探索枯草芽孢杆菌作为Amorphadiene细胞工厂生产

文摘

在这项研究中,代谢工程策略和发酵优化应用于改善amorphadiene的生产。前者包括增加前体供应和提高外源Amorphadiene合成酶的表达(广告)枯草芽孢杆菌,后者的影响进行了探讨不同培养基成分和培养条件对amorphadiene生产。

关键字

Amorphadiene萜类化合物,枯草芽孢杆菌、发酵

酶的缩写:

dx: 1-Deoxy-D-xylulose - 5-phosphate合酶;IspC: 1-Deoxy-Dxylulose - 5-phosphate reductoisomerase;IspD: 4-Pyrophosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol合成酶;哲学:4-Pyrophosphocytidyl-2-Cmethyl - D-erythritol激酶;IspF: 2 c-methyl-derythritol 2, 4-cyclopyrophosphate合酶;IspG: 1-Hydroxy-2-methyl-2 - (E)丁烯基4-pyrophosphate合酶;IspH: 1-Hydroxy - 2-methyl-butenyl 4-pyrophosphate还原酶;伊迪:Isopentenyl焦磷酸异构酶;当前:通过焦磷酸合酶;广告:Amorphadiene合成酶。

代谢物的缩写:

G3P: Glyceraldehyde-3-phosphate;DXP: 1-Deoxy - D-xylulose 5-phosphate;议员:2-C-Methyl-Derythritol 4-phosphate;CDP-ME: 4 -(胞嘧啶核苷5 ' 2-c-methyl-d-erythritol -pyrophospho);CDPMEP: 2-Phospho-4(胞嘧啶核苷5 ' - 2-C-methyl-D-erythritol -pyrophospho);MEcPP: 2-C-Methyl - D-erythritol 2、4-cyclopyrophosphate;HMBPP: 1-Hydroxy-2-methyl-2-butenyl 4-pyrophosphate;IPP:焦磷酸Isopentenyl;DMAPP:焦磷酸Dimethylallyl;GPP:焦磷酸香叶; FPP: Farnesyl pyrophosphate.

介绍

萜类化合物,作为一个庞大而多样化的类天然产物,传统上被用于食品、化妆品、化工和制药工业领域由于他们的多才多艺的生物活性1,2]。从本地植物萃取效率低以及复杂的化学合成成本较高,很难大规模生产萜类化合物在满足日益增加的需求供人类使用。幸运的是,新兴的生物技术领域,促进萜类化合物的生物合成通过开发微生物细胞工厂,具有环保和廉价的优势(3,4]。近几十年来,枯草芽孢杆菌据报道被其内源性高异戊二烯生产商2-C-Methyl-D-Erythritol 4-Phosphate (MEP)通路产生C5萜类化合物的基本构建块,Isopentenyl焦磷酸(IPP)和Dimethylallyl焦磷酸(DMAPP)。众多一直努力探索其潜在高萜类化合物的生产(5,6)(图1一个)。作为新生物技术的问题报告,Pramastya等人成功地建造和改造枯草芽孢杆菌压力,使生产amorphadiene 416 mg / L,抗疟药物青蒿素的关键中间体,48小时后在摇瓶发酵规模。

关于这项研究

释放前体合成途径中的瓶颈问题,以往的研究主要集中在过度rate-liming酶的议员单独途径,已取得一些进步萜类化合物的生产(6]。然而,Pramastya和他的同事们开始挑战介绍整个议员通路(IspC dx, IspD,哲学IspF, IspG和IspH)和下游通过焦磷酸合成酶(当前)作为一个操纵子枯草芽孢杆菌质粒构建p04SDFHCEGA (图1 b)。值得注意的是,一个大约4倍(从0.78 mg / L / OD 2.74 mg / L / OD)增加amorphadiene观察生产水平与亲本菌株相比,这可能主要是属性的两个优势。

首先,八个基因的转录水平从这个大质粒几乎无论操纵子的位置相似,表明单一启动子控制的操纵子的有效性和稳定性,通过实时定量PCR分析。第二,θ复制质粒构建隔离的稳定,甚至有90%保留40代后不需抗生素的条件。这是与之前的研究一致,也取得了高度改善角鲨烯的生产,类胡萝卜素和taxadiene采用p04SDFHCEGA枯草芽孢杆菌(7- - - - - -9]。作者进一步集成一个额外的副本通过焦磷酸合成酶源于酿酒酵母(Scfpps)已被证实比当前固有的,更有效率的基因组枯草芽孢杆菌促进更多的FPP的形成,这导致增强amorphadiene的生产,达到从35.25 mg / L为42.50 mg / L。

不同的真核蛋白在原核细胞中表达在某些情况下可能是棘手的。多种策略进行了调查要解决这个问题,例如,减少宿主菌株生长温度,引入特定的本地或人工合成的氨基端编码序列/肽标签,融合伴侣蛋白以及co-overexpressing监护人(9- - - - - -13]。植物的广告时也显示溶解度低水平表达枯草芽孢杆菌。这项研究的一个关键特性是融合codon-optimized绿色荧光蛋白(GFP)的n端广告作为融合伙伴旨在提高翻译效率,因此蛋白质的表达广告(图1 c)。这成功地增加了双重的(从0.35 mg / L / OD 0.78 mg / L / OD) amorphadiene的收益,与此同时,广告的GFP荧光作为一项指标表达式。然而,GFP融合有时可能会妨碍融合萜烯合成酶的催化活性,因此未能提高目标萜类化合物生产(14]。这种现象的潜在机制仍unelucidated。然而,利用这种方法扩展了候选人的融合蛋白,并在未来的探索和应用程序高度赞赏改善其他莫名的蛋白质的溶解度细菌。

优化发酵过程是一个重要的一步的收益率最大化期望的产品(15]。每个品种需要特定的发酵培养基和工艺。部分因子设计来系统地研究碳源的影响,基质议员通路,缓冲区,单价和二价离子。被Pramastya et al ., K2HPO4和丙酮酸是两个主要因素对amorphadiene生产产生积极影响枯草芽孢杆菌。K2HPO4不仅充当缓冲调整介质的pH值,同时也作为核酸的生物合成的关键组件和微生物细胞膜的磷脂。丙酮酸和Glyceraldhyde-3-Phophate (G3P)的起始前体议员通路,而每个组件供应不足可能会限制异戊二烯形成的效率(15,16]。

结论

提供更多的在中促进丙酮酸平衡细胞内丙酮酸的比例和G3P,据报道是前体合成一个关键需求,并极大的提高了amorphadiene生产。观察,在这些条件下大量的amorphadiene送到,但是运输的机制在枯草芽孢杆菌细胞信封还需要探索。提出一个有前途的方向和策略调查amorphadiene传输的机制,这可能导致细胞外amorphadiene产量的进一步提高。总之,尝试在基因工程主持人应变和优化发酵过程提供了更详细的见解提高枯草芽孢杆菌amorphadiene的潜在生产高,这可以作为一个通用的策略对构建细菌overproducers biosynthesize萜类化合物。

承认

屈服强度承认中国奖学金委员会的资助。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

引用

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