克隆效率的评估基于克隆Diannan迷你猪的生产

Weirong锅^1#张,国众^1#、Yubo清¹,Honghui李¹程,Wenmin¹鑫,王^1,3,Xiaobing李^1,2,Yingchao刘¹渊源,气^1,2贾,王¹,Liangxue赖¹洪叶赵^4*Hong-Jiang,魏^1,2*

云南农业大学动物科学技术学院,昆明,中国的公关
重点实验室动物营养和饲料的云南省,云南农业大学,昆明650201年,中国的公关
部门遗传学斯坦福大学医学院,斯坦福大学,94305年
国家农业生物多样性中心、云南农业大学、昆明650201年,中国的公关
这些作者的贡献同样这项工作

相应的作者:洪叶赵、国家农业生物多样性中心、云南农业大学、昆明,中国
Hong-Jiang魏、动物科学与技术学院、云南农业大学、昆明,中国,电话:+ 86-871-68125713;传真:+ 86-871-68125713,电子邮件:hongjiangwei@126.com

收到:10/07/2015接受:16/10/2015发表:09/11/2015

相关文章Pubmed,谷歌学者

访问更多的相关文章rayapp

文摘

目前观察到的克隆效率较低,可以使用不同的方法计算。因此,一个合理的评价计算方法克隆效率猪是重要的促进基因改性的小型猪在生物医学领域的应用。在这项研究中,我们提出了一个猪的克隆效率的科学的评价方法,基于克隆Diannan迷你猪的生产。9接受者金边债券转让与克隆胚胎,8(88.9%)国债怀孕,和7(87.5%)这些交付37小猪,22(59.5%)还活着和17存活到成年(超过1岁)。在15胎死腹中的小猪,小猪11经验丰富的产时因难产死亡,另4死于blastocolysis在怀孕的后期阶段。同窝出生的最大数量是11的小猪。3只小猪还活着通过剖腹产手术和健康。过程用于克隆小猪是一个昂贵的过程在时间和金钱;具体地说,它需要677.7 - -1265.4分钟-764.5和715.8美元转移50 - 400克隆embryosto收件人。克隆效率定义为克隆小猪的总数(包括死亡,母亲小猪)除以总数量的胚胎转移是0.93%,而克隆效率获得基于住小猪的总数除以总数量的接受者是2.44的小猪。获得的价值是高于先前使用19个不同类型的供体细胞。 These findings suggest that donor cells derived fromDiannan小型猪是一个有价值的细胞来源体细胞核移植和猪的克隆效率的定义为“生活克隆小猪的总数除以总数量的转移接收金边债券”可能是一个合理科学的策略。

关键字

Diannan微型猪、体细胞核移植、猪的克隆效率的计算方法

介绍

体细胞核转移(SCNT)提供了一个强大的工具,用于创建的副本选择不同种类的个体,自1997年以来,当第一个哺乳动物从成年体细胞克隆绵羊“多莉”诞生了(1]。可行的SCNT程序也成立于猪(2- - - - - -4]。尽管SCNT也被成功地应用于一些小型猪的克隆,包括大肚皮小型猪(5),Clawn小型猪(6],哥廷根猪[7],尤卡坦minipigs [8),nib应变小型猪(9),美国国立卫生研究院的小型猪(10),巴马小型猪(11和班纳微型纯系猪12),猪SCNT的广泛应用在生物医学研究已经受到获得的克隆效率低(8,13]。的类型核供体细胞是一个至关重要的因素,影响使用的结果SCNT [14,15]。

Diannan小型猪是众所周知的独家本地品种,在中国云南是守恒的。这个猪的品种有一个适当的体重和遗传多样性(16]。此外,它很容易处理由于其温顺的性格和坚强抗病性质以及其依靠粗粮的能力。这个品种的性成熟的时间短,和交配可以发生在男性三个月大,女性是四个月大。的数量每窝仔猪初产的和多产的母猪大约7到10,分别。这些特性使得Diannan小型猪的理想模型,各种类型的研究(17,18]。因此,克隆这些猪都是非常重要的进一步应用。然而,克隆过程和效率Diannan小型猪尚不清楚。

