制定和评价槲皮素纳米粒子使用由Qbd低分子壳聚糖的方法

文摘

摘要目的:这项研究的目的是制定和评价槲皮素纳米粒子使用低分子量壳聚糖通过应用QbD的方法。

材料与方法:槲皮素纳米粒子是由离子凝胶技术,低分子量壳聚糖用作聚合物。在这项研究中23阶乘设计(FD)和两个中心点被用于优化。独立变量的速度、时间和交联剂聚合物比例。因变量是颗粒大小和截留效率。结果数据被安装到设计专家软件(试用版)和分析统计使用方差分析(方差分析)。数据也进行响应面分析确定速度的影响,时间和交联剂的聚合物比反应。制备槲皮素纳米粒子的物理化学性质通过粒度,粒度分布,电动电势,表面形态的药物封装效率FT-infrared分光光度计,体外释放研究和动力学研究。

结果:优化槲皮素纳米粒子的平均粒径被发现97.5 nm的截留效率50%,+ 24.7 mv的电动电势。药物释放概要文件显示,有一个破裂释放30.7%的前5小时,93%的人被释放在36个小时。在释放动力学研究发布概要文件与Higuchi模型最适合R2值为0.995。

结论:优化的槲皮素纳米粒子可以作为有效的药物在癌症的目标由于其规模和药物释放特性。

关键字

纳米颗粒;低体重壳聚糖;QbD方法和槲皮素

介绍

槲皮素(3,3′,4′,5,7-pentahydroxyflavone)是黄酮醇子类中类黄酮的主要代表。据报道有多种生物活性和药理作用。他们最丰富的类黄酮,发现在多种食物包括苹果、浆果、芸苔属植物蔬菜,酸豆,葡萄、洋葱、青葱、茶和西红柿,以及许多种子,坚果,鲜花,叫和树叶。槲皮素本身已经证明展览在几个癌症化学预防作用包括肝、肺、前列腺癌、乳腺癌、肾癌(1- - - - - -4]。

的作用机制

抗氧化剂:槲皮素的酚组hydrogen-donating容量和展品抗氧化剂清除亲电子作用,氧自由基以及阻塞的形成铜和铁诱导自由基和抑制脂质过氧化作用在体外。

抗炎:抑制白细胞三烯的生产和前列腺素,抑制淋巴细胞和抑制巨噬细胞吞噬作用。

抗血小板:一个复杂的过程,涉及抑制和减少cyclicAMP类二十烷酸的途径。

抗肿瘤药:抑制细胞周期G1和S期在体外,抑制磷酸化的蛋白激酶C (PKC)和酪氨酸激酶,最终块细胞信号转导导致减少了肿瘤的生长。抑制RAS级联,这是重要的细胞增殖和凋亡。II型雌激素受体结合刺激增长的抑制。

抗病毒:与病毒结合外套,可以抑制核酸合成、逆转录酶的竞争性抑制剂。

抗组胺剂:抑制组胺的释放从肥大细胞和嗜碱粒细胞肺和肠组织(5,6]。

槲皮素的抗癌效果:成汉等人进行的一项研究证实了槲皮素的抗癌效应在肾癌细胞通过抑制细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡研究显示槲皮素抑制存活素mRNA表达和增强半胱天冬酶3活动。因此诱导细胞凋亡在肾癌细胞(图1)[7]。

尽管研究了槲皮素作为癌症治疗的潜在候选人有一定的局限性,如低溶解度(< 0.1 g / ml),可怜的吸收(< 10%),高代谢率(< 1 h)和低生物利用度。因此,为了克服这些限制,纳米技术正在被使用。槲皮素加载聚合物纳米粒子将提高其生物利用度,目标和有效治疗癌症。

本研究的主要目的是准备槲皮素加载使用低分子量壳聚糖聚合物纳米粒子的制备与普通壳聚糖酶解,通过设计方法,并通过应用质量评估。低分子量壳聚糖针对效率和增加了约100纳米的纳米颗粒被认为是有效的针对癌细胞。

材料和方法

槲皮素纳米粒子的材料配方中使用槲皮素(Sigma-Aldrich)壳聚糖(HIMEDIA)乙酸(RANKEM),纤维素酶和果胶酶(礼品样本太阳发光制药),三聚磷酸钠(Sigma-Aldrich), DMSO (Sigma-Aldrich),氯化钠(Chemspure)、磷酸氢二钠(光谱)、磷酸二氢钾(光谱)、乙醇(分析CS试剂)。使用的软件是设计专家7.1.5垫prism7和图。

