馈料式动力学和建模Schizochytrium Sp。fju - 512生长和DHA在发酵生产使用控制策略的转变

文摘

一组动力学模型建立了DHA的馈料式生产Schizochytriumsp fju - 512在151年和1001年发酵使用策略适用于氮气压力结合浓度和温度的变化。补偿参数n是集成到模型为了找到最优的数学方程。修改逻辑模型提出了适合细胞生长数据,得到了下面的动力学参数:μ_米h = 0.0525¹,X_米= 100 g l¹151年生物反应器和n = 4.1717,以及μ_米h = 0.0382¹,X_米l = 107.4371克¹1001年生物反应器和n = 10。利用Luedeking-Piret方程模型DHA被生产,产生的α值= 0.0648 g.g¹和β= 0.0014 g.g¹。h¹151年生物反应器,而α和β的值获得了1001年的发酵是0.0209 g.g¹和0.0030 g.g¹。h¹。建立的模型有一个很好的拟合精度和能够准确描述DHA生产过程的动态特性,利用Schizochytriumsp。fju - 512。

关键字

Schizochytriumsp fju - 512;二十二碳六烯酸;馈料式;物流模式;Luedeking模型

介绍

C22:6二十二碳六烯酸(DHA)是一种ω- 3多不饱和脂肪酸,对人体健康至关重要,因为它是一个主要的结构部件的中枢神经系统,视网膜和心脏组织1]。此外,它是一个著名的多不饱和脂肪酸巨大的经济价值,由于其广泛使用在食品相关行业及其潜在的应用在医学(2]。事实上,DHA一直在调查范围广泛的预防和治疗疾病,包括心脏病,高血压(3),炎症(4),癌症(5),和阿尔茨海默病(6]。

海洋真菌原生生物等Schizochytriumsp. DHA,优秀的生产商(7]。然而,大量的变量影响DHA产量Schizochytriumsp,如介质成分(8)、氮限制(9)、温度(10和氧气供应11),这使得高效的工业生产具有挑战性。一般情况下,细胞的脂质含量可以增强特定的文化条件下,如低温(12),低氧水平(13和氮的消耗14]。然而,这种不利因素也降低生物质产量,影响整个过程的效率。绕过这个限制,我们开发了一个氮限制,需要轮班和温度变化策略使高效DHA生产使用Schizochytriumsp。fju - 512。策略包含一个初始阶段有足够的氮,结合高和温度,以确保足够的生物量积累。建立一个数学模型,这一过程可以提供非常有用的信息对于扩大和利用工业培养过程的实现Schizochytriumsp.高质量生产DHA。尽管许多研究处理细胞生长动力学和发酵过程的数学建模15- - - - - -18),生产DHA的动力学Schizochytriumsp.在批处理和馈料式发酵过程仍然非常稀缺。歌等人开发了一个简单的批处理发酵模型,使用逻辑斯蒂方程对增长和DHA的Luedeking-Pirt-like方程生产和基质消耗Schizochytriumlimacinum OUC88 [19]。Surendhiran等人发现,氮是藻类生长的要素,他们提供了动力学模型模拟两种海洋微藻的生长和脂质生产nitrogen-replete和nitrogen-depleted条件下,使用物流和Luedeking-Piret方程(20.]。有必要调查半工业规模的动力学馈料式文化,因为通过的控制模型发酵强化DHA生产由于很难获得的液体发酵培养基矩阵。

在这项研究中,DHA生产的发酵动力学Schizochytriumfju - 512 sp。研究了在馈料式流程在不同的尺度,和微生物生长和DHA产量动态记录。我们建议修改模型,采用逻辑斯蒂方程为DHA产量增长和Luedeking-Piret-like方程。

方法

微生物

Schizochytriumsp。fju - 512用于所有实验。它最初使用松花粉引诱技术孤立。

媒介

基础培养基包括30 g / l葡萄糖,10 g / l蛋白胨,5 g / l酵母提取物和15 g / l海上盐用于常规培养。发酵培养基中含有30 g / l的葡萄糖,2.5 g / l (NH₄)₂所以₄15 g / l酵母提取物15 g / l蛋白胨,25 g / l海上盐,2 g / l KH₂阿宝₄、3 g / l Na₂所以₄,0.005 g / l的维生素B₁和0.005 g / l维生素B₁₂。

