝光引起一些人的呼吸困难。此外也可以监管,防止使用不兼容其他制造过程。
如今,人畜共患的食源性和水源性病原体开始抵抗抗菌素。这些耐药菌株被分离从食物和可以进入人类胃肠道几乎每天。食源性疾病的发病率增加,加上由此产生的社会和经济影响,导致一个常数努力生产更安全的饲料和食品,开发新的天然抗菌药物。
植物和它们农工业的废物和副产品成分可能是生物活性物质的来源与当前的抗菌素。
植物提取提取抗菌防腐剂的探索是一种创新的方式寻找新的替代物质对肉类保存(1,2]。植物提取精华作为防腐剂的使用非常重要,因为它们代表消费者以及消费者感知风险较低的最小需求处理,防腐剂免费产品增加。合适的抗菌植物中提取应该是:低成本、环保、定制的目标,除了有效(3,4]。
国际生命科学Institute-Europe开发了一个全面的文档的使用植物材料在食品5),强调原料用于食品必须识别和特征。起始物料必须准确确定,以确保食品的植物材料使用是一致的质量和数量的活性成分和制备的方法必须符合良好生产规范。
抗菌素的使用肉保存的局限性包括化合物与肉接触表面上的失活或分散的化合物从表面到肉质量。雷竞技网页版杀菌物质进入肉产品可能导致部分变更由肌肉组件知道显著影响抗菌物质的功效和释放他们。因此,物理和化学特性的肌肉可能会改变抗生素的活性。此外,合并的抗菌活性和化学稳定性活性物质可以影响也被水活动的肉6]。
生物活性的评价从植物中筛选新抗菌素是必要的。
在这里报道派生三分量的植物提取物的抗菌活性与肉类腐败细菌由两个创新的方法,评估高性能薄层色谱法和肉汤肉模型系统,为其潜在候选人新的零售肉保存。高性能薄层色谱法可以获得的代谢组学指纹提取。它是可取的标准化产品和建立科学的证据其生物活性。事实上,代谢组学方法允许获得尽可能广泛的覆盖率,在化合物的类型和数量进行了分析。高性能薄层色谱指纹图谱的方法被用来确定的草药成分研究产品(7- - - - - -9]。此外,汤肉模型系统(10)是用来评估直接在肉的潜力三分量的植物提取提取作为新的零售肉防腐剂。它还允许同时研究多个变质剂。
菌株和生长条件
肉变质的细菌,即Carnobacterium maltaromaticum(写明ATCC®43224™), Brochothrix themosphacta,大肠杆菌、荧光假单胞菌、乳酸菌curvatus(写明ATCC®25601™)和乳酸菌sakei被认为在实验中11- - - - - -14]。
b .丝菌,大肠杆菌,p .荧光和l . sakei以前孤立和特征(10,15),然后保持Microbank™瓶在-70°C。
所有的乳酸菌研究在实验中没有产生细菌素。大肠杆菌的存在被认为是装肉的质量的一项指标。大肠杆菌的高(高于100 / g)储存肉类可以显示温度滥用,因为它不会增加7°C以下。大肠杆菌也可能表明存在食品安全问题。细菌生长发表在媒体和条件表1。从美国型参考菌株文化集合被种植在媒体报道和生长条件对产品表。
| 细菌 | 增长的媒体 | 生长条件 |
|---|---|---|
| Carnobacteriummaltaromaticum写明ATCC®43224™ | 脑心浸液肉汤琼脂/ (Becton, Dickinson意大利,米兰,意大利) | 24小时的26°C |
| Brochothrixthemosphacta | 胰蛋白酶的大豆(OxoidSpA、米兰、意大利) | 22°C 48 h |
| 大肠杆菌 | 70722年HiCrome™大肠杆菌琼脂/ BrothB(丙烯酰胺Sigma-Aldrich、米兰、意大利) | 在37°C 48 h |
| 荧光假单胞菌 | 营养琼脂/汤(丙烯酰胺Sigma-Aldrich、米兰、意大利) | 24小时的35°C |
| 乳酸菌curvatus写明ATCC®25601™ | 乳酸杆菌琼脂/汤夫人(Becton, Dickinson意大利,米兰,意大利) | 在37°C的气氛下5%的股份有限公司2为24 - 48 h |
| 乳酸菌sakei | 乳酸杆菌琼脂/汤夫人(Becton, Dickinson意大利,米兰,意大利) | 在30°C 48 - 72 h的氛围中5%的股份有限公司2。 |
表1。细菌生长媒体和生长条件用于实验。
抗菌活性试验,1毫升的每种文化被稀释105-10年6CFU /毫升。
植物中提取
的三分量的植物提取物被认为是一个商业产品,Caira Laboratorio Erboristico。月桂树是hydroalcoholic提取(月桂nobilis l .)浆果,棉花糖(蜀葵属植物officinalis l .)根和英语薰衣草(Lavanda angustifolia轧机)花。
