研究与评论:植物学杂志雷竞技苹果下载
菜单ISSN: 2320 - 0189
ISSN: 2320 - 0189
+ 1-845-458-6882Minyaka埃米尔1，3.*——西莫·克劳德3.，4， Kusznierewicz Barbara2， Madina Banen Collette Vanessa1， Mouen Piau Jean Cyrile1，3.Niemenak Nicolas3.和Omokolo Ndoumou Denis3.
2化学学院食品化学、技术和生物技术系GdaÅ斯克理工大学，Narutowicza 11/12, 80-233 GdaÅ斯克，波兰
3.喀麦隆雅温得第一大学生物科学系高等师范学院植物生物化学与生理实验室
收到日期:28/04/2017;接受日期:04/07/2017;发表日期:07/07/2017
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适宜基因型的异花授粉和早期选育优等后代的充分利用plants-associated国防植株叶片中的标记对可可豆耐黑荚病(BPD)基因型的形成具有决定性作用。采用叶盘试验方法，对人工授粉菌株â′′SNK64 × â′′‑UPA143的T.可可株系对BPD的敏感性进行了分析。选取â′′SNK64 × â′′‑UPA143中E9(耐药)、E13(中度易感)和E32(最易感)三种年轻杂交基因型的叶片(健康、损伤和损伤+感染)黄酮使用HPLC/LC/MS系统进行分析。叶盘试验结果显示，62.5%的子代病分率低于双亲的平均值。79.17%和20.83%的后代分别低于最敏感亲本(UPA143)和耐受性亲本(SNK64)。总黄酮含量与生物胁迫和非生物胁迫有关。在感染条件下，耐药杂交基因型(E9)黄酮含量最高，可能控制了对BPD的耐受性。个体黄酮分析显示，不同黄酮、处理和杂交基因型的差异模式。木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)、异荭草素(tR=12.0)和芹菜素戊基己苷(tR=10.9)是耐药杂交基因型(E9)的特征。相反，高含量的芹菜素己苷(tR=10.1)和芹菜素己苷(tR=11.6)可能与易感者有关混合基因型(E13)和(E32)。因此，â ' ' ' SNK64 × â ' '‑UPA143可用于开发耐BPD的杂交基因型。上述黄酮在可可豆防御系统中首次被报道，可能是培育耐BPD的可可豆杂交基因型的有用标记。
育种，芹菜苷，异牡荆素，木犀草素，可可
疾病(黑豆荚病)和虫害是许多非洲可可生产国可可产量和盈利能力的最大绊脚石[1-4］．缺乏耐病害的高产品种;开发结合这两种特征的基因型一直具有挑战性。几十年来，农民们一直试图通过不断施用合成农药来解决黑豆荚病(P. megakarya)对可可的有害影响农药［5，6］．然而，这种方法并不具有成本效益;这对农民的健康和环境也有不利影响[7］．因此，开发有利于环境的可可种植园疾病管理的可持续做法正在取得进展。这些做法通常包括开发对黑豆荚病具有遗传耐性的T. cocoa基因型[8,9]。遗传改良(通过繁殖策略进行可可的抗病和高产育种)[10，11］．这一策略是基于一对特定父母(基因型或克隆)产生具有理想特征的后代的能力。不幸的是，许多可可克隆夫妇还没有在这个目的上进行测试，例如ÃⅰÂ′Â′SNK64 × ÃⅰÂ′Â UPA143。据报道，SNK64对黑荚病的敏感性和产量较低;而UPA143已知对黑荚病中度敏感，产量高[12]
通过分析，可以较早地监测具有耐受性状的后代(从给定的亲本中)的选择代谢物幼苗叶片中的耐受性标记。植物抗毒素库，即总黄酮，据报道是植物抵御生物胁迫的耐受性标志[13］．然而，已经有超过6000种类黄酮被鉴定出具有广泛的生物功能:保护紫外线辐射植物病原体、结瘤过程中的信号、雄性生育能力、生长素运输以及花的颜色[14，15］．
黄酮是类黄酮的一个亚群，是高等植物中具有不同生物学功能的一大群代谢物。这些化合物被认为是内源性抗生素(抗菌素)在植物保护中防止病原体:线虫、软体动物、真菌、卵菌和细菌[16］．
研究论文报道了可可豆中酚类化合物对巨虫的防御作用，但没有提到可可豆中特定的黄酮或黄酮类型防御机制预防巨马卡疟原虫感染。关于黄酮在可可豆耐黑豆荚病中的作用，目前尚不清楚。
本研究旨在评价黄酮类化合物在可可豆防御巨斑黑豆病中的意义，并将其作为可可豆耐黑荚病基因型的早期选择标记。首先，根据Nyassé等[12]的改良方法，采用叶盘试验对可可T.后代(ÃⅱÂ′Â′SNK64 × ÃⅱÂ′Â UPA143)对黑荚病的易感性进行了评价。随后，对三种杂交基因型(来自ÃⅰÂ′Â′SNK64 × ÃⅰÂ′Â UPA143)对黑荚病易感性不同(对黑荚病低敏感、中敏感和高敏感)的幼苗的健康(未处理)、损伤和损伤+感染(带巨蓬菌丝)叶片进行了黄酮含量的定量和定性分析。
T.可可植物材料
以喀麦隆西南部Barombi Kang种子场人工授粉获得的ÃⅰÂ′Â′SNK64 × ÃⅰÂ′Â UPA143成熟荚果种子为材料，建立苗圃。以上述苗圃中Ã①Â′Â′SNK64 × Ã①Â′Â UPA143的4个月龄全兄弟后代叶片为材料，进行叶盘试验、总叶盘试验和个体叶盘试验黄酮家庭的分析。
megakarya分离株用于检测ÃⅰÂ′Â′Snk64 × ÃⅰÂ′Â Upa143子代的敏感性