剂制备

静态的文化Schizochytrium。sp fju - 512出了2天28°C和用于接种1 l烧瓶内包含400毫升基础培养基。由此产生的文化孕育在28°C下常数轨道在230 rpm摇晃2天。

馈料式文化

馈料式文化进行了在151年和1001年的生物反应器(镇江东方生物技术设备和技术有限公司,中国),分别。文化条件如温度、pH值、做和搅拌速度自动控制。我们开始种植与初始卷8 l发酵罐151和551在1001发酵罐。随后,10 g / l有机氮源,20 g / l海上盐和80%葡萄糖不断被添加到发酵后剩余的葡萄糖2%以下时24 h。馈料式文化进行28°C的生物反应器mid-exponential阶段之前,之后,温度降至低于28°C到提高脂类的积累。初始充气率1 vvm随后手动调整。pH值维持在5.7±0.1自动添加28%工业氨。

生物量测定

10毫升细胞悬液样本来自文化和在8000转离心5分钟。细胞颗粒与去离子水冲洗和离心机在同样的条件下。这个过程被重复2 - 3次。在85°C细胞被洗干24小时获得干燥生物质用于确定细胞干重。

脂质提取

干细胞样品准备同上是直接用于脂质提取。细胞颗粒溶解于5毫升6 M盐酸和孵化1 h在80°C,之后使用2毫升的脂质提取正己烷和0.75毫升无水乙醇。混合物混合了强有力的涡流和离心机在800 Xg改善相分离为2分钟。提取过程重复了3次收集最大可能数量的脂质。总脂质测定重量分析地后蒸发的溶剂在氧氮加热块保持在50°C。

脂肪酸组成的分析

100毫克的脂质组成的一个整除transmethylated在62°C的1 h使用2毫升10% (v / v) methanolic盐酸。随后,脂肪酸甲基酯(饥饿)溶解在正己烷2毫升。gc - ms(安捷伦6890 N / 5975 C)饥饿是使用一个HP-INNOWAX毛细管柱进行分析(30 m×0.25毫米×0.25μm)。高纯氦(99.999%)作为载气的流量1.0 mL / min。喷油器温度维持在250°C,和一卷1μl注射使用分割模式在5:1的比例。列温度从150提高到220°C 10°C /分钟,进一步在2°C 230°C /分钟,保持5分钟。所有脂肪酸被确定通过比较NIST质谱库(美国安捷伦科技)。在电离质谱分析仪器的操作电压70 ev,扫描范围35 - 450阿姆河。脂肪酸的浓度计算基于总峰面积与内部标准相比,正如前面发表(21]。

定义动力学参数

为了防止高葡萄糖浓度的抑制作用在培养过程中,并获取最大的DHA产量,我们选择馈料式文化获得动力学,估计模型和计算参数。动力学参数的计算是根据以下方程:

(1)

(2)

细胞生长的逻辑常量是评估使用MATLAB中的cftool工具包7.1版。方程1和2被数值积分求解,数值解算器版本是用于拟合的结果。

结果与讨论

发酵条件的影响SchizochytriumSp。增长和DHA产量

一般来说,葡萄糖的利用Schizochytriumoxygen-limiting nitrogen-limiting条件下生产DHA。我们在几个阶段进行实验增加生物量浓度,促进生产DHA。的发酵过程Schizochytrium可以分为两个阶段(22]:第一阶段,细胞数量和生物量随着小脂类物质的积累,增加和第二阶段,细胞尺寸增大,由于脂质积累和DHA合成。首先,细胞迅速增长与快速葡萄糖消耗下足够的氮气和氧气供应,即溶氧张力(点)保持20%以上的空气饱和0 h和48 h之间通过手动控制搅拌器速度(范围:200 - 465 rpm)和曝气率(体积风量/文化/分钟,范围:1 - 2 vvm)。pH值保持在5.7±0.1自动添加28%工业氨在第一个60 h,和培养温度设置为28°C在第一次96 h。在第二阶段,细胞内脂质积累细胞扩张,但细胞的数量并没有增加多少在这个阶段和发酵的结束。众所周知,高碳氮比、低,低温对脂质积累和油质的DHA产量至关重要微生物(12- - - - - -14]。因此,它是没有必要调整搅拌和曝气率,和做的是限制在5%以内。随后,80%葡萄糖和10 g.l¹添加有机氮不断确保碳源和氮的供应过剩,这是没有调节pH值。96 h后,温度降低了从28°C到25°C到增强DHA积累。此控制策略的结果显示,DHA含量从44.1%上升到51.5%,减少36 h(后表1)。当可用碳不断增加,氮是有限的,发生从60 h的发酵,脂质含量从25.8%上升到29.4%。DHA是133.7 mg.l生产力¹。h¹在120 h后馈料式发酵,和DHA含量与栽培温度变化从42.2%上升到44.7%。然而DHA浓度经历了轻微的减少当我们降低了温度(表1)。最高累计生产120 h是通过使用喂养策略,与起重集团DHA产量和总产量达到103.9 g.l¹37.2 g.l¹和16.0 g.l¹分别为(表1)。

