BCCAO法评价黄酮类化合物对大鼠脑缺血再灌注性脑梗死的脑保护作用。

摘要

Dalbergialatifolia通常被称为“bete和sitsal”。本研究以黄檀皮甲醇提取物(DL)为研究对象，研究其对大鼠全脑缺血模型的脑保护作用。用DL预处理动物1周(500 mg/kg)，用硫喷妥酮钠(45mg/kg)麻醉动物，用缝合线诱导双侧颈总动脉闭塞(BCCAO)梗死30分钟，用滑绳绳解结。允许动物再灌注48小时。然后动物被宰杀，大脑被斩首。进行SOD、CAT、MPO、MDA生化测定及组织学检查。

关键字

脑缺血，黄斑，脑梗死

简介

中风是世界上导致死亡和残疾的主要原因之一。世卫组织估计，在1990年至2020年期间，全世界中风死亡率将增加，女性增加78%，男性增加106% [1］．中风是世界上第二大致死原因，每年造成约600万人死亡[2］．据估计，中风的终生风险在8%至10%之间[3.］．在发病方面，中风涉及一系列不同的过程。血管闭塞(缺血性中风)占所有中风的85%，而原发性脑内出血(出血性中风)占其余[4］．缺血性中风占所有中风的87%。在45至64岁的人群中，8%至12%的缺血性中风在30天内死亡[5］．

类黄酮具有高度活性的羟基，通过电子捐赠被氧化，从而将自由基稳定为活性较低的分子。其中一种反应方式是直接清除自由基，如超氧阴离子、单线态氧和脂质过氧自由基。在结构上决定黄酮还原势的重要特征是羟基化模式，b环上的α 3 '，4 ' -二羟基儿茶酚结构，分子的平面性以及c环上的2,3-不饱和共轭与4-氧基的存在。有相当多的证据表明，黄酮类化合物有效地减弱自由基和活性氧和活性氮(ROS/RNS)的有害影响。例如，槲皮素和一些结构相关的类黄酮在暴露于H2O2的PC12细胞中显示出显著的细胞保护作用[6］．同样在PC12细胞中，添加黄酮类化合物或富含黄酮类化合物的提取物抑制了过氧化氢诱导的ROS增加，从而提高了细胞存活率[7，8］．

铃木等[9］．在大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)和再灌注前5天和再灌注期间，在饮用水中加入儿茶素提取物，观察其对脑卒中后各种恶化过程的保护作用。儿茶素通过抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达和中性粒细胞浸润，显著改善再灌注后观察到的神经功能缺损。此外，由于儿茶素具有强大的自由基清除特性，过氧亚硝酸盐的形成被发现减少。

洪等人。[10]在沙鼠缺血前，在饮用水中随意加入绿茶提取物3周。这种治疗减少了梗死体积、凋亡细胞数量和脂质过氧化，并抑制了缺血诱导的过度活动。

Dalbergia latifoliais:一种大型无毛树，有一根茎，有一种特有的气味[11］．它分布在比哈尔邦，邦德尔坎德邦和印度中部[12］．它含有dalbinol，一种新的12α-羟基rotenoid [13]、从种子中提取的西沙林香豆素、β-谷甾醇，还含有从树皮中提取的达尔伯克罗梅烯、罗泊酚、拉folin和达尔伯金，心材中含有拉丁酮、黄酮类化合物[14]和latinone，一个取代菲- 1,4 -醌从Dalbergialatifolia中分离得到[15］．其茎皮含有单宁，可用于治疗麻风病、肥胖和蠕虫[12］．乙醇提取物(50%)对蛔虫具有致痉挛和驱虫活性[16］．作为乙醇药，茎皮含有单宁，可用于治疗麻风病和蠕虫[17］．许多种达尔柏树是重要的木材，因其装饰性和芳香的木材而有价值，富含芳香油[18，19］．传统上，各种品种被报道用于壮阳、堕胎、祛痰、解热、开胃、解渴、呕吐、烧灼感，治疗皮肤病、溃疡、血液病，减少肥胖，用于白癜风、消化不良、痢疾，用于眼鼻疾病、梅毒、胃病、麻风病、白癜风、疥疮和癣[20.］．

材料与方法

收集植物资料

Dalbergialatifolia的树皮部分于2012年6月从Tirupati森林中采集，由K.Madhavachetty鉴定和鉴定，凭证标本保存在班加罗尔卡纳塔克药学院药理学系。

提取物的制备

得到的植物材料用机械搅拌机进行研磨，得到粒度均匀的细粉。约250克粉末在索氏装置中用甲醇处理2小时。将得到的液体提取物置于阴凉处进行蒸发，以除去多余的溶剂，从而形成药物提取物的固体块。计算出萃取物的收率，并储存起来供以后使用。进一步对固体甲醇药物提取物进行柱层析分离黄酮类化合物，并通过黄酮类化合物的化学检测来确认药物中黄酮类化合物的存在。