为检测âÂ′Â′SNK64 × Ã¢Â′ UPA143的全兄妹子代的易感性，Nkolbisson (Yaoundé，喀麦隆)IRAD (Institut de Recherche Agricole pour le Development)植物病理实验室免费提供了中侵略性分离株。在我们的实验室(杜阿拉-喀麦隆大学科学学院生物化学实验室)，通过在1.5% (w/v)豌豆基琼脂培养基上频繁传代培养，将该P. megakarya分离物保存在实验室中。以维持毒性，分离物定期接种到可可豆荚上。
游动孢子产量
采用相应的方法获得游动孢子(或接种体)。从10天大的培养物中获得游动孢子。添加无菌蒸馏水，在4°C下诱导孢子囊培养物释放游动孢子。室温1小时后，将动物孢子浓度调整为3 × 105游动孢子/mL，使用MALASSEZ血压计。
ÃⅰÂ′Â′SNK64 × ÃⅰÂ′Â UPA143子代对巨斑白蚁的易感性筛选
用于筛选的叶盘测试调整为Nyassé等的方法。[12］．试验设计为3个重复，每个杂交基因型完全随机化7块叶盘(Ø=1.5 cm)。因此，每个混合动力车总共使用了28个光盘。每个杂交后代的叶盘都是由轻度木质化的幼叶(2.5 ~ 3月龄)获得的。将叶片置于托盘中，在25±1°C的黑暗条件下预培养24小时后接种。24 h后，接种10 μL (3 × 10)5在25±1°C的黑暗环境中孵育，每个叶盘中间两侧的游动孢子悬浮液为游动孢子/mL。在接种后第4、5、6、7、8天，对各杂交品种的各叶盘的敏感性(通过坏死大小)进行了评分(0:耐~ 5:高敏感)。
全叶接种用于黄酮池分析
E9、E13和E32的全叶(2.5-3个月)混合基因型不同的疾病评分(易感性)是在清晨收获的。采收后，依次用自来水和蒸馏水清洗叶片，然后在黑暗(25±1°C)的托盘上预孵育24小时。24小时后(每种杂交基因型)将叶片分成三组:健康(未处理)叶片、损伤叶片和损伤+感染叶片。损伤+感染叶片接种5 d培养的菌丝体盘(Ø=0.5 cm)。未经处理和损伤的叶片组接受无菌丝体的琼脂圆盘(Ø=0.5 cm)。3个杂交基因型的3组叶片在25±1°C的黑暗环境中孵育3天。培养后，将叶片冻干，用于黄酮分析。
黄酮提取与分析
对3种不同基因型(E9、E13和E32)的可可豆杂交叶片(未处理、损伤和损伤+感染)进行了黄酮类物质的提取和分析。E9(病分=0)为耐感杂交基因型，E13(病分=2.6)为中度易感杂交基因型，E32(病分=4.8)为最易感杂交基因型。
化学物质
木犀草素6- c -葡萄糖苷(异荭草素)和芹菜素6- c -葡萄糖苷(异牡荆素)购自LGC标准公司。甲醇和甲酸从Merck公司获得。所有溶剂均为HPLC级，水为milliq级。
提取制备
将冻干的可可叶在研磨机中研磨，并将粉末(60毫克)置于离心管中。向每个试管中加入1ml甲醇，超声检测样品30分钟。样品离心(3000 rpm, 15分钟)，收集清上清。用新的溶剂(1 mL)重复提取过程。将两次重复提取的上清液混合，得到约2ml的最终提取物。
LC-DAD-ESI-MS分析
采用Agilent 1200系列高效液相色谱系统(DAD检测器和ESI接口)和质谱(Agilent 6130四极杆LC/MS)对甲醇叶提取物中的酚类化合物进行了表征。采用Phenomenex Kinetex XB-C18 100A色谱柱(150 × 4.6 mm, 5 μm粒度)进行色谱分离。以0.1%甲酸水溶液(溶剂a)和0.1%甲酸甲醇(溶剂B)为流动相，流速为0.8 mL/min，对植物化学物质进行了拆分;所有样品进样量均为10 μL。洗脱梯度曲线为15 min内30-50% B, 5 min内50-100% B, 10 min内100% B。使色谱柱在流动相初始浓度下平衡5 min。吸光度谱在190 ~ 700 nm之间每2 s记录一次，带宽为4 nm，色谱图在270 ~ 335 nm处监测。MS参数如下:毛细管电压，3000 V;破碎器，120v;干燥气体温度350℃;气体流量(N2)， 12 L/min; nebulizer pressure, 35 psig. The instrument was operated both in positive and negative ion modes, scanning from m/z 100 to 1000. Individual phenolic compounds were identified by comparing their retention times with those for standards or on the basis of available literature data and UV and mass spectra. Since reference compounds were not available for most of the detected phenolics, luteolin glycosides were quantified as isoorientin and apigenin glycosides as isovitexin (at 335 nm). Total and individual flavones contents are expressed in mg per gram of dry weight of cocoa leaves (mg/g of dw).
