表达主要Cainine细小病毒的衣壳蛋白酵母(毕赤酵母属pastoris)和高效净化使用精氨酸在亲和色谱法

文摘

一个检测试纸(IC)测定了犬的快速检测细小病毒使用单克隆抗体(单克隆抗体)对犬细小病毒(CPV-2)。准备单克隆抗体、基因编码CPV-2a VP2蛋白的表达在毕赤酵母属pastoris pPICZ-A表达向量。VP2重组抗原相似函数证明了本机衣壳蛋白西方墨点法使用CPV - 2多克隆抗血清。融合产生的单克隆抗体对CPV-2骨髓瘤细胞系SP2/0与Balb / C小鼠脾细胞免疫纯化重组VP2蛋白。通过ELISA结果表明:单克隆抗体特别认可VP2 CPV-2但不是其他犬类病毒的抗原表位,如犬瘟热病毒(CDV)或犬腺病毒(CAV)。IC分析开发的适用于快速检测犬细小病毒单克隆抗体。粪便样本(120)分析了从疑似CPV-2感染的狗都haemaglutination (HA)分析和集成电路分析,和52和53个样品被发现阳性CPV-2,分别。比较这两种不同的化验显示,IC分析一样敏感哈;集成电路检测的敏感性和特异性分别为98.6%和98.1%,分别。

关键字

犬细小病毒;检测试纸测定;单克隆抗体;重组蛋白VP2

介绍

犬细小病毒2型(CPV-2)成为新的病原体引起急性出血性肠道疾病在年轻的狗1]。CPV-2感染的死亡率高的小狗狗已成为一个重要的疾病。CPV-2小nonenveloped病毒单链,消极意义上讲DNA基因组。基因组DNA是大约5.2 kb (2)编码两种结构蛋白VP1和VP2和两个非结构蛋白NS1 NS2 [3]。VP2是主要包含主要衣壳蛋白抗原决定因素也扮演着重要的角色在决定病毒致病性(4- - - - - -7]。VP2已被证明是有用的对犬细小病毒病的诊断和免疫。

许多敏感CPV-2感染的分子检测方法被开发出来,包括pcr (8,9),嵌套PCR (10)和实时PCR (11- - - - - -14]。那些不适合农民的检测。免疫学方法比PCR方法不太敏感,但他们提供field-friendly,廉价的方法来检测并确认病原体在疾病暴发和高精度的方式(例如,测试条)适合非技术人员使用(15,16]。在这项研究中,我们成功地开发了一个简单,快速,但非常敏感检测试纸(IC)测试条CPV-2感染的检测使用单克隆抗体(单克隆抗体)的特定CPV-2衣壳蛋白VP2蛋白重组的CPV-2做好准备。

方法和材料

病毒、细胞、小鼠和样本

犬细小病毒的B2004应变从我们实验室的股票,这是一个生病的狗粪便中分离出在北京(17]。其基因组序列(加入。EF011664)表示,B2004是广泛分布的成员CPV-2a subclade [17]。FK81(猫肾细胞系)细胞“农业部的临床中心”是生长在含有10%胎牛血清的DMEM。Sp2/0(小鼠骨髓瘤)细胞被存储在我们的实验室。清洁雌性BALB / c小鼠(6周大)购买从北京商务部科技公司的实验室动物。

120年收集粪便样本与肠胃炎120只狗。收集使用的拭子样本犬粪便插入包含1毫升的测定稀释剂的样品管。拭子被测定稀释剂来提取样品。113人从一个5个月大的幼崽。

制备酵母(毕赤酵母属pastoris)表达重组VP2蛋白

构建重组质粒pPICZ-VP2毕赤酵母属pastoris

病毒基因组DNA提取使用病毒基因组提取工具从感染的细胞(试剂盒、上海、中国)根据制造商的指示。全长VP2基因PCR,扩大了使用两个引物(Uvp2:5'CATCGAATTCAG AATAATGTCTATGAGTGATGGAGCAGTT3”(EcoRA¢A…A), Lvp2: 5 'gcccgtcgacatataattttctaggtgtag3a‹一Š(XhoA¢A…A))。PCR产品使用Qiaquick gel-purified凝胶萃取工具包(试剂盒、上海、中国)和克隆到pPICZ-A向量(pPICZ-A Kit表达,表达载体,卡尔斯巴德,美国),根据制造商的协议。重组阳性克隆测序验证了。