猪SCNT程序已经开发了15年,尤其是出生以来的第一只克隆头猪被报道。猪的克隆效率计算了不同的实验室使用各种方法,如“克隆小猪的总数(包括死亡,木乃伊)除以总数量的胚胎转移”(10,19- - - - - -21克隆小猪”生活的总数除以总数量的胚胎转移”(12),”健康的克隆小猪的总数除以总数量的胚胎转移”(21),”小猪出生的数量(包括死亡,木乃伊)除以克隆胚胎的数量从接受者”(22)和“后代的数量除以导致怀孕的胚胎转移数量”(9]。由于这些差异,我们努力确定一个更科学的方法来评估猪的克隆效率。

在目前的研究中,我们表明,供者细胞来源于Diannan小型猪是一个有价值的细胞源供SCNT猪生物医学模型的生成。此外,本研究中使用的方法来计算猪的克隆效率基于克隆Diannan迷你猪的生产及其在先前发表的论文比较详细的方法进行了讨论。

材料和方法

所有的动物实验进行的动物保健和使用委员会批准在中国云南农业大学。

化学物质

所有的化学品都是购自西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国),除非另有指示。

供体细胞的制备

成纤维细胞细胞行建立了从男性供者细胞Diannan小型猪胎儿在妊娠期30天。胎儿没有头,四肢或内脏剁碎和消化杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Gibco)含20%胎牛血清(的边后卫;penicillin-streptomycin Hyclone) 1%, 1毫克/毫升胶原酶IV 4 h在37°C。细胞在1000转离心5分钟,resuspended与10%的边后卫和1% penicillin-streptomycin DMEM补充,然后培养瓶直到融合增长到90%。细胞在DMEM进一步通道和冷冻包含20%的边后卫和10%二甲亚砜,以供将来使用。

在体外卵母细胞的成熟(IVM)

猪卵巢从Hongteng收集屠宰场(呈贡瑞食品有限公司有限公司,昆明,云南,中国)允许使用动物器官在这项研究中,和卵巢被运到实验室在0.9% (w / v)氯化钠溶液25 - 30°C。卵母细胞的获取和培养使用相同的方法如前所述[12]。

体细胞核移植

使用IVM SCNT执行卵母细胞作为受体细胞质,如前所述12]。培养38-42 h后,卵母细胞与扩大积云细胞简要处理0.1% (w / v)透明质酸酶和剥蚀积云细胞使用挺拔玻璃毛细管吸管。卵母细胞第一极体挤压与统一的细胞质融合培养NCSU23中补充了秋水仙胺0.1μg /毫升、0.05蔗糖和4毫克/毫升BSA为0.5 - 1 h。每个重构胚胎形成于一个供体细胞插入的卵周空间是一个无核的卵母细胞通过精密控制。重构胚胎融合与单一的200 V直流脉冲/ mm 20μs使用LF201电细胞融合发生器(NEPA基因有限公司、日本)在媒介融合(0.25 D-sorbic酒精,0.05毫米毫克(C₂H₃O₂)₂、20毫克/毫升BSA和0.5毫米玫瑰[无酸的])。然后重构胚胎培养2 h PZM-3和被激活的单脉冲150 V /毫米100 ms的激活介质包含0.25 D-sorbic酒精,0.01毫米Ca (C₂H₃O₂)₂,0.05毫米毫克(C₂H₃O₂)₂、BSA和0.1毫克/毫升。重构胚胎平衡与5μg /毫升PZM-3补充细胞松弛素B 2 h为38.5°C在湿润的气氛中有5%股份有限公司₂,5%的人啊₂,90% N₂(APM-30D, ASTEC,日本)。