数据分析
数据以至少三个独立实验的平均值±标准差(SD)表示。所有统计分析均使用SPSS 20.0软件(SPSS, Inc.， Chicago, IL, USA)进行。当F值在p<0.05时显著时，采用学生-纽曼- keuls检验进行单因素方差分析(ANOVA)，比较均数之间的差异。
子代叶盘试验ÃⅰÂ′Â′SNK64 × ÃⅰÂ′Â UPA143
对子代âÂ′Â′SNK64 × Ã¢Â′ UPA143从0(耐病)到5(高易感)的疾病得分进行分析，结果表明，与其他时间(第4、5、6、8天)相比，第7天的杂交基因型判别效果最好。在这个日期，使用学生纽曼和Keuls测试在5%的情况下获得了13个杂交基因型亚群。子代疾病评分为0 (E9、J5、C31) ~ 4.8±0.07 (E32)。E13为中度评分(2.6±0.1)。约79.17%的后代的敏感性低于最敏感的亲本(UPA143)。约62.5%的后代耐受性高于亲本(ÃⅰÂ′Â′SNK64和ÃⅰÂ′ UPA143)的平均疾病得分(2.05)。此外，20.83%的子代表现出的疾病得分低于低易感亲本(SNK64)。此外，我们观察到12.5%的子代的疾病评分低于最耐受基因型(SCA6)(表1)。
黄酮的分析
总黄酮含量
对3种杂交基因型(E9、E13和E32)的未处理叶(U)、损伤叶(W)和损伤+感染叶(W+I)总黄酮含量进行了测定。
E9中，未处理叶片损伤后总黄酮含量显著降低。损伤叶侵染导致该杂交基因型(E9)总黄酮含量显著增加。E13处理中，未处理叶片与损伤叶片总黄酮含量差异不显著。染病叶总黄酮含量显著低于未染病叶和染病叶。E32的总黄酮含量与E13相似。
在未处理的叶片中，E9的黄酮含量最高。而未处理叶片中E13和E32的黄酮含量差异不显著。伤后，E9(较不敏感基因型)总黄酮含量显著降低，而E13和E32(最敏感基因型)总黄酮含量保持准恒定。在损伤和感染叶中，总黄酮含量在E9、E13和E32之间显著降低(图1)．
图1:处理对E9、E13和32杂交可可叶总黄酮含量的影响:U=未处理叶;W =受伤的叶子;W+I=损伤和感染叶片;dw =干重;数据以均数±标准差表示(n=9)。根据Student, Newman和Keuls检验，对于给定的杂交基因型，相同字母影响的总黄酮含量在5%时差异不显著。
不同可可豆杂交基因型各黄酮谱处理的比较
在3个杂交基因型(E9、E13和E32)未处理、损伤和损伤+感染的叶片中共检测到13种黄酮。对于每一个杂交基因型，在未处理(U)损伤(W)和损伤+感染(W+I)叶片中监测单个黄酮的含量。
杂交基因型E9
在未处理的叶片中，黄酮类化合物含量最高的是芹菜素-戊基己苷(tR=7.8)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)，芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)，异牡荆素(tR=14.4)和芹菜素芦丁苷异构体(tR= 14.8)。伤口与个别黄酮含量的显著降低有关。黄酮类如芹菜素-戊基脱己苷(tR=10.7)在健康叶中存在，在损伤叶中不存在。损伤叶片感染后，各黄酮含量显著增加。Isoorientin (tR=12)在未处理叶片和受损叶片中均出现缺失。木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)受损叶片中缺失的物质随着感染再次出现。在这种杂交基因型中，感染似乎诱导合成额外的黄酮(图2)．
图2:可可豆E9杂交基因型未处理叶(U)、损伤叶(W)和损伤+感染叶(W+I)黄酮类成分的比较:dw=干重;数据以Mean±SD表示(n=9)。根据Student, Newman和Keuls测试，对于给定的黄酮，受相同字母影响的处理在5%处没有显著差异。
杂交基因型E13
Apigenin-hexoside (tR=10.1)，芹菜素-己糖苷(tR=11.6)，异牡荆素(tR=14.4)和芹菜素芦丁苷异构体(tR=14.8)是E13基因型未处理叶片中黄酮含量最高的。除芹菜素芦丁苷ismer (t)外，伤口对各黄酮类化合物的含量无显著影响R=14.8)，含量随伤口的增加而显著增加。当叶片损伤和感染时，芹菜素-二葡萄糖苷(tR=6.4)，芹菜素-戊基己糖(tR=7.8)，芹菜素-己糖苷(tR=10.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)，芹菜素-己糖苷(tR=11.6)，木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)，异牡荆素(tR=14.4)和芹菜素芦丁苷异构体(tR= 14.8)。此外，芹菜素-戊基己苷(tR=10.9)和木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)随着感染消失了。Apigenin-pentosyl-hexoside (tR=10.7)，在未处理和损伤叶片中均不存在;而异定向蛋白(tR=12.0) E13仍然缺席(图3)．