提取利用mono-ingredient标准是水电酒精提取物(10 g / mL)从市场或获得的实验室提取识别草药原料,最后也用作参考确认销售的身份的。详细信息,即生产者、生产条件、存储方法等可以直接通过问作者。
代谢组学指纹
化学分析设备
总三分量植物提取成分提取获得的高性能薄层色谱法。高性能薄层色谱系统由取样器使用100μL注射器和连接到一个氮罐;自动开发室包含双槽室x10 20厘米;浸设备三世;薄层色谱板加热器三世;TLC可视化与winCATS软件。玻璃板20 cmx10与glass-backed层硅胶60厘米(2μm厚度)。在使用之前,盘子与甲醇和干水洗3分钟100°C。
发展和衍生化
干的提取分析样本加权和溶解在甲醇(30毫克/毫升)。过滤解决方案应用与氮流。然后开发了高性能薄层色谱板自动2室ADC,充满了同样的流动相,层/以/醋酸/ HCOOH / H2O后(100:25:10:10:11;v / v)在室温下20分钟。色谱运行的长度是70毫米的应用程序。开发层板加热器上被允许干5分钟在120°C,然后derivatized选择解决方案,包括anisaldehydesulfuric酸(1毫升茴香醛、10毫升硫酸、20毫升170毫升甲醇乙酸)和美国国家公共电台(1 g diphenylborinic酸aminoethylester在200毫升的乙酸乙酯)。最后,盘子被加热5分钟前在120°C。所有治疗盘子然后检查在254或366海里或紫外线照射下反射和传输白光(关于),分别在CAMAG TLC可视化工具,之前和之后的衍生。
验证
样品提取的解决方案被发现是稳定在4°C至少1个月,至少3天的高性能薄层色谱板。重复性是由运行至少三个分析。比率物质的迁移距离和迁移距离为主要溶剂的前面(Rf)所选化合物不同的±0.02%。小的变化的影响,流动相组成、饱和流动相体积,持续时间一分钟,减少直接的比较。相反,结果严重依赖于预水洗高性能薄层色谱板的甲醇。
抗菌活性的评估
三分量的抗菌活性植物提取提取被汤肉方法评估系统之前报道(16]。它包括三个步骤:1)在固体培养基上抑制生长使用标准纸片扩散法(100毫升三分量的植物衍生在无菌蒸馏水提取1:1 v / v);ii)增长百分比减少使用汤采用方法在常规无菌聚苯乙烯平底微型板块的96口井(康宁,西格玛奥德里奇,意大利米兰),每满100μL无菌液体媒体适合每一个微生物,50μL培养液和提取量较低的稀释1:10 1:10,000;细菌生长是由OD阅读在630 nm / 10毫米腔长与ELISA标然后细菌细胞浓度转换为细胞/毫升使用参考曲线方程。3)实验真空包装的肉末(10 g)与每个细菌接种(ca。106CFU /毫升)和治疗threecomponent植物提取提取(100μL) 10°C,来模拟一个虐待制冷,12天。
探测和识别细菌的实验治疗和样品提取进行了利用分子生物学和微生物技术每隔两天冷藏的第12天。
细菌DNA提取进行了使用ChargeSwitch®gDNA迷你包(生活意大利技术,蒙扎,MB,意大利)制造商的指示。分子识别和描述了使用特定引物对细菌的报道表2。混合和反应条件是那些在文学中所示表2。PMA™, photo-reactive染料具有高亲和力的DNA插入到DNA和形成一个共价键在暴露在强烈的可见光,允许唯一的选择性检测活细胞(PMA™Biotium Inc .,海沃德,美国、www.biotium.com)[17]。
| 细菌 | 引物对序列 | 参考 | |
|---|---|---|---|
| Carnobacteriummaltaromaticum写明ATCC®43224™ | Cb1 5′-CCGTCAGGGGATGAGCAGTTAC-3′ Cb2r 5′-ACATTCGGAAACGGATGCTAAT-3′ |
约斯特et al ., 2000 | |
| Brochothrixthemosphacta | pA 5′-AGAGTTGATCCTGCCTCAG-3′ 体育5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3 ′ |
徐et al ., 2010 | |
| 大肠杆菌 | Ec1 5′-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3′ Ec2 5′-ACGCAGACCGTAAGGGCCAGAT-3′ |
Osek 2001 | |
