遗传和生物特征的Puroindoline Puroindoline B在意大利小麦品种

文摘

影响小麦小麦内核结构是一个重要的属性原材料处理和最终用途的产品特性。小麦谷物纹理是由基因决定的,遗传的特性。小麦品种差异驻留在变量a和b puroindoline(碧娜和Pinb)等位基因的形式,导致连续的变量谷物硬度。基因测定碧娜和Pinb序列在大量的国际品种导致遗传多态性的评估对小麦谷物纹理。这里我们报告Pina-D1的识别和Pinb-D1等位基因多态性在28意大利软质小麦品种(小麦l .)和十意大利硬质小麦品种(小麦属植物turgidum l . ssp。硬质)。与先前的研究相比,我们的结果显示Pinb-D1b的存在,Pinb-D1d和Pina-D1b(删除等位基因)等位基因在意大利品种。因为只有一些puroindoline a和b等位基因一直追究其直接影响小麦谷物纹理,我们进行了生物信息学分析puroindoline多态性,预测可能产生的影响小麦蛋白质的生物功能。这个调查可以提供有用的信息内核扩展当前的知识遗传因素在软质小麦硬度和适应症育种和食品的应用。

关键字

Puroindoline基因,小麦、谷物纹理、遗传分析、生物信息学。

介绍

谷物是人类营养主要组件。不同小麦使用小麦请求分类属性关注内核结构,作为“软”(或面包)小麦(小麦L)或“硬质”(很难)小麦(小麦属植物turgiduml . ssp。硬质)[1]。然而,软质小麦品种可以进一步划分为子类由于他们不同的材质硬度,从软到硬。小麦内核结构是小麦分类和关键特性食品行业目的地。常见,六倍体小麦品种(小麦L。)用于面包、饼干、蛋糕和糕点,而四倍体品种,来自小麦属植物turgidumvar.硬质(AABB),主要用于意大利式面条。

谷物纹理是一种遗传性状和粮食的主要基因结构的决心是位于染色体的短臂上5 d(特别是中发现t . aestivum)。轨迹被任命为硬度(Ha)轨迹和控制谷物硬度小麦。柔软的表型被公认为主要特征(2]。这个轨迹包含puroindoline(冰镇)和puroindoline b (Pinb)基因(代表小麦内核结构)的主要决定因素,这是大约13 kDa的子单元friabilin,和谷物柔软蛋白基因(Gsp-1)。

碧娜和PINB蛋白质决定谷物淀粉颗粒的表面纹理绑定在胚乳细胞和前面描述的蛋白复合物形成。柔软的表型是由野生型等位基因决定的,名叫Pina-D1a和Pinb——D1a Puroindoline(冰镇)和Puroindoline b (Pinb)基因。Pina-D1和Pinb-D1基因的编码序列是intronless和长447 bp共享70.2%的编码序列。这种小麦endosperm-specific基因编码脂质结合148个氨基酸的蛋白质,cysteine-rich骨干和独特tryptophan-rich域,这被认为是负责强亲和力Puroindoline-D1蛋白质的极性脂质(3]。

硬纹理表型结果不同突变在任何一个或两个puroindoline puroindoline编码基因的基因或完全没有,分别为(4]。事实上,它已经表明,RNA干扰(RNAi)的沉默的碧娜和Pinb基因显著降低puroindoline puroindoline b蛋白在小麦和谷物硬度增加(5]。迄今所有小麦品种在冰镇或Pinb基因突变是很难变形,而小麦具有“软类型”Pina-D1a和Pinb-D1a序列是柔软的纹理。

puroindoline缺席在硬质小麦的遗传基础主要是由进化的事件导致的物种形成硬质和软质小麦。硬质小麦(小麦属植物turgidum)起源于大约500000年前从山羊草属间杂交事件speltoides和小麦属植物urartu,导致四倍体品种(基因组AABB)。随后的杂交事件(发生在约8000年前)小麦属植物turgidum和山羊草属tauschii导致六倍体普通小麦的起源(小麦基因组AABBDD)。现有的证据表明,删除事件发生在Ha轨迹在杂交过程中,导致这些基因的完全没有硬质小麦。相反,碧娜和Pinb基因提供了常见的小麦基因组a tauschii (D染色体系列)(6]。相反,第三个属于Ha基因位点,Gsp-1,守恒的硬质小麦。GSP基因的存在及其在硬质小麦建议可能的表达式决定谷物纹理(扮演一个次要角色7]。