p . pastoris转换和表型选择

所有的方法p . pastoris(x 33)转换和选择之后容易选择推荐的毕赤酵母表达工具包(美国卡尔斯巴德表达载体)。转化株受到100μg /毫升zeocin选择酵母提取物(1%)胨(2%)葡萄糖(2%)山梨糖醇(1米)(YPDS)琼脂两到三天28°C。感兴趣的基因的多个副本被插入到酵母基因组通过同源重组multicopy集成、转化株筛选通过裸奔YPDS琼脂包含500μg /毫升和1000μg /毫升zeocin。

重组蛋白表达

小规模表达试验是由播种5毫升文化生长在缓冲glycerol-complex (BMGY)介质(1%酵母提取物,2%蛋白胨,100毫米磷酸钾,氮1.34%酵母基地,生物素0.002%,1%甘油)12 - 16个小时28°C用颤抖的250 rpm。一旦达成了OD600 5.0,细胞颗粒状1500 Xg和洗一次缓冲methanol-complex (BMMY)介质(1%酵母提取物,2%蛋白胨,100毫米磷酸钾,氮1.34%酵母基地,生物素0.002%,0.5%甲醇)之前再悬浮在同一介质给OD 600 1.0。甲醇诱导重组VP2蛋白表达进行了72小时28°C和0.5%甲醇补充每24小时。

sds - page及免疫印迹分析

甲醇诱导后,分泌蛋白质被10%三氯乙酸沉淀。蛋白质样本调整1 x减少样本缓冲区,加热在95°C 5分钟和分离dodecylsulfate钠13%聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)对精度+蛋白质标准(Bio-rad,赫拉克勒斯加州)。样本在第二BioRad迷你蛋白质电泳装置在180 V与页蓝色染色前45分钟。蛋白质免疫印迹,gel-resolved被electrotransferred聚乙二烯二氟化物(笼罩;纽约东部丘陵)膜BioRad半干转移装置15 V 30分钟。膜与5%的脱脂奶粉立即封锁了三羟甲基氨基甲烷缓冲液salinetween 20 (TBS-T)缓冲区(0.02米三,137毫米氯化钠,0.1% Tween20, pH值7.6)与温柔摇一小时25°C。膜与TBS-T洗3×5分钟和孵化主要抗体,再洗;绑定的主要抗体检测与山羊anti-mouse辣根过氧化物酶(1:1)。膜的清洗的最后一次,合激活SuperSignal西方Pico化学发光工具包(美国罗克福德皮尔斯)根据制造商的指示。膜被包裹在一层保鲜膜,接触到CL-XPosure电影(美国罗克福德皮尔斯)外墙面分钟。 Protein signals were developed in GBX developer and in replenisher solution for <1 minute with agitation and excess solution was washed off with tap water. Films were then fixed in the GBX fixer and replenisher solution, and finally washed with water and allowed to dry.

表达和纯化的重组his-tagged VP2在很大规模

酵母转化株种植在BMGY中长期OD600 5.0 28°C生成生物质,然后酵母细胞洗前0.5%甲醇诱导BMMY中在20°C 48小时分泌表达。在完成蛋白质的表达,分泌his-tagged VP2从BMMY媒介集中70%硫酸铵沉淀。蛋白质颗粒在离心收集的20000 g和4°C 30分钟,然后轻轻在PBS resuspended浸泡和移液的组合。VP2丰富的样本对色谱分离平衡缓冲以去除多余的硫酸铵,他选择亲和纯化进行了根据制造商的指示。纯histagged VP2筛选了列与PBS缓冲交换和集中使用一个Amicon搅拌细胞8050配备了3 k MWCO膜(Pal l)。VP2净化被sds - page检测。蛋白质样品的浓度在PBS决定使用BCA蛋白质估计工具包(美国罗克福德皮尔斯)根据制造商的指示。