重构胚胎培养

重构胚胎培养PZM-3中、被置于湿润孵化器提供5%的股份有限公司₂,5%的人啊₂,90% N₂38.5°C。乳沟和胚泡形成监控2天至7天,分别。胚泡的数量清点固定和Hoechst33342染色后在紫外线显微镜下观察。

胚胎移植

杂交(巨大的白色/长白猪杜洛克猪)国债被用作克隆胚胎的代孕母亲,如前所述[12]。手术后发现怀孕大约23天转移使用超声波扫描仪(hs - 101 v,本田电子有限公司有限公司Yamazuki,日本)。

微卫星分析

血统分析产生的小猪SCNT和代理收件人确认小猪从供体细胞的遗传同一性。孤立的基因组DNA样本来自每一个小猪(耳组织)和接受者(耳组织)被用于微卫星分析和被送往一家专门从事血统验证猪(上海GeneCore生物技术有限公司,中国)。微卫星分析的基因组DNA进行了使用10 porcine-specific微卫星标记(S0026、S0070 S0155, S0226, SW122, SW72, SW830, SW840, SW857和SW936)标记荧光染料的家。

数据的时间和成本SCNT在猪身上

从卵巢收集到所需的总时间移植可分为如下:(1)的时间吗在体外卵母细胞的成熟包括卵巢收集和培养基制备,cumulus-oocyte复合物的愿望(COCs)窦的abattoir-derived卵巢的卵泡,供体细胞的制备;(2)克隆胚胎的时间建设包括培养基的制备,插入,阐明的卵母细胞中插入一个供体细胞,electro-fusion和卵母细胞的激活,平衡PZM-3重构胚胎的媒介。时间SCNT是往返时间从实验室的猪农场+ 6 - 7男工人所需的时间将收件人金边债券/关闭操作表。

成本可以计算如下。每天花费20.60美元为卵巢收集和20.60美元或41.20美元培养50 - 200或250 - 400克隆胚胎,分别。此外,它的建造成本56.00美元200 - 400年克隆胚胎移植的胚胎和69.30美元。此外,大约577.30美元的成本需要增加收件人镀金。我们忽略了低值消耗品的成本在计算这些成本。

统计分析

的比例数据,使用四组之间的差异进行了分析(Statview^®软件包)。水平的重要性设置为P < 0.05。

结果

在体外和在活的有机体内克隆胚胎的发展能力

我们调查了在体外和在活的有机体内克隆胚胎的发育能力来源于胎儿成纤维细胞(ffc) Diannan小型猪。结果表明,卵裂率和囊胚形成率分别为80.3%和22.8%,分别(表1)。

克隆的胚胎都转移到9收件人金边债券,其中8怀孕和7进行妊娠足月。最后,19住小猪和15胎死腹中的小猪被自发恢复6收件人金边债券交付。此外,3住小猪(没有胎死腹中小猪)获得从1受体镀金剖腹产手术(表2)。

总共37的小猪出生7收件人金边债券,和17这些小猪存活到成年,吸引Diannan微型猪交配产生后代(图1)。另一个收件人没有回热,手术内容没有显示胎儿在子宫妊娠114天。15胎死腹中仔猪的死亡原因所决定的尸体剖检。其中,11个胎死腹中小猪已经正常表型开胸探查后,鲜红的血液,和纤维母细胞细胞株,建立了来自他们的耳朵组织。因此,我们推断,这些小猪遭受由于产时死亡难产。其他四个小猪,体重过轻,柔软的身体,纤维母细胞细胞系无法建立,死因是决心足月前blastocolysis密切。因此,死产率达到29.7%(11/37),死于blastocolysis只有10.8% (4/37)(表2)。同窝出生的最高数字是11的小猪。接受者的整体怀孕率为88.9%,交货率为87.5%,垃圾的平均尺寸为5.3的小猪,克隆效率为0.93%(表3)。

