研究与评论:动物科学杂雷竞技苹果下载志
菜单e-ISSN: 2321-6190 p-ISSN: 2347-2294
e-ISSN: 2321-6190 p-ISSN: 2347-2294
1巴西圣保罗大学“Julio de Mesquita Filho”兽医学和动物科学学院，博卡图
2圣保罗州立大学“Julio de Mesquita Filho”，兽医和动物科学学院，兽医诊所，博卡图，SP，巴西
收到日期:22/02/2017接受日期:17/03/2017发表日期:20/02/2017
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背景:骨髓炎是一种骨骼、骨髓、骨膜、骨膜和血管通道的炎症。慢性骨髓炎可由急性骨炎症治疗不足引起，这表明快速准确的诊断对于更好地治疗正在治疗的骨髓炎非常重要。阑尾骨肉瘤是犬主要的原发性恶性非造血性成骨肿瘤。它自发地出现在附肢骨骼，在狗和人类儿童中都有相关发病率。不幸的是，它是一种侵袭性肿瘤，无论何种物种都有很高的转移率。高致死率主要是由于肺转移患者的生存预后较差化疗耐火性。对于人类患者，基于先前解剖病理诊断的化疗治疗可减少转移，从而提高生存率。然而，这种方法很少被研究兽医传统的治疗方法是截肢，然后进行化疗。
摘要目的:通过细针抽吸细胞学对不同品种(包括混合品种)的犬的骨髓炎和自发性骨肉瘤进行细胞病理诊断，验证这些参数的形态学表达。该研究还旨在证明细针穿刺技术能够有效地进行骨髓炎和犬骨肉瘤的诊断。
方法:本研究通过光学显微镜验证了20只不同犬种(包括混种犬种)骨髓炎和骨肉瘤细胞病理学诊断参数的形态学表达，并分析了这些参数之间可能存在的一致性。细胞学检测采用细针抽吸细胞学，在显微镜载玻片上使用吉氏染色和巴氏染色。组织病理学分析通过对手术标本的活检进行，活检标本按照标准程序处理，并用苏木精-伊红染色。这些肿瘤是根据世界卫生组织提出的指南进行分类的。
结果:在细胞病理学和组织病理学检测中，恶性标准显著重复。
结论:这些结果表明，通过抽吸的细胞病理学分析可能被用作狗骨髓炎和骨肉瘤的可靠诊断方法。
骨髓炎，骨肉瘤，狗，FNA
骨髓炎是一种骨骼、骨髓、骨膜、骨膜和血管通道的炎症，可与细菌、真菌和病毒疾病有关[1，2]。根据病情的演变，骨髓炎可分为慢性和急性两种[2]。在动物中，骨髓炎通常是由细菌感染引起的，通常是由先前的疾病引起的创伤［3.]。
显微镜下，病变通常由多灶性多细胞浸润区组成，包括巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞和多核巨细胞(图1)。病灶以化脓性肉芽肿为特征;单个核细胞占主导地位，是真菌菌丝或细胞内生物，通常明显[4]。
图1:骨膜细针穿刺细胞学显微摄影，显示大量完整或退化的中性粒细胞，以及激活的巨噬细胞和血细胞。吉姆萨染色，400倍。
骨髓炎的诊断通常是用特殊的染色剂进行细胞学评估，如印度墨水、周期性酸性希夫(PAS)和硝酸银。血清学测试也可以应用，真菌培养是明确诊断的必要条件。x线征象必须与原发性或转移性骨肿瘤鉴别，可通过骨活检进行鉴别[4]。有跛行和前肢肿大的中年大型犬的主要鉴别诊断是骨肉瘤[5]。
真菌性骨髓炎的治疗既困难又昂贵。动物通常需要长期抗真菌治疗(数月)，其中一些需要终身治疗。局部临床症状可能需要截肢，但应先尝试系统治疗。真菌疾病的鉴别诊断需要培养和血清学检测[4]。
