石榴子清除自由基及抗炎活性的研究。水果皮

摘要

石榴果皮甲醇提取物具有体外抗氧化和抗炎活性。50%抑制超氧自由基、羟基自由基生成、一氧化氮自由基形成和脂质过氧化作用所需浓度分别为183.3、94.0、53.0和88.5 μg ml-1。在角叉菜胶、牛血清白蛋白(BSA)和右旋糖酐诱导的balb/c小鼠急性和福尔马林诱导的慢性炎症模型中评估提取物的抗炎活性。两种模型的提取物均表现出明显的抗炎活性，与对照组相当。

关键字

石榴，果皮，抗氧化，消炎

简介

炎症是对损伤的直接防御机制或反应，可能是由感染、化学或物理因素引起的[1］．它包括疼痛，热红和肿胀患部功能丧失。在某些情况下，炎症可能导致慢性炎症性疾病的发展，如类风湿性关节炎炎症性肠病牛皮癣等。活性氧(ROS)和自由基被认为直接作为细胞信使并引发炎症反应。ROS和自由基还能激活蛋白激酶、蛋白磷酸酶、转录因子和热休克蛋白等一系列酶系统，增加炎症的范围。在这些情况下，补充无毒抗氧化剂可能有保护作用。从古代开始药用植物已被证明是治疗癌症，溃疡，炎症等强有力的治疗剂。世界上大约60%的人口几乎完全依赖植物作为药物[2和一些药用植物已被证明是有用的治疗剂，其他几种植物仍在等待发现。

石榴石榴树(Punicaceae)通常被称为“石榴”，是一种在欧洲、毛里塔尼亚、印度支那、西印度群岛、圭亚那、巴西、留尼汪岛和南非药用的小树[3.］．这种植物在民间医学中被用于治疗各种疾病，如肝损伤，蛇咬、溃疡、关节炎等[4］．这种植物也显示出强大的在活的有机体内抗氧化和胃保护作用对阿司匹林和乙醇诱导的胃溃疡模型[5］．本研究旨在研究其自由基清除和抗炎(急性和慢性模型)活性methanolic提取的p . granatum水果皮。

材料与方法

植物材料及制剂:p . granatum水果都是从喀拉拉邦的特里斯瑟当地购买的。将果皮风干，用70%甲醇在室温下搅拌24小时提取粉状物质。萃取物经过过滤、浓缩和蒸发至干燥。干燥的提取物悬浮在蒸馏水中，用于进一步研究。

动物:的在活的有机体内果皮抗炎作用p . granatum采用喀拉拉邦农业大学小动物育种站提供的Balb/c小鼠(22-26 g体重)进行评估。动物分组在通风的笼子里，保持在22-280C, 60-70%相对湿度和12小时的明暗循环。这些动物被喂食标准的老鼠饲料(印度利普顿)和自由取水。

在体外抗氧化活动

超氧自由基清除活性:使用硝基蓝四氮唑(NBT)还原法检查了对超氧自由基产生的影响[6］．反应混合物中含有:EDTA (6mM;与3mg NaCN)，核黄素(2mM)， NBT (50mM)植物提取物(1 ~ 100μg ml)^－1)和磷酸盐缓冲液(67mM, pH=7.8)，最终体积为3ml。用白炽灯均匀照射管15分钟，并在光照前后530nm处测量光密度。

羟自由基清除活性:通过研究脱氧核糖和测试化合物对铁生成的羟基自由基的竞争来测定羟基自由基的清除能力^{3 +}/抗坏血酸盐/ EDTA / H₂O₂系统。反应混合物含有:脱氧核糖(2.8 mM)， FeCl_3.(0.1 mM)， EDTA (0.1 mM)， H₂O₂(1毫米),抗坏血酸盐(0.1 mM)， KH₂阿宝^{4 -}- KOH缓冲液(20 mM, pH=7.4)和提取物(1 ~ 100 μg ml)^－1)，最终体积为1ml。在370C孵育1小时后，采用Ohkawa等人的方法测定脱氧核糖降解率。[7］．

抑制一氧化氮自由基活性:硝普钠在生理pH下的水溶液中生成一氧化氮，与氧相互作用生成亚硝酸盐离子，用Griess反应测定[8，9］．反应混合物(3ml)含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)硝普钠(10mM)和化合物(1 ~ 100 μg ml)^－1)在250℃下孵育150分钟。孵育后，取0.5ml反应混合物和0.5ml Griess试剂(1%磺胺，2% H_3.阿宝₄并加入0.1%萘乙二胺二氯)。在546nm处考察了所形成的色谱团的吸光度。

抑制脂质过氧化物形成(Fe2+/抗坏血酸体系诱导):反应混合物含有大鼠肝脏匀浆(0.1 ml, 25% w/v) Tris-HCl (30mM)、硫酸亚铁铵(0.16 mM)、抗坏血酸(0.06 mM)和不同浓度的化合物(1 ~ 100 μg ml)^－1)，在370C下孵育1小时，得到0.5 ml的最终体积硫代巴比土采用Ohkawa等人的方法测定酸反应物质(TBARS)。[7］．取0.4ml的反应混合物，用十二烷基硫酸钠(SDS) (0.2 ml, 8.1%)、硫代巴比妥酸(1.5 ml, 0.8%)和乙酸(1.5 ml, 20%;pH=3.5)，加入蒸馏水制成总容积为4毫升，在950C的水浴中保存1小时。冷却后，加入蒸馏水(1 ml)和正丁醇/吡啶15:1 (v/v) 5 ml。振荡离心后分离有机层，在532 nm处测定吸光度。