实验动物

实验选用白化雄性wistar大鼠，8-10周龄，体重250-280g。实验前驯化一周。将动物关在完全通风的笼子里，保持12:12 h的明暗循环，并在25±2°C的温度下饲养。他们可以免费获得标准的饮食和无限量的水。在动物身上进行的所有实验都符合实验动物使用的标准，实验规程也得到了机构动物伦理委员会的正式批准。

实验设计

将大鼠随机分为5组，每组6只。

•第1组:缺血再灌注(I/R)

•第2组:假手术(手术切口)

•第三组:车辆

•第4组:白檀(DL)

第五组:别嘌呤醇

脑缺血诱导

给药硫喷妥酮钠(45 mg/kg)静脉注射麻醉动物。

闭塞:手术诱导脑缺血的方法采用早前发表的《安舒曼三联》2009年的方法。麻醉下行正中切口。从迷走交感神经中仔细分离颈总动脉。用螺纹阻断双颈总动脉(BCCAO) 30 min，再灌注48小时。颈部切口区域用线缝合。DL组动物给予7 d预治疗(500mg/kg)，在闭塞前10 min给予标准药物(别嘌呤醇，10mg/kg)。

在再灌注期后，动物被处死，大脑被斩首，进行生化评估。超氧化物歧化酶活性测定采用Kakkaret al, 1984年开发的方法。［21]， CAT活性采用Aebiet al, 1974的方法测定[22]，采用Okhawaet al, 1979的方法测定mda活性[23]， MPO活性采用Mullaneet al, 1985的方法测定[24］．

还进行了组织病理学研究，并对所得结果进行了比较。

结果与讨论

组织病理学

假手术组:脑组织SOD、CAT、MPO、MDA无神经功能缺损(图1 - 4)．组织病理学研究亦显示，组织内并无神经元变性(公布)．

I/R组大鼠脑组织MDA、MPO水平明显升高，SOD、过氧化氢酶水平明显降低(图1 - 4)．组织病理学检查还显示有神经元变性、神经胶质细胞增生、充血、出血、淋巴细胞浸润及空泡化，提示脑损伤(图6)．

灌胃组:脑组织SOD、CAT、MDA、MPO水平更接近I/R组(图1 - 4)．组织病理学检查还显示神经元退行性变、充血胶质细胞增生和空泡化，提示载体不参与脑保护作用。（图7）

DL组与I/R组比较，脑组织SOD、CAT水平明显升高，MDA、MPO水平明显降低(图1 - 4)．组织病理学检查显示神经元退行性变最小，轻度空泡，充血相对较低(以数字)．

别嘌呤醇组:与I/R组比较，脑组织SOD、CAT水平明显升高，MDA、MPO水平明显降低(图1 - 4)．组织病理学结果显示，神经元细胞未受严重损伤，仅出现轻度空泡和出血(图9)．

氧化应激被认为是脑缺血后损伤的主要来源。各种脑缺血再灌注损伤实验模型均显示抗氧化剂具有明显的神经保护作用[25］．

脂质过氧化是脑损伤的主要机制之一。该机制涉及一个过程，不饱和脂类被氧化形成额外的自由基物种以及有毒的副产物，可对宿主系统有害[26］．在氧化环境中，多饱和脂类尤其容易受到这种类型的损伤，它们可以反应形成脂质过氧化物[27］．脂质过氧化物本身不稳定，经过额外分解形成一系列复杂化合物，包括活性羰基化合物[28］．

在本研究中，我们观察到缺血再灌注组与假手术组相比，组织MDA活性增加，结果与以往的研究一致。与别嘌呤醇(10mg/kg)所观察到的MDA活性相比，Dalbergialatifolia (500mg/kg p.o)治疗提供了脑保护。

活性物质可以通过一些酶的和非酶的抗氧化机制减少或消除。SOD能催化超氧阴离子(O-2)变性为过氧化氢和分子氧，是最重要的抗氧化酶之一[29］．

本研究中，与假手术组相比，缺血再灌注组SOD和CAT活性降低，结果与既往研究一致[29］．这可能是由于超氧阴离子的过量形成。SOD活性的降低会导致超氧阴离子的去除减少，这可能对大脑有害。酶水平的下降可能是由于过量的超氧阴离子可能使SOD失活，从而导致H2O2清除酶失活。与I/R组相比，DL组降低的SOD和CAT活性显著增加。

炎症是脑缺血发病机制的重要组成部分。促炎分子如NO合酶-2 (NOS 2)、环氧合酶-2 (COX 2)、趋化因子和粘附分子与脑缺血损伤的发展有关。髓过氧化物酶(MPO)是一种由炎症部位活化的吞噬细胞分泌的高阳离子糖化血红素酶。MPO是一种参与自由基产生的酶。事实上，MPO使用H2O2和NO2¯来生成活性氮[30.］．

缺血再灌注组MPO酶活性较假手术组明显升高。与I/R组和标准组相比，DL给药显示出对炎症介质的抑制作用。

结论

本研究基于前人研究的证据，黄酮类化合物和含有部分植物的黄酮类化合物具有良好的抗氧化性能，黄檀叶甲醇提取物中含有不同种类的黄酮类化合物，与I/R组和标准药物(别嘌呤醇)组相比，表现出明显的抗氧化活性，具有脑保护作用。通过测定CAT、SOD、MDA、MPO等多种生化指标，并利用组织病理学玻片比较神经元组织损伤程度，证实其活性。