慢性骨髓炎可由急性骨炎症治疗不充分或延迟引起，这表明快速准确的诊断对于更好地治疗正在治疗的骨髓炎非常重要[6]。
骨肉瘤(OSAs)或成骨性肉瘤是骨肿瘤中，在狗和人类儿童中发病率最高的原发肿瘤，尽管在犬类中发病率约为10倍。这种生物学上的相似性使狗狗成为研究人类此类癌症的临床模型，与小鼠研究模型相比，狗狗有几个优势[7-9]。
大多数犬类的阻塞性睡眠呼吸暂停是恶性的，通常可通过局部浸润导致死亡，约80%患有阻塞性睡眠呼吸暂停的犬只死于肺转移[10]。超过15%的有临床症状的患者被检测出有肺转移，估计超过80%的患者存在微转移[11]。
阻塞性睡眠呼吸暂停的典型特征是在长骨的形上和附肢骨骼中发现，约25%的病例影响到中轴骨骼[12]。这种肿瘤主要出现在四肢较长的狗身上，如爱尔兰猎狼犬、苏格兰猎狼犬和大丹犬，以及其他大型和巨型犬种，如圣伯纳德犬、爱尔兰塞特犬、杜宾犬、罗特韦尔犬、德国牧羊犬和拉布拉多寻回犬，包括混合品种[8-17]。
osa的患者年龄从中到老年，平均年龄为7到8岁。此外，男性往往比女性更容易受到影响，但这一说法并不是研究人员的共识，一些研究也没有注意到任何性别倾向[14，18]。
osa的生物学行为是邻近组织的侵略性局部浸润和快速的造血扩散，通常向肺部扩散。阑尾干骺端肉瘤通常出现在桡骨远端干骺端、股骨远端干骺端和肱骨近端干骺端，尽管其他骺端也可能受到影响[19]。
在影像学检查中，我们可以观察到在受累骨干骺端和邻近骨膜骨形成的混合溶解-增殖模式，这导致了Codman三角的发展，由受累区皮层和骨膜增生形成。就像人类一样，肺转移是终末期疾病的主要原因，这表明90%以上的犬类患者在常规成像技术中可能出现无法检测到的显微转移[20.]。
除病人的临床病史、详细的体格检查及x光检查外，诊断亦以细胞学化验为依据，而确诊常经由活组织检查及组织病理学化验[7，21]。该肿瘤在巴西境内的案例研究代表性较低，主要原因是由于治疗费用高昂，业主选择安乐死。因此，无论是死前还是死后，有关该病的记录以及有关其临床和病理表现的其他信息都会丢失[20.，22]。
Ribeiro等人认为，人类颌骨OSA的早期诊断对疾病的治疗和预后有积极的影响，因为通过快速诊断和准确评估肿瘤受累性，有可能进行保守治疗，达到疗效和最小后遗症的目标。
OSA的治疗包括截肢或保肢手术，然后辅助化疗，使用阿霉素，铂类药物，或两者结合，以及顺铂和卡铂。这些动物在截肢和化疗后无转移的平均生存期为165至470天[10，23-26]。随着治疗和多药化疗的进步，近几十年来预后有所改善，生存率有所提高，但肺转移或难治性肿瘤患者预后仍不佳[11]。
犬类安全防护系统与人类安全防护系统有许多共同特征，包括外观相同的伤口，犬类可能被用作比较模型[19，20.]。鉴于犬类自发性阻塞性睡眠呼吸暂停的发病频率，犬类自发性睡眠呼吸暂停模型为理解这种肿瘤的基因组起源提供了独特的机会。这既可以研究转移在疾病中的作用，也可以用新的研究药物进行测试，否则需要很长时间才能在人类身上得到结果[15]。
在形态学显微镜下的细胞病理学特征上，OSA细胞通常呈圆形或椭圆形，细胞质边界清晰，呈亮蓝色颗粒状，细胞核偏心，有核仁或无核仁。巨大的多核细胞常见，切片背景或成骨细胞质中常可见粉红色无定形物质(类骨)[27，28]。如果圆形细胞不能确定为成骨细胞，则可以在未染色的切片中进行碱性磷酸酶(ALP)的细胞化学染色，因为成骨细胞通常为碱性磷酸酶阳性[21]。