通过酶解制备低分子量壳聚糖

壳聚糖1.0% (W / V)的解决方案是准备使用1% V / V醋酸的pH值约为3.0。上述解决方案,添加了酶和孵化37°C与恒定搅拌3 - 5小时。水解后,酶灭活在1000°C 10分钟和pH值调整到12 2 M氢氧化钠沉淀聚合度高的产品(DP)。暂停是离心机;不溶残渣被双重蒸馏水和冻干给LMWC (表1)[8]。

表1。通过酶解制备低分子量壳聚糖。

对制备低分子量壳聚糖的评价

平均粘度测定分子量奥斯特瓦尔德粘度计:粘度平均分子量决心通过奥斯特瓦尔德粘度计。本工作的混合物中使用溶剂10毫升0.5醋酸和20毫升的0.25 M氯化钠。实验进行了一式三份整合价值。粘度的平均分子量就从下面的公式计算8]。

相对粘度

相对粘度增加(或特定粘度)的比率不同粘度(或流出时间)溶剂粘度(或溶剂流出时间)

降低粘度粘度(或数字)

固有粘度

固有粘度(η)可以被定义

通过绘制粘度浓度的函数的内在粘度可以通过外推估计聚合物溶液浓度为零。

Mark-Houwink方程

方程描述的依赖的固有粘度聚合物的相对分子质量(分子量)是:

在固有粘度(η),K和α是常数的值取决于聚合物的性质和溶剂以及温度、和M通常是一个相对分子质量平均水平。

傅里叶变换红外光谱仪(ir)分析

低分子量壳聚糖红外光谱分析是用溴化钾片技术在4000 - 400厘米的范围¹。所有的光谱被记录在室温下4厘米的一项决议¹45扫描。红外光谱研究是为了确认没有结构变化产生的低分子量壳聚糖与正常相比壳聚糖(9]。

制备槲皮素使用低分子量壳聚糖纳米粒子

槲皮素纳米粒子是由离子凝胶交联方法。槲皮素最早是溶于DMSO:磷酸缓冲盐(1:4的比例),在80年添加充分为了拿出完整的溶液化即透明液体的解决方案。低分子量壳聚糖在适量拍摄,使溶于磷酸缓冲盐pH值7.4和醋酸添加在缓慢下降,直到它被完全水溶性。适量的槲皮素和壳聚糖溶液(1:2比率)混合,然后需要数量的0.1%的三聚磷酸钠添加交联剂和解决方案是大力搅拌,直到观察乳白光。最后悬挂在指定的转速和离心时间。得到的上层清液在离心收集和测量。槲皮素和低分子量壳聚糖的比率的基础上选择槲皮素的稳定性与低分子量壳聚糖在磷酸缓冲盐溶液。发现0.5毫克/毫升的槲皮素与低分子量稳定(无降水)解决方案(图2)[10]。

槲皮素纳米粒子的优化配方使用QbD -设计expert7软件

在这项研究中2³阶乘设计(FD)和两个中心点被用于优化(图3)。在这项研究中独立变量是速度、时间和交联剂聚合物比例。因变量是颗粒大小和截留效率。独立变量中,速度,时间和交联剂聚合物比(C: P)被确定为最关键的参数将影响粒子的大小和截留效率。反应,粒度是癌细胞最重要的目标和截留效率是下一个重要的作为一个有效的配方。所以这些自变量和响应优化配方的选择。(表2)总结了一个帐户的所有实验运行和独立变量的实际值和水平。所有其他的配方和加工在整个研究变量保持不变。结果数据被安装到设计专家软件(试用版)和分析统计使用方差分析(方差分析)。数据也进行响应面分析确定速度的影响,时间和交联剂的聚合物比反应。

表2。为槲皮素纳米粒子的制备配方优化设计总结(* TPP溶液浓度是1毫克/毫升)。

评估优化的槲皮素纳米粒子

粒子大小、粒子大小分布:配方的粒度和粒度分布是由照片关联能谱法ζ大师(英国莫尔文仪器)配备莫尔文电脑软件。

ζ电位:电动电势测量使用照片关联能谱法和Zeta大师(英国莫尔文仪器)配备莫尔文电脑软件。

药物封装效率:免费的截留效率计算槲皮素,是目前离心后的上清液和吸光度测量使用紫外分光光度计在362海里。封装效率计算使用公式(10]。

傅里叶变换红外光谱仪(ir)分析:红外光谱分析优化槲皮素纳米粒子配方做了使用KBr盘技术在4000 - 400厘米¹。所有的光谱被记录在室温下4厘米的一项决议¹45扫描。