单克隆抗体的制备

免疫BALB / C小鼠纯化重组his-tagged VP2蛋白完全弗氏佐剂。200整除μg纯化蛋白的腹腔内注射30和60天后。小鼠安乐死5天后,脾脏被切除。脾细胞(6×10⁸)从免疫小鼠融合SP-2/0细胞(6×10⁷)。融合后的细胞被稀释的帽子(次黄嘌呤/氨喋呤/胸苷)中,分布在0.1毫升整除的井96井microtitre盘子。杂种细胞克隆产生抗原抗体ELISA筛选。Antibody-secreting肿瘤是由皮下接种3 - 5个月大的Balb / c小鼠大约5×10⁶混合细胞。动物是tail-bled当肿瘤3 - 5天后之间变得明显,抽血。肿瘤被删除,剁碎和冷冻液体N₂。收集腹水和离心20000克15分钟。条件培养基的单克隆抗体纯化使用蛋白质G-agarose列按照制造商的指示(罗氏)。通过sds - page单克隆抗体的纯度检查。抗体是透析对磷酸盐缓冲剂(PB: 10毫米磷酸盐缓冲剂,pH值7.3),和浓度调整到1毫克/毫升。

集成电路测试的准备和试验地带

集成电路测试条是为准备的图1。首先,一个单克隆抗体结合胶体金(直径= 10海里)和喷到玻璃纤维垫2μg /厘米干之前一夜之间在40°C。其次,另一个单克隆抗体(在0.5 - 1毫克/毫升)喷到硝基膜的位置将成为捕获测试线(T)附近的中间膜面向(左到右)。山羊anti-mouse IgG抗体(0.8毫克/毫升)喷洒到相同的硝化纤维膜的位置将成为加沙地带捕获控制线路(C),然后启动膜是干一夜之间在20°C。膜组装,干玻璃纤维垫包含单克隆抗体与胶体金结合在影射硝化纤维膜约5毫米左(下游)T线和上游的一个示例垫连接极左的膜。极右的影射膜,上游从C行,收集多余的样品的吸收垫在液体和促进样品流膜的应用程序。完成膜组装然后切成4.5毫米宽的条,分别被安置在塑料磁带存储干燥在塑料袋使用。

收集使用的拭子样本犬粪便插入包含1毫升的测定稀释剂的样品管。拭子被测定稀释剂来提取样品。四滴样本被应用于样品孔使用一次性滴管。最佳结果,5腹泻粪便农场进行了测试。测试结果在5 - 10分钟检查。的存在只有一个乐队在结果窗口中显示阴性结果(图1 b)。存在两种颜色乐队(“T”和“C”)在结果窗口中,无论哪一个乐队最先出现,表示积极的结果(图1 c)。

红血球凝聚(HA)测定

澄清的双倍稀释粪便样本在PBS (pH7.2)从一个1:2稀释。96年进行的测试是V-plates,使用0.8%的猪红细胞PBS。结果是读4小时后在4°C。

结果

重组VP2的表达和分析

通过sds - page VP2重组蛋白表达进行了分析。正如所料,蛋白质的分子量大约为68 KD (图2一个)。免疫印迹分析使用anti-His单克隆抗体和多克隆血清CPV-2(由太阳教授礼物)确认的真实性蛋白质带(图2 b和2摄氏度)。因此,his-tagged VP2成功表示为从适当的分子大小。

大规模表达和纯化协议his-tagged VP2优化。表达的重组VP2 YP为0.5%甲醇(pH值8)48小时28°C, 250 rpm震动。从BMMY媒介的分泌his-tagged VP2集中70%硫酸铵沉淀之后,他选择亲和纯化(图2 d)。高收益的重组VP2 (3 mg / L)。

单克隆抗体的制备

为了生成鼠单克隆抗体能够识别VP2我们使用纯化his-tagged VP2免疫原。抗原抗体ELISA筛选重复,导致27抗体和11个阳性菌株杂种瘤细胞系的强劲免疫反应性反对CPV-2。