| 荧光假单胞菌 | 16 spsefluf 5′-TGCATTCAAAACTGACTG-3′ 16 sps 5′-ATCACACCGTGGTAACCG-3′ |
Scarpellini et al ., 2006 | |
| 乳酸菌curvatus写明ATCC®25601™ | Y1 5′-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCCCG-3′ Y2 5′-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′ 16 s 5′-GCTGGATCACCTCCTTTC-3′ Lc 5′-TTGGTACTATTTAATTCTTAG-3′ |
约斯特et al ., 2008 | |
| 乳酸菌sakei | Y1 5′-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCCCG-3′ Y2 5′-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′ 16 s 5′-GCTGGATCACCTTTC-3′ Ls 5′-ATGAAACTATTAAATTGGTAC-3′ |
约斯特et al ., 2008 | |
表2。引物对用于检测细菌被认为是在实验中。他们放大独特的导致的每一个细菌的基因组序列。
放大产品(7μL)分析了在2%或3%琼脂糖凝胶电泳缓冲在0.5×此种(此种缓冲:三(羟甲基)氨基甲烷90毫米,90毫米硼酸,3毫米ethylediaminetetraacetate钠盐、pH值8,3)对50个基点,100个基点和1 Kb梯作为大小标记(表达载体,意大利米兰,)和可视化在260 nm紫外线与荧光染料染色后,凝胶绿色染料的结果记录为±SD方法重复实验考虑为每个实验三个重复。差异的方式使用SAS LSD计算比较的数据。
代谢组学指纹
指纹的三分量的植物提取物是好按照获得的三种提取物的混合物在实验室从原材料标识。有必要执行一些推导和启示为证据,尽可能多。最相关色谱结果报告图1下,但其他色谱分析可以获得请求。
图1:高效薄层色谱法分析三分量的植物提取提取包含湾树(月桂nobilisl .),棉花糖(蜀葵属植物officinalisl .)和英国薰衣草(薰衣草花angustifolial .)。可视化:366海里;衍生化:没有。B:可视化:366海里;衍生化:NP试剂和Anhysaldeide;C:衍生化:NP试剂和Anhysaldeide;可视化:白光,上部和下部。歌曲:1、销售分析产品;2、湾树(月桂nobilisl .)提取标准指纹;3、棉花糖(蜀葵属植物officinalisl .);4、英语薰衣草(薰衣草花angustifolial .)提取标准指纹;5。2 - 4的混合物提取的足迹。
评估0 f抗菌活性
获得的结果表明,该提取物是有效对抗所有的腐败细菌制剂。抗菌活性的评估是基于明确的直径增长抑制带周围的纸磁盘浸泡100μL提取。提出了在表1,平均的增长抑制带(mm)范围从27.33±0.68,30.00±1.00。之间没有显著差异的增长抑制带提取和环丙沙星c . maltaromaticum除外。大肠杆菌和c maltaromaticum造成最容易提取和检测细菌的抗生素(表3)。
| 她们(毫米)* | |||
|---|---|---|---|
| 细菌 | 治疗 | ||
| TC-PDE | WTR | 中国只 | |
| Carnobacteriummaltaromaticum | 27.33±0.68 | - - - - - - | 29.00±1.00 b |
| Brochothrixthermosphacta | 29.53±1.05 | - - - - - - | 29.12±1.00 |
| 大肠杆菌 | 28.83±1.10 | - - - - - - | 27.81±1.00 |
| 荧光假单胞菌 | 30.00±1.00 | - - - - - - | 29.31±1.73 |
| 乳酸菌curvatus | 28.53±0.48 | - - - - - - | 29.11±1.00 |
| 乳酸菌sakei | 27.80±0.30 | - - - - - - | 28.33±2.08 |
*直径的抑制区,包括圆盘的直径(6毫米)。TC-PDE tri-component植物中提取;WTR无菌蒸馏水;排名,环丙沙星(1毫克/毫升)。三个磁盘文件每板为每个细菌被认为是和三个板块。实验重复两次。——没有抑菌圈。值表示两个实验的平均值±标准偏差。平均值的不同字母行明显不同(p≤0.05)。