表面形态:表面形态的研究纳米粒子是由使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜。

体外释放的研究:槲皮素发布概要文件从HIMEDIA调查采用透析袋(membrane-50)。在这项研究中5毫克当量纳米颗粒被分散在2毫升磷酸盐缓冲剂和2毫升接种在透析膜。透析膜含有QUER-CHIT纳米粒子将被放置在一个200毫升的媒介在37°C下磁力搅拌。中磷酸盐组成的pH值7.4含10%乙醇(v / v)因为这位在水中的溶解度的限制使它不可能研究缓冲区。在选定的时间间隔整除的样本被取消,取而代之的是新鲜媒介保持在相同的温度。取消样品介质被紫外可见分光光度计测量吸光度在370海里。相关的吸光度是记录和使用标准曲线的槲皮素释放量。结果表示为累积释放率作为时间的函数与标准的这位。

动力学研究:对药物释放的动力学和机理,估计的结果在体外药物释放研究纳米颗粒都配备了各种动力学方程零阶(累积%释放和时间),一阶(日志%剩余药品和时间),Higuchi“s模型(累积%药物释放与时间的平方根)。R²和k值计算的线性回归分析得到的曲线以上的情节。

结果与讨论

识别的药物

槲皮素的红外光谱表明特定峰值对应-哦拉伸为3384.93厘米¹,碳氢键弹性为2360.77,C = O伸展在1665.94厘米¹在1512.64厘米,芳香C = C伸展¹和1613.28厘米¹在1211.08厘米,芳香切断伸展¹所示(图4)。

熔点测定

槲皮素被发现的熔点316.5

初步的溶解度的研究药物

槲皮素的溶解度研究。发现DMSO-phosphate缓冲pH值7.4溶剂系统中槲皮素的溶解度高0.5毫克/毫升。但解决方案往往沉淀一段时间后。这高于溶剂系统当二层80 (3% v / v)补充道,槲皮素溶液保持稳定,没有发生沉淀。因此,溶剂DMSO -磷酸盐缓冲体系pH值7.4和渐变80被进一步的研究即槲皮素纳米制剂的配方。

药物赋形剂相容性研究

槲皮素的主要山峰被发现相同标准的描述没有有害的交互中所示图6。

(上):红外光谱的药物-槲皮素。B(中间):药物和LMWC的红外光谱。

C(下):LMWC。

制备槲皮素的标准校准曲线

表3。校准曲线的槲皮素截留效率(溶剂:DMSO -磷酸盐缓冲7.4和渐变80)。

表4。校准曲线的槲皮素药物释放(溶剂:10%磷酸缓冲pH值7.4 v / v)。

对制备低分子量壳聚糖的评价

粘度测定平均分子量的壳聚糖:粘度平均分子量的壳聚糖,制备低分子量壳聚糖产品的各种时间间隔(图9)计算和描述的结果表。

从(表5),很明显,增加反应时间与酶结合的纤维素酶和果胶酶显著降低壳聚糖的分子量。原料壳聚糖的分子量明显减少的1123197哒15 K哒5小时的反应时间。这得到低分子量壳聚糖产品被选中作进一步评价研究。

表5所示。总结LMWC粘度平均分子量的准备。

傅里叶变换红外光谱仪(ir)分析:红外光谱的研究制备低分子量壳聚糖进行了并与最初的壳聚糖。这些结果表明,主链的结构最初的壳聚糖和LMWCs是相同的。氨基氨基酸组有一个特征峰附近的3440厘米¹,这是由于-哦组重叠的峰。吸收峰的出现在2900厘米左右¹被分配到ch2的不对称伸缩振动和强度的快速减少LMWCs可能是归因于降解后的壳聚糖水解。一个重要的峰值约1660厘米¹- c = O组,这意味着有更多的机会,形成较强的氢键,以及聚合物链的断开导致壳聚糖分子量的降低。结果表明,之间没有显著差异的主要结构前后两个样品酶水解,但主要水解产物的分子量下降(图10)。

评估准备槲皮素纳米粒

颗粒大小:粒子大小的配方使用莫尔文粒度分析仪进行了评估。粒子大小的公式如下所示(表6,图11)。

表6所示。粒度的准备槲皮素纳米配方。

截留效率:槲皮素纳米粒子配方的截留效率测量和描述的结果(表7)。

表7所示。准备的截留效率QC纳米配方。

优化槲皮素Nanoformulation”

回答1:颗粒大小

一半正常图显示,点构成正面或负面影响粒子的大小。这里影响颗粒大小的重要因素是(速度)和BC(时间和C: P比值)。

模型11.33的f值意味着模型是显著的。只有3.66%的机会“模型”f值很大。这可能会发生较大的值由于噪音。“概率> F”的值小于0.0500表明模型方面意义重大。在这种情况下,BC模式方面具有重要意义。值大于0.1000表明模型条款并不重要(图14)。

