大豆(Glycine max)乙醛酶基因的表达分析表明其生物胁迫特异性改变

摘要

解毒一种高细胞毒性代谢物甲基乙二醛(MG)的分解是通过两种乙二醛酶的连续作用进行的，乙二醛酶I (GLYI)和乙二醛酶II (GLYII)。乙醛酶蛋白的生理和代谢作用已在各种植物和动物物种中得到了全面的研究。此前的大豆全基因组分析表明，大豆中存在41个GLYI和23个GLYII蛋白，分别由24个和12个基因编码。GmGLYI和GmGLYII基因的表达受到不同发育刺激和非生物胁迫的调控。在本研究中，利用公开的微阵列数据，分析了大豆乙醛酶基因在五个不同发育阶段和八个组织中的表达，以及对各种生物胁迫的响应。GmGLYI-7、GmGLYI-10/21、GmGLYII-1/8和GmGLYII-6在各发育阶段和组织中均有高表达，极少有例外;而GmGLYI-6/9、GmGLYI-20、GmGLYII-6和GmGLYII-10表现为生物胁迫特异性调节。然而，观察到的改变非常复杂，这取决于感染生物的持续时间和类型。

关键字

glyglyalase, Glycine max，生物应激，芯片。

缩写

MG:甲基乙二醛;GLYI:乙醛酶I;GLYII:乙二醛酶II;还原性谷胱甘肽;DPI:感染后日;HPI:感染后小时

简介

乙醛酶系统是一种高度保守的进化途径，由两种巯基依赖酶组成;乙醛酶І (GLYI)和乙醛酶II (GLYII)。乙醛酶途径在还原性谷胱甘肽(GSH)的帮助下将细胞毒性代谢物甲基乙二醛(MG)解毒为其无毒形式d -乳酸盐。游离MG与谷胱甘肽形成非酶促半硫缩醛加合物，经GLYI作用异构化为s - d -乳酰谷胱甘肽(SLG)。GLYII进一步将SLG水解为d -乳酸并再生谷胱甘肽[1］．乙醛酶途径最早是在一百多年前(1913年)在兔子和狗这两种不同的生物中发现的[2］．后来，乙醛酶基因/蛋白质被报道来自广泛的物种，包括大肠杆菌,酵母，真菌，植物，哺乳动物，智人被发现是高度保守的[2，3.］．

化学上，甲基乙二醛(MG)是一种活性α，β-二羰基醛。它可以通过与细胞大分子如DNA、RNA和蛋白质形成加合物来破坏细胞功能;并形成提前糖基化终产物[2］．在所有生物体中，在各种不利条件下，细胞内MG水平均升高，且与应激诱导的发病机制高度相关。MG水平升高与多种疾病有关;糖尿病、心血管疾病、癌症、肾病、视网膜病变、神经病变[4］．由于GLYI活性降低，MG在糖尿病患者体内积累，促进内皮细胞炎症、功能障碍和血管损伤[5］．据报道，在胁迫下，MG的积累在各种植物中增强，导致胁迫诱导衰老[6，7]。SLG的积累对生物系统也是有毒的，因为它可以抑制DNA合成[8］．因此，乙醛酶系统在对抗不良条件下MG的积累中起着至关重要的作用。在植物中有许多研究表明，乙醛酶通过维持细胞内MG水平而赋予植物对多种胁迫的耐受性[6，9，10]。此外，据报道，乙醛酶还参与了其他不同的重要细胞功能，如细胞分裂和增殖、微管组装和对氧醛毒性的保护[11］．因此，乙醛酶通路被认为是“细胞生长和分裂的标志”。表达的GLYI和/或GLYII转基因植物基因增强对多种非生物胁迫的耐受性[6，9，12，13]。因此，MG的积累和乙醛酶基因表达/酶活性都被认为是潜在的植物胁迫生物标志物[14］．