图3:可可豆E13杂交基因型未处理叶(U)、损伤叶(W)和损伤+感染叶(W+I)黄酮类成分比较:dw=干重;数据以Mean±SD表示(n=9)。根据Student, Newman和Keuls测试，对于给定的黄酮，受相同字母影响的处理在5%处没有显著差异。
杂交基因型E32
Apigenin-hexoside (tR=10.1)，芹菜素-己糖苷(tR=11.6)和异牡荆素(tR=14.4)的E32基因型黄酮含量最高。与E13一样，伤口没有显著改变单个黄酮的含量。但当叶片受感染时，芹菜素-二葡萄糖苷的单株含量(tR=6.4)，芹菜素-戊基己糖(tR=7.8)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)，芹菜素-己糖苷(tR=10.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)，芹菜素-己糖苷(tR=11.6)，异定向蛋白(tR=12.0)，异牡荆素(tR=14.4)，芹菜素芦丁苷异构体(tR=14.8)和芹菜素-葡萄糖苷(tR=15.3)显著降低。与E13一样，芹菜素-戊基己糖(tR=10.7)，而未处理叶片和损伤叶片中均不存在该因子;而异定向蛋白(tR=12.0)缺席(图4)．
图4:可可豆E32杂交基因型未处理叶(U)、损伤叶(W)和损伤+感染叶(W+I)黄酮类成分比较:dw=干重;数据以均数±标准差表示(n=9)。根据Student, Newman和Keuls测试，对于给定的黄酮，受相同字母影响的处理在5%处没有显著差异。
三种杂交基因型在不同处理下的单株黄酮谱比较
未经处理的树叶
在未处理的三种基因型(E9, E13和E3)叶片中，13种黄酮通过其个体保留时间(tR)中检测到芹菜素-二葡萄糖苷(tR=6.4)，芹菜素-戊基己糖(tR=7.8)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)，芹菜素-己糖苷(tR=10.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=10.7)，芹菜素-戊基己苷(tR=10.9)，芹菜素-己糖苷(tR=11.6)，异定向蛋白(tR=12.0)，木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)，异牡荆素(tR=14.4)，芹菜素芦丁苷异构体(tR=14.8)，芹菜素-葡萄糖苷(tR= 15.3)。13个黄酮科在3个基因型(图5)．
图5:采用高效液相色谱- dad - ms技术，在335 nm处测定了三种基因型(E9、E13和E3)可可健康叶(未经处理)中主要黄酮类化合物的色谱谱。一个峰的数量对应化合物:1-芹菜素-二葡萄糖苷(tR=6.4)， 2-芹菜素-戊基己糖(tR=7.8)， 3-芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)， 4-芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)， 5-芹菜素-己糖(tR=10.1)， 6-芹菜素-戊基己糖(tR=10.7)， 7-芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)， 8-芹菜素-己糖(tR=11.6)， 9-异取向蛋白(tR=12.0)， 10-木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)， 11-异牡荆素(tR=14.4)， 12-芹菜素-芦丁苷异构体(tR=14.8)， 13-芹菜素-葡萄糖苷(tR= 15.3)。
3个杂交基因型的黄酮类化合物含量比较表明，芹菜素-二葡萄糖苷(tRE9(0.485±0.033 mg/g dw)、E13(0.386±0.025 mg/g dw)和E32(0.380±0.024 mg/g dw) 3个基因型均存在=6.4)。这种次生代谢产物的含量从E9(耐受性基因型)显著降低到E13和E32(敏感基因型)。结果表明，该组黄酮含量降低，而基因型易感性增加。Apigenin-glucoronide (tR=15.3)表现出与芹菜素-二葡萄糖苷(tR=6.4) E9, E13和E32之间。木犀草素芦丁苷异构体(tRE9(0.061±0.004 mg/g dw)中无E13(0.018±0.003 mg/g dw)， E32(最敏感基因型)中无E13(0.018±0.003 mg/g dw)。Apigenin-pentosyl-hexoside (tR=10.7) E9(0.027±0.008 mg/g dw)无E13和E32。与芹菜素-戊基己糖相反(tR=10.7)模式，异向蛋白似乎对最敏感的基因型E32 (图6)．