四个免疫球蛋白类型的子类积极杂种细胞细胞系被确定的11阳性菌株选择(表1)。四个相应的抗体被命名为1 (1-7A7), 3 (1-7C1), 23 (8-3A4), 26日(9-2B3)。单克隆抗体(免疫球蛋白)产生的4株细胞系的蛋白纯化腹水,在杂种细胞和抗体滴度测定细胞supertant或腹水(表2)。sds - page分析表明,高纯度抗体(图3)。

表1。检测抗体滴度在杂种细胞细胞上清液。

表2。公顷,集成电路的测试结果。

间接ELISA试验表明,4单克隆抗体反应特别只有上层的VP2或CPV感染细胞,不与犬瘟热病毒(CDV)、犬腺病毒(CAV) SP2-20-infected细胞和寡聚组氨酸。

测试条优化

最终优化为一条测试,单克隆抗体1-7C1(12μg /毫升)结合胶体金是喷洒在玻璃纤维垫的每条5μl /厘米。测试(T)和控制(C)线,单克隆抗体9-2B3(0.5毫克/毫升)和山羊anti-mouse IgG抗体(0.8毫克/毫升)喷洒在分别在硝化纤维膜3μl /厘米。这些给最高的强度和浓度灵敏度稀释,感染样本没有假阳性感染样本。

特异性和灵敏度的测试

当样品准备从包含CDV粪便,骑兵和带测试,只有一个乐队在C观察,表明没有交叉反应与其他病毒有时与CPV-2并发感染犬。

120狗粪便样本测试集成电路分析和哈。结果表明,52和53个样品被发现阳性CPV-2,分别;和集成电路检测的敏感性和特异性分别为98.6%和98.1%,分别为(表1)。

讨论

CPV的快速检测感染尤其重要的犬舍和避难所为了隔离受感染的狗和防止继发感染的易感动物接触。雷竞技网页版测试检测病毒适合CPV抗原的抗体类方法诊断在兽医实践(15,18,19]。一个集成电路(IC)测试更容易执行,并提供结果更快(大约5分钟)对CPV检测应该有用。

在目前的研究中,类似的重组VP2 antigenetically本机衣壳蛋白质表达出对犬细小病毒单克隆抗体。从这些单克隆抗体IC测试准备犬细小病毒的快速检测。粪便样本(120)从狗怀疑CPV2感染血细胞凝集试验和分析了平行IC化验,52和53个样品分别发现CPV2呈阳性。比较两种不同的化验的结果表明集成电路分析是敏感哈,敏感性和特异性分别为98.6%和98.1%,分别。

利用集成电路分析/ HA是使用的从容。尽管哈测试粪便是特殊和敏感20.,21),它不能在农场进行设置,因为新鲜红细胞的要求。更简单的HA协议,指定为幻灯片凝集试验,提出了检测所有CPV变体在粪便和肠道样本,但这个测试似乎并没有克服传统方法的局限性(22]。

高特异性和低敏感性的抗原检测化验已经被最近的研究(23)对比了三种不同的商用工具:CPV抗原快速检测的基于抗体的测试,基于PCR的检测,immunoelectron显微镜。研究表明,集成电路测试的相对灵敏度没有超过50%的核酸的方法;而特异性IC (100%11]。

公园等。16]表示His-tagged VP2的犬细小病毒(CPV) VP2大肠杆菌和多克隆抗血清在兔子长大对大肠杆菌表达的重组蛋白VP2与商业单克隆抗体相比,在测试的大量粪便diarrhoeic狗诊所immuno-dot污点化验。多克隆抗血清被发现更快速、敏感,但不太特定的单克隆抗体。

尽管低灵敏度相比,pcr技术,集成电路片测试更方便,因为它可以通过农民在池塘边没有专用设备。

结论

IC板测试CPV-2开发使用特定的VP2马伯CPV衣壳蛋白。这个地带的检测灵敏度测试类似于哈。地带的简单性和特异性测试将使它适合确认CPV动物感染疾病暴发的早期阶段。