表1:生物量、组织和DHA获得馈料式文化的内容Schizochytriumsp fju - 512 15 l生物反应器。

本研究的结果表明,DHA产量Schizochytriumsp。fju - 512是极大地影响氮的可用性。尽管氮限制是油质的微生物脂质积累的先决条件,高C / N比会导致降低生物量(21]。脂类生物合成的调控油质的微生物需要足够供应的NADPH作为还原剂,而氮的条件下疲惫腺苷酸脱氨酶的活性上调,导致乙酰辅酶a的形成(23]。Surendhiran等人报道,在nitrogen-limited条件下,微藻的脂质含量增加了蛋白质和碳水化合物的代谢通量变化路径(20.]。

此外,温度是另一个主要因素影响生物量的积累和DHA。曾等人获得51.98%的DHA含量最高(每总脂肪酸)和DHA产量的6.05%(每干电池重量)Schizochytriumhx - 308,使用的策略转变培养温度从32 h 30°C到20°C 12 h在摇动烧瓶12]。凯等人发现microalgal细胞膜流动性增加作为一个适应低温(24]。此外,据报道,只有细胞内脂质和细胞器膜受到培养温度的影响(25]。在我们的工作中,我们使用一个温度变化从28日至25°C。在第一阶段,文化的温度是28°C,以产生足够的生物量。在脂质积累阶段,温度降至25°C,和DHA含量显著增加,尽管细胞增长缓慢。因此,这个简单的温度转变策略是一种有效的方式来获得增强的生物量积累和DHASchizochytrium。sp fju - 512。

此外,高氧气供应并不一定导致更多DHA产量Schizochytrium瞿sp。等人表明增加150 h的心理契约⁻¹为细胞的生长提供了有利的条件,而心理契约是控制在88.5 h⁻¹能够有效改善DHA的生物合成26]。众所周知,Schizochytrium使用PKS-like系统合成欧、乙酰辅酶a、malonyl-CoA利用作为初始构建块(27]。厌氧培养系统是DHA从饱和脂质合成所需油质的微生物。因此,改变生长条件的策略从高到低氧浓度是增加DHA生产在这个研究。使用馈料式文化,结合温度和氧浓度转变策略,Schizochytrium生长在151 -反应堆达到生物质103.9 g.l¹,总脂质产量37.2 g.l¹和DHA产量16.0 g.l¹。相比之下,生物量最高,在发酵过程中脂质和DHA值获得1001反应堆110.8 g.l¹50.8 g.l¹和22.3 g.l¹,分别。因此,温度和氧转移的策略已经被证明是有效的方法来增强DHA产量Schizochytriumsp。fju - 512在151年和1001年生物反应器。

微生物生长

一项研究显示,歌曲等,DHA合成与微生物生长速率(28]。瞿等人表示,馈料式栽培分批发酵相比是一个更高效的操作(29日]。一个简单的动力学和逻辑斯蒂方程得到了在这项研究中描述的细胞生长Schizochytriumsp fju - 512在馈料式过程中,使用MATLAB 7.1计算。细胞生长的时间课程(图1和2)被拟合绘制s形增长数据综合方程。为了研究动力学并获得一个好的模型的拟合效果,需要一些假设:(1)葡萄糖的浓度足够高的细胞生长和DHA生物合成;(2)溶氧充足,不是限制因素的增长速度在整个发酵过程;(3)进料体积等于蒸发和样品的体积,所以生物合成的过程可以被视为在体积恒定;(4)实验的相似的结构和维度发酵(传热传质系数)是一致的。然而,151年和1001年之间存在巨大差异搅拌釜生物反应器。在这里,参数n是用于添加模型补偿为了找到最优的数学方程。