图6:未处理叶片中黄酮含量与可可豆基因型对巨叶枯病菌易感性的比较。U =未经处理的;dw =干重;数据以均数±标准差表示(n=9)。
与前面提到的黄酮类化合物的含量从较不敏感的(E9)到最敏感的(E32)呈普遍下降趋势相反，芹菜素己苷(tR=10.1)和芹菜素-己糖苷(tR=11.6)在E9 ~ E32段呈显著增加趋势。此外，它们在特定基因型中的个体含量值无显著差异。这似乎表明，在给定的可可豆杂交基因型(图7)．
图7:未处理叶片中黄酮含量与可可豆基因型对巨虫的敏感性:U=未处理;dw =干重;数据以均数±标准差表示(n=9)。
Apigenin-pentosyl-hexoside (tR=7.8)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)，芹菜烯戊糖-己糖(tR=10.7)，芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)和芹菜素芦丁苷异构体(tR=14.8)在E9到E32之间呈下降趋势。芹菜素戊基己苷(tRE13(0.391±0.030 mg/g dw)和E32(0.166±0.012 mg/g dw)明显低于E9(1.275±0.100 mg/g dw)。Apigenin-pentosyl-hexoside (tR=8.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)和芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)表现出与芹菜素-戊基己苷(tR= 7.8)。即E9中黄酮含量显著高，E13和E32中黄酮含量显著低。此外，上述黄酮的含量在耐受基因型(E9)中显著较高，在敏感基因型(E13和E32)中显著较低;E32是对黑荚病最敏感的杂交基因型(E9较不敏感)。芹菜素芦丁苷异构体(tR(y=-0.7245x+2.7173, R²=0.9984)在E9到E32之间呈准线性关系。Isovitexin (tRE32(2.268±0.123 mg/g dw)显著高于E9(1.654±0.111 mg/g dw)和E13(1.213±0.072 mg/g dw) (图5和图8)．
图8:未处理叶片中黄酮含量与T.可可对巨裂叶霉基因型易感性的比较:U=未处理(健康);dw =干重;数据以均数±标准差表示(n=9)。
受伤的叶子
在受伤的叶子中，没有一种基因型含有13种黄酮。在检测到的13种黄酮中，异荭草素(tR=12.0)是E9和E13中唯一不存在的黄酮(但在E32中存在)。Apigenin-pentosyl-hexoside (tR=10.7)在E9中存在，在E13和E32中不存在。在E9和E13中存在的木犀草素芦丁苷异构体在E32中不存在(图9)．
图9:采用高效液相色谱- dad - ms法，在335 nm处测定了不同杂交品种(E9、E13和E32)损伤叶中主要黄酮的色谱谱。一个峰的数量对应化合物:1-芹菜素-二葡萄糖苷(tR=6.4)， 2-芹菜素-戊基己糖(tR=7.8)， 3-芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)， 4-芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)， 5-芹菜素-己糖(tR=10.1)， 6-芹菜素-戊基己糖(tR=10.7)， 7-芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)， 8-芹菜素-己糖(tR=11.6)， 9-异取向蛋白(tR=12.0)， 10-木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)， 11-异牡荆素(tR=14.4)， 12-芹菜素-芦丁苷异构体(tR=14.8)， 13-芹菜素-葡萄糖苷(tR= 15.3)。
个体黄酮含量(作为杂种基因型对BPD易感性的函数)表现出不同的模式。Apigenin-diglucoside (tR=6.4)的叶片形状与未处理叶片相反。Apigenin-pentosyl-hexoside (tR=10.7)在三个基因型的损伤叶中均不存在(该黄酮仅存在于未处理叶中的E9中)。Isoorientin (tR=12.0)具有与未处理叶片相似的形状。木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)和apigeninglucoronide tR=15.3)在损伤叶(图10)．而在未处理的叶中，从E9到E32呈下降趋势。
图10:损伤叶黄酮含量与可可豆基因型对巨叶枯霉易感性的关系。W =未经处理的;dw =干重;数据以平均值±标准差表示(n=9)。