相比之下,克隆效率定义为住小猪的总数除以总数量的接受者是2.44表3。此外,我们比较了克隆效率获得19个不同的供体细胞类型,在先前发表的论文,详细住小猪的总数除以总数量的接受者,而从0.05到1.7不等。只有1供体细胞类型达到3.0的效率,但收件人的总数是3.0。为Diannan微型猪,小猪生活的总数除以接受者的总数是2.44,这是高而获得了19个不同的供体细胞类型的值表3。此外,血统分析克隆小猪,供体细胞,代孕母亲。每一个小猪的基因型完全相同的供体细胞,但不同的代孕母亲。由于测序错误,克隆小猪# 24日# 31 # 36和微卫星不同于那些的供体细胞表1。这些数据证实了小猪来自细胞系获得用于SCNT。在一起,这些发现表明,供者细胞来源于Diannan小型猪构成价值的细胞来源,供SCNT猪生物医学模型的生成。此外,有必要提出一个合理的科学的方法来评估猪的克隆效率。

出生时身体重量的克隆和人工受精男性Diannan小猪所示表2。的平均体重(713克)的克隆组显著大于似乎与集团(566克)(P < 0.01)。尽管生活克隆组的平均体重(738克)的略低于产时死亡克隆组(795克),两组之间没有显著性差异(P > 0.05)。此外,克隆产时死亡组中最重的猪是1397 g。死亡的平均体重blastocolysis克隆组(350克)明显低于那些生活克隆组和产时死亡的克隆组(P < 0.01)。

这些数据表明,11个胎死腹中的小猪会幸存剖腹产之前执行妊娠期。如果事件发生在这种方式,在我们的研究中获得的克隆结果和效率会比上述的结果。

时间和成本SCNT在猪身上

的时间和成本SCNT在猪进行了总结表4和表5,分别。具体来说,要求59.0 - -238.9分钟生成100 - 800在体外成熟卵母细胞,141.7 - -549.5分钟需要重建50 - 400克隆胚胎。此外,7男工人需要将接收到手术台上胚胎移植可以开始,总共需要477.0分钟。因此,上述时代的总额,来自哪里在体外成熟oocytesto胚胎移植,是677.7 - -1265.4分钟(表4)。在成本方面,20.60美元是卵巢的成本收集、和成本20.60美元或41.20美元培养50 - 200或250 - 400克隆胚胎,分别。此外,它的成本28.00美元或56.10美元50 - 150或200 - 400建筑克隆胚胎,分别为胚胎移植和69.30美元。此外,一个大约577.30美元为每个收件人镀金是必需的。总共支付715.80美元,743.90美元和764.50美元需要转移50 - 150,分别为200年和250 - 400年克隆胚胎(表5)。值得注意的是,成本只增加了6.8%,当移植克隆胚胎的数量从50增加到400。这些结果表明,在猪身上的时间和成本SCNT主要取决于代孕母猪时的成本转移一定数量的克隆胚胎。

*没有。的在体外成熟卵母细胞= No。的克隆胚胎×2。

讨论

大型动物的克隆效率和老鼠,通常定义为生活克隆动物的总数除以总数量的胚胎转移,范围从0到20%,使用率不到3%的典型猪(13,23- - - - - -25]。此外,最近的研究表明,猪的克隆效率一直使用各种方法,计算中描述表3,这使得克隆效率的评估在不同猪品种混乱。虽然克隆效率的计算基于生活克隆动物的总数除以总数量的转移为小鼠胚胎是客观的和合理的,猪的整个克隆过程需要几个步骤,其中包括卵巢集合,在体外成熟的卵母细胞,重建的克隆胚胎,胚胎移植,繁殖收件人金边债券。完成整个过程需要超过114天,虽然它只需要2.5天从卵巢收集到胚胎移植(图2和表4)。此外,传输的总成本是由收件人镀金的成本,这是超过80%的总成本(表5)。因此,我们相信,猪的克隆效率的计算方法应该考虑接受者国债的数量。此外,一些研究表明,过多的克隆胚胎转移到个人代理人不会增加猪的克隆效率(21]。因此,在这种情况下,计算克隆效率的“克隆总数或生活克隆小猪除以总数量的接受者”是客观和合理的猪。然而,猪SCNT上面描述的是一个复杂的多步骤过程。此外,我们应该考虑的成本和时间等大型动物猪。因此,许多因素被认为导致克隆效率的结果。因此,如果克隆效率定义为“生活克隆小猪总数除以总数量的转移接收金边债券”,我们需要努力提高克隆胚胎的质量,克隆胚胎转移的数量在一个收件人镀金,排卵和胚胎移植,胚胎移植的操作技能,接受者的饲养管理国债以及克隆的个体的存活率收件人镀金的诞生。要解决这些问题,我们可以提高猪的克隆效率。