乙醛酶基因/蛋白质在各种微生物和哺乳动物中已被广泛研究，但关于植物乙醛酶的信息有限。乙醛酶基因的第一个全基因组分析已经从两个模式植物报道-Arabidopsisthaliana而且栽培稻［10］．作者预测了11种电位的存在GLYI和3GLYII水稻中的基因;11个假定的GLYI和5GLYII拟南芥的基因[10］．表达分析atgI / II和用osgI/II基因表现出发育和组织特异性调控。此外，对IR64和Pokkali这两种水稻基因型进行了qRT-PCR分析，发现了水稻中两个高度胁迫诱导成员OsGLYI-6而且OsGLYI-11．在大豆中，最近报道了乙醛酶基因全基因组分析[15］．大豆基因组综合分析鉴定出41个推测的GLYI和23个推测的GLYII蛋白，分别由24个和12个基因编码。利用公开的RNAseq数据，在不同的组织和发育阶段以及两种主要的非生物胁迫(盐度和干旱)下对这些基因进行表达谱分析[15］．本研究揭示了生物胁迫诱导的基因表达GmGLYI而且GmGLYII基因。

材料与方法

对应探针的识别Gmglyi而且Gmglyii基因

为了检索大豆乙醛酶基因在不同发育阶段、不同组织和不同生物胁迫下的表达数据，需要使用GmGLYI和GmGLYII基因对应的探针。

使用netafx Analysis Center (http://www.affymetrix.com/analysis/index.affx?navMode=cat530006&aId=netaffxNav)在线探针匹配工具使用各自的CDS序列作为查询。如果基因有多个探针集，则认为探针值最高;而多个基因显示相同的探针组被认为是相同的转录谱。

大豆乙醛酶基因芯片表达分析

从公开的Affymetrix大豆基因组阵列中检索了不同发育阶段、组织和生物胁迫的标准化和整理的表达数据，使用genevarcheator (https://www.genevestigator.com/gv/plant.jsp) [16，17]。genevarcheator处理了大量人工策划和质量控制的微阵列和RNAseq数据，这些数据来自各种各样的样品、组织和条件。分析了大豆的不同发育阶段，如萌发(61个样品)、种子生长(504个样品)、开花(3个样品)、果实形成(45个样品)和大豆发育(89个样品)。同样，在根(12个样本)、幼苗(2个样本)、下胚轴(14个样本)、叶片(3个样本)、花序(2个样本)、种子(39个样本)、胚(8个样本)和胚乳(8个样本)等8个组织中进行了表达检测。有关相应实验的详细信息已提供为额外的文件1。分析其对不同微生物的反应。Bradyrhizobiumjaponicum，Phakopsorapachyrhizi，Heteroderaglycines，Spodopteralitura,Rhizophagusirregularis，在默认参数下(使用id: GM-00028, GM-00033, GM-00036, GM-00046, GM-00048的实验)使用genevsigator检索相对信号比值，并使用log2转换后的折叠变化值生成堆图。所有这些实验的详细信息已包括在额外的文件2．所有试验均重复至少3次，并与相同重复次数的对照比较，计算倍变化值。使用Multi Experiment Viewer软件生成具有层次聚类的热图(http://www.tm4.org/mev/)与曼哈顿距离度量法[18］．

结果与讨论

表达分析GmGLYI而且GmGLYII不同发育阶段和组织中的基因

植物发育是一个高度复杂的过程，需要多种途径和基因的综合作用[19］．不同的发育阶段代表不同的基因种群亚群。大豆有五个不同的发育阶段:发芽、芽生长、开花、果实形成和大豆发育。所有的表达GmGLYI而且GmGLYII基因分析用基因调查员(https://genevestigator.com/gv/doc/intro_plant.jsp)基于微阵列数据，并绘制在带有标准差的散点图中。有些基因具有相同的探针集，被认为是相同的转录谱;而有些基因没有相应的探针，因此无法进行基因表达。一共24人GmGLYI和12GmGLYII基因;有19个找到了表达数据GmGLYI和8GmGLYII基因。这项分析揭示了GmGLYI7和GmGLYI-10/21在除开花外的所有发育阶段均保持较高的转录丰度GmGLYI-20表达量最大(图1)．同样的,GmGLYII-1/8和GmGLYII-6在除花期外的各发育阶段均表现出较高的表达水平GmGLYII-4/5的丰度最高(图1 b)．进一步，表达一切GmGLYI而且GmGLYII对大豆胚轴、胚根、幼苗、下胚轴、叶片、花序、种子、胚和胚乳等8个不同组织进行基因分析。GmGLYI7和GmGLYI-10/21在除叶片外的所有分析组织中均保持较高的转录丰度GmGLYI-23为峰值(图1 c)．如果GmGLYII家庭成员,GmGLYII-1/8在除根外的所有被分析组织中表达量均达到最大值GmGLYII-6表达量最高(图1 d)．这表明发育和组织特异性改变GmGLYI而且GmGLYII记录。在所有这些阶段和组织中具有非常高水平表达的基因表明了构成性表达，因为它们在正常的细胞/代谢过程中起着至关重要的作用。