与未经处理的叶子一样，芹菜素-己苷(tR=10.1)和芹菜素-己糖苷(tR=11.6)的损伤叶在E9 ~ E32之间呈正相关且形状增加(图11)．
图11:未处理叶片中黄酮含量与可可豆基因型对巨叶枯病菌易感性的比较。W =受伤;dw =干重;数据以平均值±标准差表示(n=9)。
在受损叶片中，芹菜素-戊基己苷(tR=7.8)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)，芹菜素-戊基己糖(tR=10.7)，芹菜素和戊基己糖(tR=10.9)与未处理叶片(图12)．
图12:未处理叶片中黄酮含量与可可豆基因型对巨斑枯病菌易感性的关系:W=损伤;dw =干重;数据以平均值±标准差表示(n=9)。
受伤和感染的叶子
在损伤叶和感染叶(W+I)中，芹菜素-戊基己苷(tR=7.8)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)，芹菜烯戊糖-己糖(tR=8.7)，芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)，异牡荆素(tR=14.4)和芹菜素芦丁苷异构体(tR=14.8)，耐药基因型E9较易感基因型E13和E32高。而芹菜素-己苷(tR=10.1)和芹菜素-己糖苷(tR=11.6)， E13和E32显著高于E9。Apigenin-pentosyl-hexoside (tR=10.7)在E9中存在，在E13和E32中不存在。此外，芹菜素-葡萄糖苷(tR=15.3)在最易感基因型(E32)中不存在E13和E9 (图13)．
图13:在335nm的高效液相色谱分析中，记录了不同基因型可可损伤和感染叶片中主要黄酮类化合物的色谱谱。1-apigenin-diglucoside (tR=6.4)， 2-芹菜素-戊基己糖(tR=7.8)， 3-芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)， 4-芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)， 5-芹菜素-己糖(tR=10.1)， 6-芹菜素-戊基己糖(tR=10.7)， 7-芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)， 8-芹菜素-己糖(tR=11.6)， 9-异取向蛋白(tR=12.0)， 10-木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)， 11-异牡荆素(tR=14.4)， 12-apigenin芦丁苷异构体(tR=14.8)， 13-芹菜素-葡萄糖苷(tR= 15.3)。
个体黄酮含量与杂种基因型对BPD易感性的关系分析表明，芹菜靛蓝苷(tR=6.4)在损伤叶中呈减少的形状(从E9到E32)，而不是增加的形状。Apigeninhexoside (tR=10.7)，在损伤叶中不存在，在损伤+感染叶中重新出现。E13基因型芹菜素己苷含量最高(tR=10.7)，其次是E32和E9。Apigenin-glucuronide (tR=15.3)呈现出与-hexoside (tR=10.7)。Isoorientin (tR=12.0)和木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)似乎与损伤+感染叶片中较不敏感的杂交基因型E9相关(图14)．
图14:损伤+感染叶中黄酮类化合物含量与可可豆杂交种对巨虫的易感性:W+I=损伤和感染叶;dw =干重;数据以平均值±标准差表示(n=9)。
在损伤+感染(W+I)叶中，芹菜素-己苷(tR=10.1)和芹菜素-己糖苷(tR=11.6)在E9 ~ E32范围内与未处理叶和损伤叶表现出相似的相关性和增加模式。可可豆叶片(未处理、受伤或受伤+感染)中两种黄酮的高含量，似乎是可可豆杂交基因型对巨卡虫易感性的同义词。图15)．
图15:损伤+感染叶中黄酮类化合物含量与可可豆杂交种对巨虫的易感性:W+I=损伤和感染叶;dw =干重;数据以平均值±标准差表示(n=9)。
在损伤+感染叶片中，芹菜素-戊基己苷(tR=7.8)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)， apigenin - penttosylhexoside (tR=8.7)和芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)，在未处理和损伤叶片中呈现出下降模式(从E9到E32)。这些黄酮含量的降低可能与可可豆杂交基因型(图16)．
图16:损伤+感染叶中黄酮类化合物含量与可可豆杂交种对巨虫的易感性:W+I=损伤和感染叶;dw =干重;数据以平均值±标准差表示(n=9)。