的曲率f值17.73意味着有显著的曲率(以区别中心点的平均值和平均的阶乘分)在设计空间。只有2.45%的机会“曲率f值”这个大可能是由于噪音。

的Pred平方0.2755没有接近0.8659的“Adj平方”。“Adeq精度”措施的信号噪声比。比大于4是可取的。因此10.852的比率表明一个适当的信号。这个模型可以用来导航的设计空间。的R -方价值回归是0.9497。这意味着95%的变异大小可以通过上面的模型来解释。上面的方程是统计生产能力大小的95% (表8)。

表8:最后方程的实际因素。

三维响应面图显示,增加速度和时间降低了粒子的大小。

回答2:截留效率

一半正常图显示,点构成正面或负面影响截留效率。影响截留效率的重要因素是交流(速度和C: P比值)和(时间)(图17)。

模型62.14的f值意味着模型是显著的。只有0.31%的机会“模型”f值很大。这可能会发生较大的值由于噪音。“概率> F”的值小于0.0500表明模型方面意义重大。在这种情况下,C, AB, AC, ABC模型来说非常重要。值大于0.1000表示模型条款并不显著的曲率f值5.33意味着曲率(以区别平均中心的点和阶乘的平均点)在设计空间相对于噪声并不重要。有10.41%的可能性,“曲率f值”这个大可能发生由于噪声(图18)。

的Pred平方0.8470是在合理的协议”的平方”0.9745。“Adeq精度”措施的信号噪声比。比大于4是可取的。因此比23.117意味着一个适当的信号。这个模型可以用来导航的设计空间。的R- - - - - -squared value of the regression equation is 0.9904. It means that 99% of variation in the entrapment efficiency can be explained by the above regression model. That is the combination in the above equation is statistically capable to produce 99% of entrapment efficiency (表9)。

表9:最后方程的实际因素。

的等高线图表明,速度400 - 500 rpm和C。P 3 - 5的比例给好的结果截留效率(图19- - - - - -22,表10)。

3 d响应曲面图显示增长速度高达500和C: P 4的比例增加了截留效率。

表10:优化配方QbD的工具。

评价槲皮素配方进行了优化

粒度和粒度分布:优化槲皮素纳米粒子的粒径公式被发现97.5 nm,粒度分布窄。100海里左右的颗粒大小是肾脏所需的目标。因此,优化产品可能是一个合适的人选的有效治疗肾细胞癌(图23)。”

药物截留效率:截留效率从上面给定的公式计算。优化配方的截留效率是50%。

ζ电位:优化配方的电动电势是+ 24.7 mv。因此,准备优化配方具有高度的稳定性(图24,表11)[11]。

表11:评估优化的配方QC11。

红外光谱的研究优化的配方:优化配方的红外光谱研究槲皮素纳米粒子进行了使用红外光谱和特征峰显示在(图25)。优化配方的顶峰(上)与标准槲皮素光谱匹配(底部)。

表面形态:优化配方的SEM和TEM分析表明,他们有粗糙表面的不规则的球体,所示(图26- - - - - -27)。

在体外释放的研究:的体外释放的研究槲皮素纳米粒子配方进行了优化(图28)。

从结果(表12),发现有一个初始破裂释放约30.7%的前5小时。这可能是由于药物的释放禁锢在纳米颗粒的表面。后来又发现有持续释放到36小时93%的药物释放。后没有释放。

表12:药物释放的优化配方(QC11)。

动力学研究:动力学研究的结果优化配方的说明(图29和表13)。

表13:动力学研究槲皮素纳米粒子配方进行了优化。

从结果(表13)最适合释放动力学模型被发现Higuchi模型优化的配方,这表明释放矩阵类型制定。因为n的值小于1.0,优化配方遵循非Fickian运输毒品的扩散机制。

结论

槲皮素纳米粒子使用制备低分子量壳聚糖(15 KDa的粘度平均分子量)离子凝胶法和优化了配方优化技术(2³阶乘的方法)使用软件设计专家。粒子的平均尺寸是97.5 nm的截留效率50%,+ 24.7 mv的电动电势。

槲皮素的释放动力学研究纳米颗粒进行了使用透析技术。药物释放概要文件显示,有一个破裂释放30.7%的前5小时,93%的人被释放在36个小时。在释放动力学研究发布概要文件与Higuchi模型最适合R2值为0.995,因此认为优化配方基质类型释放特征。

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