克隆小猪的数量也是一个主要因素在决定克隆效率的水平,证明以前用于克隆效率的计算方法。众所周知,克隆小猪的死亡率由SCNT是一个主要的问题26]。我们的研究结果表明,11个胎死腹中小猪产时去世,3额外胎死腹中小猪死于blastocolysis近足月(表2)。先前的结果表明显著延长生育间隔和死胎率之间的联系,表明死产率显著增加,当个人小猪出生间隔超过1 h [27]。我们的研究结果还表明,怀孕和生育间隔的长度明显长于那些小猪人工授精表3。这种联系可以解释克隆小猪的死亡率,应与负相关的能动性和驱逐猪胎儿和不足母婴(相互影响28]。此外,我们还观察到角子宫粘连产生的接受者转移克隆胚胎的子宫(数据未显示),这可能成为另一种解释造成孕妇的死亡率。一个方法用于提高克隆小猪在出生时的存活率已被剖腹产交付小猪(29日,30.]。我们的研究结果表明,三过健康的小猪被剖腹产恢复表2。此外,从23日接受英国国债获得的数据也证实,克隆小猪的存活率也会明显增加了剖腹产(数据未显示)。

结果SCNT可以受到多种因素之间复杂的相互作用的影响。虽然这些因素很难控制,其他人,比如核供体细胞来源的选择,可以帮助增加克隆的效率(21]。我们的研究结果表明,8人(88.9%)怀孕,和7(87.5%)这些生了37个后代,平均每个收件人5.3小猪窝大小和最大垃圾大小11小猪表2。此外,我们比较了克隆效率获得19个不同类型的供体细胞在先前发表的研究中,利用和克隆效率从0.05到1.7不等。虽然,1类型的供体细胞达到3.0的效率,接受者的总数只有3.0。Diannan迷你猪的克隆效率为2.44,高于获得19个不同的供体细胞类型表3。我们的研究表明,供者细胞来源于Diannan小型猪是一个有价值的细胞源供SCNT猪生物医学模型的生成。然而,猪克隆的效率仍然很低,和它的应用程序是有限的,这表明需要进一步改善。

总之,我们的结果表明,供者细胞来源于Diannan小型猪构成价值的细胞源供SCNT猪生物医学模型的生成。此外,我们表明,猪的克隆效率的定义为“生活克隆小猪的总数除以总数量的转移接收金边债券”可能是一个合理的和科学的策略。

ACKNOLEDGEMENT

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号31360549和31360549),云南省自然科学基金重点项目(批准号2013 fa016)和科学基金会云南省教育部重点项目(批准号ZD2013003)。