开发耐黑荚病(BPD)的可可T.可可基因型是可持续可可栽培的出路。这可以通过目标亲本基因型的异交受精和使用可靠的测试和耐受性标记提前选择具有理想性状的后代来实现。不幸的是，还有许多未经试验的异受精(如ÃⅰÂ′Â′SNK64 × ÃⅰÂ′ UPA143)。据报道，在喀麦隆开发的SNK64是对BPD最耐受的克隆之一，但产量较低。相反，UPA143高产但对BPD敏感[17］．采用[改良方法]的叶盘试验，研究了T. coco子代(来源:â '  ' SNK64 × Ã¢Â '  UPA143)对BPD的敏感性。12］．通过疾病评分监测杂交基因型的易感性。因此,一个¢SNK64×一个¢UPA143后代表现出疾病分数在0到4.8之间虽然父母克隆的一个¢SNK64和一个¢UPA143显示疾病得分分别为0.3和3.8。疾病得分低于3.8的杂交基因型的存在可能表明可可豆对BPD的耐受性是一种加性性状[2，3.］．叶盘试验数据分析得到13个杂交基因型的病分表型亚群(来自ÃⅱÂ′Â′SNK64 × ÃⅱÂ′ UPA143)。这种疾病评分的异质性可能证实了这样一个事实，即可可豆对BPD疾病的耐受性是一种多基因性状，而所使用的异受精基因型是该性状的杂合子[18］．ÃⅰÂ′Â′SNK64 × ÃⅰÂ′ UPA143对BPD的敏感性低于最敏感亲本(UPA143)。大多数杂交基因型的疾病得分低于双亲的平均疾病得分(ÃⅰÂ′Â′SNK64和ÃⅰÂ′ UPA143)。有很大一部分杂交基因型的疾病得分低于最佳亲本(SNK64)或参考克隆(SCA6)。上述结果表明，cross-fertilizationÃⅰÂ′Â′SNK64 × ÃⅰÂ′ UPA143可用于培育对BPD耐受或不敏感的可可豆杂交基因型。
在存在生物或非生物胁迫时，植物调动防御机制来消除或减少胁迫的发生。植物防御机制包括多种生物分子。植物防御中的有效分子称为防御分子。黄酮是植物中具有多种生物学功能的类黄酮代谢产物的一个亚群[19］．
相对而言，关于可可豆中黄酮类或黄酮类化合物对巨虫的防御作用尚不清楚。植物黄酮是次生代谢产物，包括由莽草酸-苯丙酮-黄酮途径产生的几类结构多样的生物遗传学天然产物。植物需要黄酮来抵抗病原体和许多其他生物功能。因此，黄酮代表了适应性特征。植物合成了大量的黄酮，因为它们不能依靠物理流动性来逃避它们的捕食者(病原体)，因此进化出了一种针对这些捕食者的化学防御[20.］．
在这项研究中，我们分析了健康(未经处理)、受伤和受伤+感染的幼苗(上述后代)叶片中的黄酮库，以了解它们作为早期选择抗BPD基因型的标记的潜在用途。
根据疾病评分数据，采用E9(低易感)、E13(中易感)和E32(最高(易感)杂交基因型对未处理、损伤和损伤+感染的叶片进行黄酮分析。
在三个杂交基因型的未处理叶片中，耐受性基因型(E9)的总黄酮含量高于敏感型基因型(E32)。损伤叶中，敏感杂交种的黄酮含量高于中敏感杂交种(E13)，而耐受性杂交种(E9)的黄酮含量较低。相反，在林木和侵染条件下，E9的黄酮含量较高，然后从E13到E32逐渐减少。这组结果可能表明，健康、非生物和生物胁迫可可叶中的黄酮谱库是不可比拟的。因此，根据特定状态(健康、受伤或感染)，可可豆中的黄酮可能被动员起来。事实上，黄酮是类黄酮的亚群，属于植物抗毒素，是植物在应对非生物或生物胁迫时动员的低分子量抗菌化合物[21］．
在侵染过程中，耐药杂交基因型(E9)黄酮含量最高，这可能是其耐/抗BPD的主干。因此，敏感杂交种在感染期间总黄酮含量的降低可能与给定基因型的BPD易感性有关。这一发现可能证实了黄酮在植物防御病原体(卵菌)，如P. megakarya [16，22］．
随后，在总黄酮含量方面，我们研究了不同叶片中单个黄酮的分布，以了解可可叶中的所有黄酮是否与杂交基因型对BPD的抗性/耐受性有关(这是一个悬而未决的问题)。
在测试的可可豆杂交种中，大多数黄酮的分布取决于叶片状态和杂交基因型。在最高敏感型和中等敏感型杂交基因型(分别为E32和E13)中，感染与黄酮:芹菜靛蓝苷(tR=6.4)，芹菜素-戊基己糖(tR=7.8)，芹菜素-己糖苷(tR=11.6)，异牡荆素(tR=14.4)，芹菜素芦丁苷异构体(tR= 14.8)。异定向蛋白(tR=12.0)，但芹菜素-戊基己糖的轻度诱导(tR=10.7)在E13由于感染。而在耐药杂交基因型E9中，感染导致芹菜靛蓝苷含量显著增加(tR=6.4)，芹菜素-戊基己糖(tR=7.8)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)，芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)，异牡荆素(tR=14.4)和芹菜素芦丁苷异构体(tR=14.8)和芹菜素-葡萄糖苷(tR= 15.3)。这一发现揭示了BPD耐受型和敏感型杂交基因型之间的不同黄酮库。这可能突出了这样一个事实，即在感染期间，这些黄酮的产生和足够的数量(定量和定性)赋予了对低敏感杂交基因型BPD的耐受性。事实上，据报道，黄酮类化合物(包括黄酮)的抗致病作用取决于它们的结构[23］．