表3。抗菌活性tri-component植物提取提取反对腐败纸片扩散法检测到的细菌生长抑制区。
最高的细菌生长减少(%)观察100μL和10μL提取。他们范围从86.31±1.15,90.51±1.15,78.79±1.00,91.53±2.08,分别。有显著差异的百分比减少细菌生长在100μL和10μL透露考虑细菌中提取。大肠杆菌和l . curvatus最易感乳酸菌为100μL,使得更容易在10μL (表4)。
| 细菌 | GR (%) | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (100µL) | (10µL) | (1µL) | (0.1µL) | |||||
| Carnobacteriummaltaromaticum | 89.25±1.53摄氏度 | 88.21±1.00 b | 67.56±1.13 b | 39.41±1.08 | ||||
| Brochothrixthermosphacta | 86.31±1.15 d | 81.20±1.00 d | 61.18±1.30 d | 36.56±1.10 | ||||
| 大肠杆菌 | 90.51±1.15 b | 85.70±1.00 b | 62.48±1.00摄氏度 | 60.16±1.14摄氏度 | ||||
| 荧光假单胞菌 | 86.86±1.00 d | 78.79±1.00 e | 69.21±0.50 | 61.88±1.00摄氏度 | ||||
| 乳酸菌curvatus | 94.50±1.53 | 91.53±2.08 | 68.39±1.80 b | 62.83±1.33摄氏度 | ||||
| 乳酸菌sakei | 89.31±1.00摄氏度 | 89.41±0.58 | 69.17±0.00 | 57.58±0.89 b | ||||
值表示为两个实验的平均值±标准偏差(每个实验三个重复)。平均值与列明显不同(不同的字母p≤0.05)。
表4。减少细菌生长在24小时(GR %)的液体培养基中细菌生长减少的百分比的差异在不同浓度的提取使用控制治疗作为参考(没有提取)。
值表示为两个实验的平均值±标准偏差(每个实验三个重复)。平均值与不同字母列明显不同(p≤0.05)。
直接扩增子的预期大小的检测experimentally-inoculated真空包装的肉末治疗后第二天除了乳酸细菌,检测治疗后4天。细菌总是发现在控制样品(水)2日,4日,6日,8日,10日和12日存储,但从未在收集样品用环丙沙星治疗在同一存储天(表5)。微生物的微生物检测官方与分子生物学检测方法在协议执行如前所述在每个间隔揭示的抗菌活性实验污染的肉类。可行的细菌细胞的数量明显降低(p≤0.05)尊重用于实验的接种物污染肉类在每个时间间隔。
| 检测的可行的细胞治疗后(100µL每个治疗) | ||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 2天 | 4天 | 6天 | 8天 | 10天 | 12天 | |||||||||||||||||||
| 细菌 | T | W | C | T | W | C | T | W | C | T | W | C | T | W | C | T | W | C | ||||||
| c . maltaromaticum | + | + | + | + | + | + | − | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | ||||||
| b .丝菌 | + | + | + | − | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | ||||||
| 大肠杆菌 | + | + | - - - - - - | − | + | + | − | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | ||||||
| p .荧光 | + | + | + | + | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | ||||||
| l . curvatus | + | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | ||||||