表乍一看


表1	表2	表3	表4	表5

数据乍一看


图1	图2

引用

Niemann H和Lucas-Hahn体细胞核移植克隆:实际应用和当前立法。天线转换开关的国民动画(2012);5:2 - 10。
馆,等。由显微镜下注射猪克隆胎儿成纤维细胞的细胞核。科学(2000);289:1188 - 1190。
Polejaeva IA、et al .克隆猪由从成年体细胞核移植。大自然。(2000);407:86 - 90。
Betthauser J, et al。从体外克隆了猪的生产系统。生物科技Nat》(2000);18:1055 - 1059。
Hoshino Y, et al。体细胞核移植胚胎的发育能力重建与卵泡卵母细胞体外成熟壳在小型猪。克隆干细胞(2005);7:17-26。
三好K等。克隆小型猪的诞生源自体细胞核转移胚胎激活超声波治疗。摩尔天线转换开关Dev (2007);74:1568 - 1574。
山中K, et al .激活疗法对肌动蛋白丝的影响分布和体外发展小型猪体细胞核移植胚胎。J天线转换开关Dev (2007);53:791 - 800。
埃斯特拉达杰,等。成功克隆的尤卡坦半岛minipig使用商业/西方胚胎孕育卵子捐赠者和接受者。克隆干细胞(2008);10:287 - 296。
Kurome M,等。生产转基因和非转基因克隆小型猪的体细胞核转移。J天线转换开关Dev (2008);54:156 - 163。
赵J, et al .显著改善克隆效率天生的小型猪的组蛋白脱乙酰酶抑制剂体细胞核移植后治疗。临床生物天线转换开关。(2009);81:525 - 530。
李Y, et al。生产克隆小型猪的摘出术使用轴视图系统。ReprodDomestAnim (2010);45:608 - 613。
魏H,等。比较的班纳微型纯系猪体细胞核移植的效率在不同的供体细胞。《公共科学图书馆•综合》(2013);8:e57728。
Kurome M,等。影响因素通过核移植的效率产生转基因猪:现有生物科技大数据集的分析。BMC》(2013);13:43。
坎贝尔KH, et al .克隆:八年后多莉。ReprodDomestAnim (2005);40:256 - 268。
里希特,等。主要的潜力为体细胞核移植肾细胞介导转基因技术在猪。生物科技BMC》(2012);12:84。
胡锦涛W,等。云南省地方猪种的遗传多样性推断从血液蛋白质电泳。麝猫(1998);36:207 - 212。
太阳H, et al .缺血后处理能抑制细胞凋亡在猪急性心肌梗死后。心脏杂志论坛(2010);13:e305 - 310。
王F,等。云南省小型猪麻醉管理与原位心肺移植。昆明医科大学学报(2012);4:34。
Kurome M,等。从唾液gland-derived祖细胞克隆了猪的生产。克隆干细胞(2008);10:277 - 286。
Shimatsu Y, et al。生产克隆nib生物科学研究所(日本)和α-1 3-galactosyltransferase淘汰赛MGH小型猪通过体细胞核移植使用代理人的nib品种。异种移植(2013);20:157 - 164。
李Z, et al .供体成纤维细胞的细胞类型和克隆胚胎转移号码猪克隆的效率。细胞重新编程(2013);15:35-42。
黄Y, et al。猪体细胞核转移效率相关因素的回顾性研究胚胎接受者和胚胎转移。开放杂志(2013);2:1223 - 1228。
Thuan NV, et al。如何提高老鼠克隆技术的成功率。J天线转换开关Dev。(2010);56:20 - 30。
船长年代,et al。影响因素的发展在牛体细胞核移植胚胎。J ReprodDev (2014);60:329 - 335。
Ogura, et al。最近的进步通过体细胞核移植克隆。费罗斯反式R B SocLond Sci杂志(2013);368:20110329。
Sprecher DJ, et al .原因和控制猪死产。J是兽医协会(1974);165:698 - 701。
Vallet杰,et al。空子宫出生间隔空间的影响,胎儿和胎盘发展猪。动画天线转换开关(2011);125:158 - 164。
Bauersachs年代,et al。子宫内膜反应不同的克隆和受精的胚胎。《Sci》(2009);106:5681 - 5686。
古橙汁,et al。收件人品种对交付率的影响克隆小型猪。受精卵。(2009);17:203 - 207。
Siggers RH, et al。选择性剖腹产影响肠道微生物殖民成熟和延迟,但不会增加早产猪的坏死性小肠结肠炎。是杂志Regul中国Comp杂志(2008);294:R929-R938。