对3个杂交品种(E9、E13和E32)的单株黄酮家族特征与敏感性进行分析，结果表明，芹菜素二葡萄糖苷(tR=6.4)，芹菜素-戊基己糖(tR=7.8)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.1)，芹菜素-戊基己糖(tR=8.7)，芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)，异定向蛋白(tR=12.0)，木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)，异牡荆素(tR=14.4)和芹菜素芦丁苷异构体(tR=14.8)从E9, E13到E32。在一些植物中，如perennis L.， Adinandra nitida和马齿苋L. Nayaka等[23]和V等。[24]已经报道了芹菜素的抗菌特性。在Colletotrichum subblineolum /高粱互作中，Nicholson和Hammerschmidt [21结果表明，抗高粱品种的木犀草素含量高于易感高粱品种。
结果表明，木犀草素和芹菜素均能抑制草孢子的萌发。看来，这些黄酮可能使用的抗性机制是指抑制或限制P. megakarya对可可的攻击的特性。或者，上述黄酮也可能使用耐受性策略，通过调整其生理来缓冲对可可T. cocoa适应性的影响来减少或抵消其后果疾病［18］．一方面，这些抗性策略可能包括物理和/或化学屏障、快速清除感染的机制和限制损伤在可可T.可可内扩散的过程(如局部细胞死亡)。另一方面，耐受性通常涉及对疾病损害的某种程度的补偿。因此，可可豆可能通过增加叶片中的叶绿素浓度，延缓感染组织的衰老，增加营养吸收来耐受BPD引起的感染[24］．
这可能表明，上述黄酮可以被认为是可可对BPD耐受的标志。这些黄酮基团的刺激可能是由于在不同的可可对抗巨斑的反应过程中茉莉酸途径的激活[25］．事实上，在高粱抗炭疽病方面，Nicholson和Hammerschmidt [21]鉴定木犀草素和芹菜素为类黄酮植物抗毒素。此外，在感染条件下，木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)，异定向蛋白(tR=12.0)和芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)在耐感杂交基因型(E9)中出现，而在中度(E13)和高度(E32)易感杂交基因型中完全不存在。报道了异荭草素对亚麻病原菌的保护作用[26］．木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)，异定向蛋白(tR=12.0)和芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)可能部分由于黄酮类化合物的抗氧化特性。它们可以抑制病原体和植物因感染而产生的活性氧[26］．它们也可能直接参与抑制病原体的酶，特别是那些消化植物细胞壁的酶，通过螯合其活性所需的金属。这些小的次生代谢产物也可能抑制孢子发育和菌丝菌丝伸长[26］．Makoi和Ndakidemi [27]表明，黄酮类化合物可以抑制根系病原体，尤其是真菌病原体。总的来说，异黄酮、黄烷和黄酮被认为是有效的抗微生物剂[27］．
木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)，异定向蛋白(tR=12.0)和芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)可能是耐药可可豆杂交基因型的特征。相反，芹菜素己苷(tR=10.1)和芹菜素-己糖苷(tR=11.6)是BPD易感性的特征。在未处理的、损伤的和损伤+感染的年轻可可豆杂交基因型植株叶片中，它们的含量从E9、E13和E32增加。
ÃⅰÂ′Â′SNK64与ÃⅰÂ′Â UPA143杂交后，产生了重要比例的耐BPD或不敏感BPD的杂交基因型。在BPD感染过程中，可可豆杂交基因型根据杂交基因型的易感性调动黄酮。在感染过程中，木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)，异定向蛋白(tR=12.0)和芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)表现为耐受性杂交基因型(E9)的特征。芹菜素己苷(tR=10.1)和芹菜素-己糖苷(tR=11.6)似乎是易感杂交基因型的特征。因此，ÃⅰÂ′Â′SNK64 × ÃⅰÂ′Â UPA143可用于制备耐杂交基因型。木犀草素芦丁苷异构体(tR=12.5)，异定向蛋白(tR=12.0)和芹菜素-戊基己糖(tR=10.9)，在暴露于巨斑假单胞菌的可可中是有用的耐受性制造者。这些黄酮也可能在标记辅助选择中有用。