在活的有机体内抗炎活动

评估急性和慢性抗炎活性。前者用卡拉胶、牛血清白蛋白和右旋糖酐诱导小鼠足水肿，后用福尔马林诱导小鼠足水肿水肿在老鼠的后爪。

急性模型:对于每个模型，动物被分为三组，每组5只动物。各组小鼠右后肢分别于足底下注射现配制的15%角叉菜胶、葡聚糖和牛血清白蛋白悬液0.02ml(生理盐水)诱发急性角叉菜胶、葡聚糖和牛血清白蛋白炎症。各急性模型留1组作为对照，另1组给药250 mg kg^－1第三组500 mg kg^－1的甲醇提取物p . granatum足底下注射前1小时口服。在足底下注射初期和注射后3小时，用游标卡尺测量每个模型的脚掌厚度。

慢性模型:动物被分为三组，每组5只。各组小鼠右后腿足底下注射0.02 ml 2%福尔马林诱导炎症。一组为对照组，另一组为250 mg kg^－1第三组500 mg kg^－1在福尔马林注射前1小时口服甲醇提取物，并连续给药6天。在注射福尔马林前和注射福尔马林后6天，用游标卡尺测量炎症程度。

统计分析:数据采用Student 's t检验进行统计学分析，P值< 0.05为显著性。所有数据均以均数±标准差表示。

结果

在体外抗氧化活动

抑制超氧自由基的产生

的甲醇提取物p . granatum结果表明，果皮能清除植物产生的超氧化物核黄素光还原法。对超氧自由基50%抑制(IC50)所需的提取液浓度为61.1 μg ml^－1（表1)．姜黄素等已知抗氧化剂的浓度为6.5 μg ml^－1这表明抗氧化活性p . granatum水果提取物非常有效。

抑制羟自由基的产生:铁生成的羟基自由基对脱氧核糖的降解^{3 +}/抗坏血酸盐/ EDTA / H₂O₂体系中发现其浓度为94 μg ml^－1姜黄素浓度为2.8 μg ml即可达到50%的抑制作用^－1（表1)．

抑制一氧化氮自由基的产生:在生理pH值下，硝普钠产生的一氧化氮自由基被其甲醇提取物抑制p . granatum水果皮。50%提取液的浓度为53 μg ml^－1（表1)．

抗炎活动:角叉菜胶、右旋糖酐、牛血清白蛋白和福尔马林诱导小鼠水肿的实验结果表明，枸杞醇提物具有抗炎作用p . granatum果皮呈现在(表2)．结果表明，提取物对大鼠水肿的形成具有明显的抑制作用。剂量为500mg kg^－1体重对水肿形成有抑制作用(卡拉胶、右旋糖酐、牛血清白蛋白和福尔马林诱导模型分别为70.7、39.2、79.7和87.8%)。

讨论

本研究首次报道了黄芩醇提物的抗氧化和抗炎活性p . granatum水果皮。研究表明，该提取物对卡拉胶、右旋糖酐、牛血清白蛋白和福尔马林诱导的急、慢性炎症均有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性。对角叉菜胶、牛血清白蛋白和福尔马林诱导的小鼠炎症模型有显著减轻作用(P<0.05)，而对右旋糖酐诱导的小鼠足水肿无明显影响(P>0.05)。

自由基已被证明与多种疾病的触发有关，如动脉粥样硬化、癌症、溃疡、炎症性疾病[10］．超氧自由基调节代谢产物，能够向细胞遗传机制传递信号和重要信息。在药物、毒素、应激、组织损伤和高强度运动等多种慢性炎症病例中，都有超氧自由基的过量产生。羟基自由基也参与炎症过程。氧衍生的自由基可以从细胞外释放白细胞暴露于趋化剂、免疫复合物或吞噬挑战后。低水平的这些强效介质的细胞外释放可增加趋化因子(如IL-8)、细胞因子和内皮白细胞粘附分子的表达，放大引发炎症反应的级联[11］．

炎症主要是由自由基的产生引起的。因此，抗氧化剂的管理可能在这些条件下有保护作用。大多数消炎药具有抗氧化作用，清除炎症过程中产生的自由基。另据报道，在一些动物模型中，观察到给药超氧化物歧化酶或其他自由基清除剂可减轻炎症[12］．本研究结果表明p . granatum果皮具有较强的体外清除超氧化物、羟基和一氧化氮的活性。我们也报道了甲醇提取物的管理p . granatum提高阿司匹林和乙醇诱导溃疡的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽水平[5］．

p . granatum据报道含有生物碱如球粒三烯、伪球粒三烯和初步植物化学筛选显示植物中存在黄酮和萜烯［13］．这些化合物具有多种生物学特性，包括通过多种机制产生保护作用，如抗氧化作用[13］．因此，本研究证明了枸杞的抗炎活性p . granatum果皮可能是由于其强大的抗氧化性能。总之，我们的研究结果为传统的使用提供了一定的科学依据p . granatum治疗炎症性疼痛的果皮。然而，进一步的实验是必要的，以分离活性原理和了解正确的作用机制的化合物。

参考文献

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