有趣的是,观测到了停滞阶段24-36 h在151年和1001年的发酵罐,表明生物质积累被底物抑制。然而,碳和氮源消耗很快在指数增长阶段。因此,集中介质后添加迟滞期由80%葡萄糖和10 g.l¹氮源,为了避免不必要的稀释。随后,细胞生长动力学Schizochytriumsp。fju - 512在馈料式栽培和多级控制策略在151年和1001年的发酵依法进行了分析和模拟的结果。建立一体化物流模式以适应细胞生长动力学。μm的价值为0.0525 h¹,Xm是100 g.l¹n为4.1717。这些价值观得到参数估计的相对误差为0.1160在151年的生物反应器。相应地,μm, Xm 0.0382 h和n¹107.4371 g.l¹分别和10 1001发酵罐的相对误差为0.0810。μm 151发酵过程的价值低于1001年种植的相同的参数主要是因为有一个更长的时间间隔(36 h)在1001年比前馈料式文化的Xm(24小时)。1001年发酵罐是大于151的,这主要是由于更好的溶氧转移效率更大的发酵罐。因此认为增长遵循物流动力学如下:

(3)

(4)

DHA产量

产物的生成速率之间的关系和细胞生长可分为3种类型:生长-模型,semi-growth-associated模型和no-growth-associated模型(29日]。在这种情况下,增加DHA产量与增强的脂质和生物量积累。结果因此表示,DHA产量可能被视为semi-growth-associated过程。图3和4显示动力学DHA产量在151年和1001年的馈料式反应堆,基于Luedeking-Piret模型。参数α和β的种植在151年获得使用搅拌釜模型0.0648 g.g¹和0.0014 g.g¹。h¹,分别。最后的公式描述DHA产量在151年的生物反应器动力学是:

(5)

相比之下,α和β的值获得了1001年的发酵是0.0209 g.g¹和0.0030 g.g¹。h¹,分别。相应的DHA产量模型被描述为:

(6)

因此,结果表明,α的值远高于β在每种情况下,表明细胞生长对DHA产量产生了重大影响Schizochytriumsp。fju - 512。

结论

我们的结果表明,培养条件的转变策略开发的这项研究是一种有效的方法提高DHA产量Schizochytriumsp,即使在比例增大的过程。而μm价值151馈料式发酵罐高于1001反应堆,Xm值显示相反的趋势。两个值相同数量的水平,这主要是由于参数的修改n。相关的误差分别为11.60%和8.10%,分别显示修改后的物流和Luedeking-Piret模型方程能够提供令人满意的拟合动力学DHA产量Schizochytriumsp。fju - 512馈料式系统在不同的尺度上。拟合结果也表明了,参数α是大于β,证明DHA产量高度依赖细胞增长,与文献[协议20.]。此外,建立的模型有一个很好的拟合精度和能够准确描述DHA生产过程的动态特性,利用Schizochytriumsp。fju - 512。因此,数学建模的Schizochytriumsp.发酵可以是一个重要的发展和分析工具优化生物量积累和DHA产量。

承认

这项工作是由中国国家自然科学基金资助(21406130)。我们真诚地感谢王教授Chun男人和挂(福州大学、福州,福建350108年公关中国)提供的MATLAB程序。