细针穿刺细胞学(FNAC)创建于20世纪30年代，目的是诊断人类恶性肿瘤。在动物身上，这项技术在20世纪80年代开始应用，帮助区分增生，炎症S，肿瘤及变性[28-31]。OSA FNAC通常使用骨髓穿刺进行。在大多数情况下，钝性经皮FNAC可能只需要手动控制即可进行-如果操作者不能穿透皮层，超声引导通常允许可视化的“窗口”，针通过该窗口插入。FNAC方法可能由于建筑保存而完善细胞学样本，允许创建石蜡块用于后续处理，类似于组织学样本，这使得使用组织化学和免疫组织化学辅助技术[32]。
FNAC还可以帮助诊断传染性骨病，为及时诊断提供重要信息。真菌引起狗的大多数机会性骨病，主要是曲霉属。[5]。
虽然这种方法在兽医学中很少被探索，但细胞学作为一种诊断工具的作用仍在继续扩大[7]。该技术有几个优点，如可靠性、微创诊断、与组织病理学相比降低成本和快速结果，这使得手术和治疗方法[27，33]。尽管通过组织病理学的诊断具有更具体和明确的特征，但一些作者认为细胞病理学可以用作明确的诊断，或至少有相当大的帮助。然而，这种方法的灵敏度仍有一些限制，如不规则染色和沉淀或其他折射伪影的存在[28，30.-37]。
最终，这两种技术继续用于补充诊断，说明了在细胞病理学样本收集过程中低程度的入侵和组织病理学中可用于评估组织结构的更高水平的信息之间的一种选择[27]。
本研究旨在验证几种犬种(包括混合犬种)骨髓炎和自发性osa细胞病理学诊断参数的形态学表达。
在本实验中，我们使用了在巴西博图卡图校区FMVZ - UNESP的兽医医院和兽医病理学处诊断的犬骨髓炎和osa。为了作出诊断，病人必须接受临床、放射学、外科和病理检查。根据世界卫生组织《家畜骨及关节肿瘤组织学分类》所建议的细胞学结果及组织病理学结果，作出推测诊断[38]。
所有受试者都接受了有关本研究程序的解释，并签署了一份自由、事先和知情同意条款。该项目在巴西博图卡图校区FMVZ - UNESP伦理委员会的一个有利决定中获得批准。
对于骨髓炎感染的狗，超声引导下FNA取骨膜样本进行细胞病理学评估。然后将收集到的材料铺在组织学载玻片上，风干，甲醇固定，吉姆萨染色。
为了获得更有代表性的样本，动物在三天后进行了骨活检和骨髓抽吸。骨髓抽吸后进行琼脂糖细胞阻滞技术、细菌和真菌培养。
骨活检用10%福尔马林固定，常规处理，琼脂糖细胞块样品装入Eppendorf管，70%乙醇固定，3000转/分离心10分钟。去除上清液，加入2%液体琼脂糖。在此之后，样品再次以3000 rpm离心10分钟，以获得固体颗粒。最后将球团石蜡包埋，组织病理学评价，苏木精-伊红(H&E)染色，PAS染色。
OSA样本取自明确诊断为OSA的犬种和混合犬种，共20只。这些动物首先对病变进行FNAC，然后切除肿瘤，处理细胞病理学和组织病理学切片并读取切片。OSA的最终诊断是由不同的病理学家做出的，然后幻灯片被存档在我们的兽医病理部门。为了这项研究，我们再次对它们进行了分析。
在细胞病理学检查中，每个肿瘤首先被分成四等分，然后对每个肿瘤进行FNAC。每个季度至少使用3个显微镜载玻片。载玻片先用甲醇固定，然后吉姆萨染色;用帕帕尼科劳染色的人则改用95%的酒精。所有这些程序都由不同的操作员执行。
在本研究中，我们首先验证了样品的质量，观察染色模式和细胞数。然后，我们使用世界卫生组织推荐的肿瘤恶性肿瘤标准，详细描述了OSA诊断的细胞特征[38]。