| l . sakei | + | + | − | + | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | − | + | − | ||||||
T - tri-componenet植物提取提取;W -无菌bi-distilled水;C -环丙沙星。
+:检测;−:没有检测到
表5所示。探测和识别的PCR和嵌套PCR检测菌株的细胞在真空包装的牛肉肉末储存在10°C 2, 4, 6, 8, 10, 12天治疗后与提取、水和环丙沙星。
污染食物和变质的微生物是一个主要关注消费者,政府部门和食品行业。增加存储时间和使用的技术,确保安全高度易腐产品的消费,如肉类,经历了一个持续的进化时间,为了应对消费者的需求和行业(18- - - - - -20.]。新的可持续的解决方案在肉类包装必须确保食物的安全和质量,减少粮食损失和对环境的影响。食品包装中起着至关重要的作用在分布和保存食品的质量和安全存储从农场到餐桌。需要使用的材料更可持续、更符合食物,代表了一个新的市场,导致了激烈的活动研究的自然物质生产可生物降解的包装和食用涂料。旁边的活性包装的扩散,能够动态交互的系统与食物,和/或与大气,为了节省产品的健康和延长其保质期,增加(21]。这些系统的有效性已得到改进使用电影由抗菌物质和化学激活或天然防腐剂缓慢释放22]。抗菌包装,积极反对腐败微生物和/或病原体,可以延长保质期,改善所有类型的安全食品,特别是处理(23,24]。此外,兴趣活动以及智能包装系统的使用对肉类和肉类产品增加了近年来25,26]。最近,添加天然抗菌物质的可食用的电影吸引了极大的兴趣,选择控制或减少食源性和腐败微生物的生长27]。Traditional Medicine experienced for thousands of years the properties of herbs. Plants were selected on the experience on high numbers of individuals and results are recorded in a large quantities of books. However, the enormous quantity of information needs to be revised and adapted to the current marketed forms. The compounds of the plants composing the three-component plant derived extract studied show inter alia antimicrobial activity [28- - - - - -33]。这些植物被评为人类使用草药欧洲药品局(34- - - - - -36]。
结果显示的抗菌活性研究phytocomplex对肌肉的主要变质剂,确定其潜在的作为新的零售肉的防腐剂。因此与文学和高性能薄层色谱分析,相关的活动应该是优势的精油和多酚提取物。
量化各种植物提取物的组成是常态。几个因素前和收获后会引起改变几个成分的比例,特别是在案件的次生代谢物(37- - - - - -39]。分析质量控制更为复杂的multi-ingredient产品。应用高效薄层色谱指纹图谱方法的报道,为特定的应用程序来确定利用植物的识别和定性和定量模式,为了保持之间的对应关系构成和活动。
考虑multi-resistance的微生物防腐剂的使用,探索与抗菌活性物质是必要的,从植物天然产物可以给重要的进步。寻找其他天然添加剂继续使用防腐剂在食品之前,它必然是检查,以确保它不改变味道或颜色,可以很容易地整合40,41]。
这项工作进行了框架的农业研究委员会之间的合作研究和经济学克雷亚,肉类生产和遗传改良研究中心的克雷亚PCM,和罗马大学的Sapienza,环境生物学:草药动物福利和提高畜牧业的生产。
研究概念和设计:Paola Del Serrone。微生物数据的收集和/或装配:Paola Del Serrone。化学数据的收集和/或装配:奇亚拉Toniolo和马塞洛Nicoletti。统计分析:Paola Del Serrone。数据分析和解释:Paola Del Serrone, Chiara Toniolo和马塞洛Nicoletti。写作这篇文章:Paola Del Serrone,马塞洛Nicoletti。关键的文章的修订:Paola Del Serrone奇亚拉Toniolo和马塞洛Nicoletti。最终批准的文章:Paola Del Serrone奇亚拉Toniolo和马塞洛Nicoletti。
作者宣称没有利益冲突