确认

这项研究受到了科技项目基金石家庄(不,09150293)和河北自然赠款(不,C2013407106)。作者感谢王教授Jian-Ying批判性阅读手稿。

引用

1. 汤姆森GW和盖格农。犬肠胃炎与parvovirus-like代理1978;可以审查J 19: 346。
2. 里德美联社et al,犬细小病毒基因组核苷酸序列和组织。J微生物学报1988;62:266 - 276。
3. 帕里什CR。映射在犬细小病毒的衣壳结构和特定功能作猫细小病毒感染性克隆质粒。病毒学1991;183:195 - 205。
4. Horiuchi M, et al .映射宿主范围的决定因素为犬细小病毒的基因组的细胞使用犬细小病毒/水貂肠炎病毒嵌合病毒。J创微生物学报1994;75:1319 - 1328。
5. Llamas-Saiz AL等al.Structural分析犬细小病毒的突变控制抗原性和宿主范围。病毒学1996;225:65 - 71。
6. 帕克JS和帕里什CR。犬细小病毒宿主范围是由一个额外的特定构象衣壳的区域。J微生物学报1997;71:9214 - 9222。
7. Strassheim ML, et al。两个主要中和抗原决定因素的犬细小病毒被发现的三倍飙升病毒衣壳。病毒学。1994;198:175 - 184。
8. 曹HS, et al。检测犬细小病毒在粪便样本使用loop-mediated等温扩增。J兽医成岩作用投资2006;18:81 - 84。
9. 邮寄M等小鼠睾丸的狗PCR污染的野生型犬细小病毒疫苗。中国Microbiol 1995;33:110 - 113。
10. Hirasawa T, et al .敏感检测犬细小病毒DNA的嵌套式聚合酶链反应。兽医Microbiol 1994;41:135 - 145。
11. Decaro N,等。快速检测和定量实时PCR检测犬细小病毒2型狗的粪便。兽医Microbiol 2005;105:19-28。
12. 伊利亚G, et al。检测感染犬细小病毒2型的mRNA实时rt - pcr。J性研究方法2007;146:202 - 208。
13. Kumar和南帝s . 2010。发展基于SYBR绿色检测和定量实时PCR试验犬细小病毒的粪便样本。J性研究方法2010;169:198 - 201。
14. 、AlmbergES et al。使用实时PCR检测犬细小病毒的粪便畅所欲言的狼。J Wildl说2012;48:473 - 476。
15. Lacheretz, et al .犬细小病毒的诊断快速immunomigration膜。兽医Rec 2003;152:48-50。
16. 公园JS, et al。Immunodetection犬细小病毒(CPV)在临床样本的多克隆抗血清对CPV-VP2(蛋白质表达的大肠杆菌作为抗原。J性研究方法2007;146:281 - 287。
17. 应H, et al .表达式或病毒衣壳蛋白的亚细胞定位和克隆基因的犬细小病毒来自中国。Res兽医Sci 2009;87:239 - 241。
18. Kumar M,等。多克隆抗体类AC-ELISA及其发展与PCR诊断犬细小病毒感染。性罪2010;25日:352 - 360。
19. Mildbrand MM, et al .快速检测犬细小病毒的粪便使用单克隆抗体和酶联免疫吸附试验。是J兽医Res 1984;45:2281 - 2284。
20. 卡迈克尔,et al .红血球凝聚犬细小病毒:血清学的研究和诊断应用程序。是J兽医Res 1980;41:784 - 791。
21. 数学,et al .红血球凝聚与formalin-fixed红细胞检测犬细小病毒。是J兽医Res 1983;44:150 - 151。
22. MarulappaSY和Kapil s .简单的测试,用于快速检测犬细小病毒抗原和犬parvovirus-specific抗体。中国疫苗Immunol 2009;16:127 - 131。
23. 施密茨年代,et al。比较三种快速商业犬细小病毒抗原检测与电子显微镜和聚合酶链反应测试。J兽医成岩作用投资2009;21日:344 - 345。