表达分析GmGLYI而且GmGLYII基因对各种生物压力的反应

的非生物应激特异性反应GmGLYI而且GmGLYII基因之前分析过[15］．除了植物发育、组织特异性和非生物胁迫反应外，乙醛酶基因的表达也受到生物胁迫的调节[14］．大米的表达GLYI基因被发现对Xanthomonasoryzaepv。oryzae或Pyriculariagrisea感染(20.］．蛋白质组学比较Aspergillusflavus抗性和易感玉米籽粒胚中GLYI蛋白表达显著上调[21］．真菌感染显著提高易感基因型的细胞间甲基乙二醛(MG)水平，因此高GLYI活性是至关重要的。同样，在水稻和水稻中观察到GLYI活性的诱导芸苔属植物因应褐飞虱(Nilaparvatalugens),Sclerotiniasclerotiorum感染，分别为[21，22]。所有这些研究都令人信服地表明了乙醛酶基因/蛋白质在生物应激调节途径中的作用/参与。

为了深入了解生物胁迫下乙醛酶基因的调控，研究了所有乙醛酶基因的表达谱GmGLYI而且GmGLYII利用公开的微阵列数据，对不同类型的微生物进行基因分析。的表达GmGLYI而且GmGLYII基因是用Bradyrhizobiumjaponicum，Phakopsorapachyrhizi，Heteroderaglycines，Spodopteralitura,Rhizophagusirregularis不同时间间隔的感染。b .日本血吸虫是豆科根结瘤固氮品种，可提高作物产量。p . pachyrhizi引起亚洲大豆锈病，产生突出的暗至红褐色病变。h·甘氨酸是毁灭性的大豆害虫，主要在根部感染。它导致生长抑制，根和茎坏死和叶片褪绿，并最终在总产量损失。美国litura是一种夜蛾，被认为是包括大豆在内的许多作物的主要害虫。r . irregularis是一种丛枝菌根真菌，常用于科学研究，以检查丛枝菌根真菌对植物生长发育的影响。作为对b .日本血吸虫感染(6 - 48hpi)GmGLYI基因表达呈散在式上调/下调;尽管所有GmGLYII基因在18 hpi前表达下调，24 hpi后表达上调(图2A及2B)．作为对p . pachyrhizi感染12 ~ 248 hpi时，调节水平最高(图2A及2B)．GmGLYI-6/9, GmGLYI-19/24而且GmGLYI-20在感染早期(12 hpi)和晚期(216和248 hpi)均表现出较高的上调;而GmGLYI-10/21, GmGLYI-18而且GmGLYI-23显示出强烈的下调(图2)．如果GmGLYII，GmGLYII-7/9, GmGLYII-6而且GmGLYII-10在感染早期(12 hpi)和晚期(216和248 hpi)均有较高水平的下调，其余成员表现为中低水平的改变(图2 b)．同样，在回应h·甘氨酸(2-10 dpi)，大部分GmGLYI转录水平被发现下调，除了GmGLYI-20表现出较强的诱导后期(5和10 dpi)(图2)。然而，大多数的GmGLYII转录本水平上调，而GmGLYII-6而且GmGLYII-10早期表现出较强的减少(2 dpi)(图2 b)．作为对美国litura而且r . irregularis，GmGLYI-17/22而且GmGLYI-2/13表现为中高水平上调，其余GmGLYI而且GmGLYII基因表现出最小的变化(图2A及2B)．这说明不同病原微生物和共生微生物对蛋白表达的影响是多样化的GmGLYI而且GmGLYII记录。

结论

综上所述，本研究揭示了生物胁迫与乙醛酶转录本改变之间的强相关性。MG的产生是胁迫植物的普遍现象，所有胁迫都高度调节glyoxalase基因(MG代谢途径)的转录。MG在玉米易感植物中的积累已被报道Aspergillusflavus感染(21］．因此，这些观察到的信息将鼓励研究人员对不同植物物种的乙醛酶基因在生物胁迫下的反应进行进一步的功能表征。

确认

作者感谢孟加拉国锡尔赫特沙赫贾拉尔科技大学提供后勤支持，感谢同一大学生物化学和分子生物学系提供实验室空间。作者感谢genev调查者的支持。

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