在目前的研究中，我们有一例真菌骨髓炎影响肱骨和股骨的内内膜。这只狗是一只11岁的拉布拉多犬，体重36.2公斤。
骨膜样本涂片显示，嗜酸背景下，细胞密度高，变性中性粒细胞和非变性中性粒细胞比例为3:1，组织细胞较少，细胞碎片丰富。罕见的成骨细胞，有时伴有轻微的粉红色和无定形物质(骨基质)。未见感染因子。初步诊断为支持性骨膜炎。
骨活检显示骨基质中度变薄，弥漫性分布，伴少量骨细胞，成骨细胞和罕见破骨细胞离散存在，最终诊断为骨质疏松症．
细胞块样品与之前描述的细胞病理结果相似，除了几个PAS阳性，透明，间隔和规则菌丝，平行壁和45°分支角，与曲霉属一致。微生物培养结果为阴性。最终诊断为曲霉菌引起的支持性霉菌性骨髓炎。
在13个月的时间里，该动物出现了疾病复发，并接受了脾切除术。脾脏颗粒状病变活检后，Grocott-Gomori染色诊断真菌性肉芽肿。
20只狗参与了OSA研究，其中13只纯种(65%)，7只混合品种(35%)。动物平均年龄9.5岁，平均体重34.8 kg (表1和表2)。
| 特征 | 病例数 | %的总 | |
|---|---|---|---|
| 重量 | 小(<10公斤) 平均(10 - 25公斤) 大(25 - 45公斤) 巨型(45 - 90公斤) 不加权 |
1 2 11 2 4 |
5, 0% 10, 0% 55岁,0% 10, 0% 20日,0% |
| 性别 | 女 男性 |
11 9 |
55岁,0% 45岁的0% |
| 年龄(年) | 0 ~ 5 5点到7点 > = 7 |
1 3. 16 |
5, 0% 15日,0% 80年,0% |
表1。关于20只患有阻塞性睡眠呼吸暂停的狗的体重、性别和年龄的信息。
| 纯的品种 | 病例数 | %的总 |
|---|---|---|
| 罗特韦尔犬 | 7 | 53岁的8% |
| 拉布拉多寻回犬 | 2 | 15日,4% |
| Weimaranner | 1 | 7、7% |
| 比利时牧羊犬 | 1 | 7、7% |
| 达尔马提亚 | 1 | 7、7% |
| 英语Setter | 1 | 7、7% |
| 总计 | 13 | 100年,0% |
表2。每个品种受OSA影响的百分比，基于本研究中发现的13个纯种。
我们还分析了犬OSA诊断参数的形态学表达。恶性标准包括细胞数(低、中、高)、细胞排列(孤立或内聚)，以及细胞核的特征:存在核晕，均匀深染，明显的单核与多核仁，核成型，伪包体，多核，非典型有丝分裂，核增大(核大)，染色质方面(细或粗聚集)，存在大核仁和核形态(圆形，椭圆形和纤维状)。标准还考虑细胞质特征，如细胞质宽或少，存在空泡和伪足，同类相食，嗜碱性，嗜酸性和细胞质形态(纤颤或梭形);胞质不等和胞质不等(离散、中度或显著);环境特征如炎症、骨基质不成熟或成熟;间充质细胞(软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞)的分布和血小板的存在。
我们首先对显微镜载玻片进行了质量测试，没有一种载玻片被认为不适合分析。在细胞学切片中使用的染色技术是Giemsa和Papanicolaou。
与同类相食和微环境中存在成纤维细胞等标准相比，核晕和伪包体等标准尚未在相关数量中发现(表3)。
| 位置 | 病例数 | %的类别 | %的总 |
|---|---|---|---|
| 四肢的 | 16 | 100年,0% | 80年,0% |
| 前肢 | 11 | 68年,8% | 55岁,0% |