参考文献

1. Popkin BM。营养转型，不断变化的全球营养挑战。亚太临床营养学杂志，2001;10 (s): s13-s18。
2. 世卫组织全球信息库。[https://apps.who.int/infobase/Mortality.aspx]。
3. 谢夏德，张志强，张志强，等。中风的终生风险——来自弗雷明汉研究的估计。中风。2006;37:345-50。
4. Beal CC:性别与中风症状:当前文献综述。中华神经科学杂志，2010;
5. 罗莎蒙德·W，弗莱戈·K，福瑞·K，等。心脏病和中风统计数据——2008年更新:来自美国心脏协会统计委员会和中风统计小组委员会的报告。循环。2008;117:e25 - 146。
6. Dajas F, Rivera-Megret F, Blasina F等。黄酮类化合物的神经保护作用。巴西医学生物学杂志，2003;36: 1613 - 1620。
7. Sasaki N, Toda T, Kaneko T, Baba N, Matsuo M.黄酮类化合物对亚油酸过氧化氢对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞毒性的保护作用。ChemBiol Interact.2003;145: 101 - 116。
8. 李志刚，李志刚，李志刚等。黄酮类化合物的标准化提取物增加了过氧化氢处理的PC12细胞的活力:对氧化损伤的影响。拱Toxicol.2003;77: 22日。
9. 铃木M，田内M，池田M，梅垣K，富田t。绿茶儿茶素对脑缺血损伤的保护作用。地中海SciMonit.2004;10: BR166-BR174
10. 洪景涛，柳世荣，金海杰，李金杰，李世胜，尹玉平，等。绿茶提取物对蒙古沙鼠缺血再灌注脑损伤的保护作用。大脑Res.2001; 888:11-18。
11. Prasad AGD, KSJ Cahndra, ANY Reddy. 1993。印度卡纳塔克邦达尔木的遗传改良计划的启动。在国际Dalbergiaworkshop上发表的论文。
12. Kirtikar KR和BD Basu, 2005年。印度药用植物。印度德拉敦国际图书经销商。页:824。
13. Shyam S, KU Chibber。dalbinol: dalbergialfoli种子中新的12a-hydroxyrotenoid。植物化学。1978;17:1442-1443。
14. 拉斯托吉，梅赫罗特拉，1993。印度药用植物简编。勒克瑙和新德里:中央药物研究所，出版和信息局。页:245。
15. ThurloughO, MOS Criodain, JM Mary, MXD Dervilla。拉丁醌，一种来自黄檀属的菲-1,4-醌。Phytochem。1981;20:1089 - 1092。
16. 卡雷出版社，2007年。印度药用植物图解词典，施普林格科学，商业媒体，llc .纽约，美国，第200页。
17. KR Kirtikar和BD Basu，印度药用植物。国际图书经销商，德拉敦，印度，2005年。
18. 丰富的印度原材料。第2卷，印度科学研究委员会出版和信息局，新德里，1972年。
19. RN乔普拉，SL尼尔，IC乔普拉。《印度药用植物术语汇编》，CSIR，新德里，1980年。
20. 公里还。印度药材，第三版，孟买，大众书库，1954年。
21. 李志强，李志强，李志强，等。枸杞花提取物对氧化应激和促炎症介质的抑制作用。chemtoxicol食物。2010;48: 2913 - 9。
22. 小松T, Yamazaki H, Nakajima M, Yokoi T.过氧化氢酶在人肝微粒体中作为促进苯妥英二羟基代谢物形成的因素的鉴定。BiochemPharmacol。2002;63: 2081 - 90。
23. Kristofikova Z, Klaschka J, Hana T.衰老对l -谷氨酸诱导的脂质过氧化物水平的影响，并通过硫代巴比妥酸试验在大鼠脑组织中估计。Expgerontol。1995;30: 645 - 57。
24. 潘万成，陈世杰，陈永明，陈永明，陈永明。不同体温对脂多糖致大鼠肺损伤的影响。胸部。2005;128: 327 - 36。
25. 大鼠双侧颈动脉闭塞所致脑缺血的行为学评估研究。安生物，2010;1(1): 208-23。
26. 抗氧化策略在脑卒中治疗中的应用。免费Rad生物医学。2005;39(4): 429。
27. Adibhatla等人。短暂性脑缺血中磷脂酶A2、羟基自由基和脂质过氧化。抗氧化还原信号。2003;5(5): 647 - 54。
28. 金田Y，菊池H，石川M，木村M, Itokawa Y.局灶性脑缺血的脂质过氧化。神经外科杂志1989;71(3): 421 - 9。
29. 杨晓明，陈晓明，陈晓明，等。芦丁和柚皮苷对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病大鼠精子质量的影响。IJPR。2011;(3): 585 - 96。
30. 李志刚，李志刚，李志刚。别嘌呤醇和尼美舒利对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。Eur Rev Med Pharmacol Sci.1-9。(新闻)