引用

1. 沃德OP和辛格Omega-3/6脂肪酸:生产替代来源。过程Biochem.2005; 40:3627 - 3652。
2. De Swaaf我,等。通过馈料式栽培的二十二碳六烯酸生产海洋藻类Crypthecodinium cohnii。Biotechnol Bioeng。2003; 81:666 - 672。
3. MeadusWJ, et al。喂养二十二碳六烯酸猪降低血甘油三酯和脂肪氧化诱导基因表达。J动画Sci。2011; 91:601 - 612。
4. 金YJ和涌HY。二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的抗氧化和抗炎行动在肾上皮细胞和巨噬细胞。J地中海食物。2007;10:225 - 231。
5. 卓Z, et al。联合治疗的效果与二十二碳六烯酸和5 -氟尿嘧啶apoptosis-related mRNA表达的基因,包括小说BCL2L12基因在胃癌细胞。体外细胞Dev医学杂志。2009;45:69 - 74。
6. LukiwWJ andBazan NG。二十二碳六烯酸和衰老的大脑。J减轻。2008;138:2510 - 2514。
7. Yokochi T, et al。优化的二十二碳六烯酸生产Schizochytrium limacinum SR21。生物科技:Microbiol》。1998; 49:72 - 76。
8. Thyagarajan T, et al。评价面包屑作为一个潜在的碳源发展的石油和ω- 3 production.Nutrients thraustochytrid物种。2014;6:2104 - 2114。
9. RenLJ, et al。监管的二十二碳六烯酸生产Schizochytrium sp:氮增加的影响。生物处理Biosyst Eng。2014; 37:865 - 872。
10. Unagul P, et al .属性的二十二碳六烯acid-producer Schizochytrium mangrovei Sk-02:葡萄糖的影响,温度和盐度和他们互动。机器人码头。2005;48:387 - 394。
11. Chang G, et al。摄氧率和k的关系(左)与流变特性高细胞密度栽培S31 Schizochytrium sp的二十二碳六烯酸。Bioresour Technol.2014; 152: 234 - 240。
12. 曾Y, et al。温度转变发展战略有效的二十二碳六烯酸生产海洋真菌原生生物,Schizochytriumsp hx - 308。:生物化学生物技术。2011;164:249 - 255。
13. RenLJ, et al。发展逐步曝气控制策略有效的二十二碳六烯酸生产Schizochytrium sp .生物科技Microbiol》。2010; 87:1649 - 1656。
14. 太阳L, et al .微分的影响养分限制生化成分和二十二碳六烯酸的生产Schizochytrium sp.Bioresour抛光工艺。2014;159:199 - 206。
15. 铃木T, et al。动力学和氮源喂养对生产的影响通过分批补料poly-ß-hydroxybutyric酸的影响。生物科技:Microbiol》。1986; 24:366 - 369。
16. Yamane Y, et al。氧气和葡萄糖对初级代谢和虾青素产量Phaffia rhodozyma在批处理和馈料式文化:动能和化学计量分析。:环境Microbiol.1997; 63:4471 - 4478。
17. 熊猫AK, et al .包涵体动力学在批量生产和高细胞密度馈料式培养的大肠杆菌表达绵羊的生长激素。生物科技J》。1999; 75:161 - 172。
18. 巴塔查里亚米,et al。浪费润滑油删除一批反应堆的混合细菌财团:动力学研究。生物处理Biosyst Eng.2015; 38:2095 - 2106。
19. 歌X, et al .批处理动力学和建模的DHA生产s limacinum OUC88。食物Bioprod过程。2010;88:26-30。
20. Surendhiran D, et al。动力学建模microalgal增长和脂质合成生物柴油的生产。3生物技术。20154;5:663 - 669。
21. 黄生理改变,et al .分组新孤立二十二碳六烯制造酸性物质thraustochytrids根据其多不饱和脂肪酸概要文件和18 s rRNA基因的比较分析。生物科技Mar》。2003; 5:450 - 457。
22. 气ZY, et al。研究两阶段增长DHA-producing海藻Schizochytrium limacinum SR21溶解氧水平也发生了变化。:环境Microbiol。2009; 81:1141 - 1148。
23. Ratledge c .脂肪酸生物合成的用于单细胞微生物石油production.Biochimie。2004;86:807 - 815。
24. 凯V, et al .脂肪酸培养海洋硅藻Odontellaaurita概要和温度。J: Phycol。2014; 26:2265 - 2271。
25. Chodchoey手Verduyn c .增长,脂肪酸在主要的脂类和脂质流动性Aurantiochytrium mangrovei SK-02作为温度函数的增长。布拉兹J Microbiol。2012; 43:187 - 200。
26. L曲等。增强的二十二碳六烯酸生产Schizochytrium sp.使用两阶段供氧控制策略基于氧传递系数。列托语:Microbiol。2011; 52:22-27。
27. 梅茨詹,等。生产酮化合物的多不饱和脂肪酸合成酶在原核生物和真核生物。Science.2001; 293:290 - 293。
28. 瞿L, et al .批处理、馈料式和重复馈料式发酵过程的海洋thraustochytrid Schizochytriumsp生产二十二碳六烯酸。Bioproc Biosyst Eng。2013; 36: 1905 - 1912。
29. Gaden EL。发酵过程动力学。Biotechnol Bioeng。2000; 67:629 - 635。