| Scapulo-humeral联合 | 1 | 6、3% | 5, 0% |
| 肱骨 | 6 | 37岁的5% | 30、0% |
| 半径/尺骨 | 2 | 12日,5% | 10, 0% |
| 桡骨/尺骨和腕骨 | 2 | 12日,5% | 10, 0% |
| 突起物 | 5 | 31日,3% | 25日,0% |
| 股骨 | 2 | 12日,5% | 10, 0% |
| 胫骨 | 2 | 12日,5% | 10, 0% |
| 股骨或胫骨 | 1 | 6、3% | 5, 0% |
| 轴向 | 4 | 100年,0% | 20日,0% |
| 头 | 3. | 75年,0% | 15日,0% |
| 硬腭 | 2 | 50岁的0% | 10, 0% |
| 下巴 | 1 | 25日,0% | 5, 0% |
| Isquium | 1 | 25日,0% | 5, 0% |
| 总计 | 20. | --- | 100% |
表3。20只犬阻塞性睡眠呼吸暂停的解剖部位。它显示了每个受影响部分与其相应类别(附肢或轴骨)相关的百分比。
我们注意到该系统的诊断结果与本研究结果之间存在差异。2例之前诊断为成骨细胞性osa的病例，实际上是软骨肉瘤，因为这类肿瘤的特征是有大量多形性软骨细胞和软骨基质明显增生。另一个诊断差异是伤口显示骨重塑过程，其中细胞没有表现出预期的恶性标准，如骨基质的无序增殖和明显的核仁。
通过细胞块细胞病理学诊断骨髓炎虽然罕见，但从本研究结果来看，应始终考虑到骨髓炎的诊断，特别是考虑到本病的长期和困难的治疗[4]。还应考虑到治疗不充分和延迟可能导致慢性骨髓炎，通过细胞阻滞病理技术的快速诊断可能避免慢性骨髓炎[6]。
大型犬种，如罗威纳犬、爱尔兰塞特犬和拉布拉多犬，都有患阻塞性睡眠呼吸暂停的倾向。8，12，14]。此外，阻塞性睡眠呼吸障碍多见于四肢骨骼或长骨，占病例的85%，此外还有玄骨[12]。此外，55%的受感染动物是大型动物，10%是巨型动物。
女性比男性受影响更大，分别为55%和45%。尽管文献表明男性更容易受影响，但研究人员在这方面仍然没有明确的共识[14，18]。在这项研究中，狗的平均年龄为9.5岁。根据Vanel和Morello的说法，受osa影响的动物的平均年龄在7到8岁之间。文献和本研究之间的差异可能是由于几个因素导致宠物预期寿命的增加。其中，我们可以提到的是疫苗的可得性提高，主人对宠物老年问题的认识不断提高，以及宠物食品的营养质量有所改善[39]。此外，透过细胞病理学及组织病理学化验，及早诊断肿瘤疾病，有助提高治疗效率，并延长病人的预期寿命[23]。
研究结果表明，细胞病理学检测确实可以作为犬自发性OSA的明确诊断，正如几位作者所证实的那样，因为通过该技术表达的恶性标准与该类型肿瘤的组织病理学检测中表达的标准一致，例如存在骨样、巨大的多核细胞和单个或多个明显的核核[28，34-38]。然而，为了强调形态学的标准，还需要进一步研究足够大的样本量以达到代表性。
根据本研究的结果，我们可以得出结论，细胞病理学分析是一种可行的骨髓炎和犬自发性OSA的诊断方法，是一种同样适用于肿瘤恶性程度分级的方法。这些因素使外科医生能够进行更充分和快速的治疗方案，这可能会显著改善动物在面对这些自然侵袭性骨病时的预后。
我感谢ISB - UNESP对实现这个项目的支持，感谢FAPESP、CAPES和CNPq对财政资源的支持。