Puroindoline基因引起全世界的科学兴趣的内核结构赋予属性。调查在几个小麦品种已经导致大量的等位基因的识别Pina-D1和Pinb-D1基因(8]。识别后,puroindoline基因已经被进一步追究他们的特定的相关软质小麦的内核结构9]。除了texture-related函数,puroindolines也被认为是a-amylase抑制剂(aai)和种子存储(SS)蛋白质,有可能对病原体的作用在保护植物杀菌和抑菌(10,11]。

作为最大的小麦生产国和消费国的“软、硬”在整个世界中,意大利是一个中心的小麦,小麦种质持有一个高度多样化的股票,证明有用的应用和基础研究的努力给洞察的生物学小麦植株。种质资源和育种提供基础的科学方法丰富的小麦收成。

在我们的研究中,我们旨在调查Pina-D1和Pinb-D1等位基因多态性在意大利小麦和小麦属植物turgidumssp。硬质小麦品种,评估可能的遗传差异与表型变异在内核结构有关。为了这个目的,我们放大和测序Pina-D1 Pinb-D1来自每一个品种的基因进行生物信息学分析,评估可能的表型影响谷物纹理。

方法

植物材料

意大利十小麦属植物turgidumssp。硬质和28日意大利小麦粮食品种(CRA-SCS),提供的是Battipaglia(意大利萨勒诺)和CRA-SCS(意大利维罗纳)。对于每一个品种,谷物停飞和树叶被用来提取DNA。

新鲜的叶子形成小麦品种收集并立即在液氮磨。样本储存在-80°C到DNA提取。

从小麦叶片中提取DNA

DNA提取1.6克的磨小麦叶子后,CTAB提取方法(12]。DNA产量和纯度是评估使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德)。提取的DNA纯度是基于260/280和260/230比率。DNA完整性评估运行样本中提取1% (w / v)琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。

Puroindoline和控制基因的PCR扩增

对每个DNA样本进行PCR扩增。积极控制,Gsp1基因放大(因为它的存在也在A - B -小麦基因组,除了D-genome)。Gsp1引物序列Gsp-1F-5 -CTTCCTCCTAGCTTTCCTTG-3和Gsp-1R——TAGTGATGGGGATGTTGCAG-3”(13]。引物用于放大Pina-D1和Pinb-D1 Pina-F-5——ATGAAGGCCCTCTTCCTCA-3, Pina-R-5 -TCACCAGTAATAGCCAATAGTG-3, Pinb-F - 5“-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3”,分别Pinb-R - 5”——TCACCAGTAATAGCCACTAGGGAA-3”(3]。样本中失踪Pina-D1放大,第二对引物被用来评估Pina-null等位基因的存在(Pina-D1b)。他们的序列是:Pina-D1b-F-5 -AATACCACATGGTTCTAGATACTG-3和Pina-D1b-R——GCAATACAAAGGACCTCTAGATT-3”(14]。

PCR反应进行25μL总量包含25 pmol每个引物,250μM每个核苷酸,1 x PCR缓冲,MgCl2 1.5毫米,0 5单位的Taq DNA聚合酶(美国Promega)和100 ng的DNA模板。GSP1, Pina-D1 Pinb-D1放大在95°C程序由初始变性5分钟,其次是35周期95°C的40年代,55°C 50年代,72°C 1分钟和最后一个在72°C扩展7分钟。Pina-D1b放大在95°C程序由初始变性5分钟,其次是35周期95°C的40年代,57 50°C, 72°C 1分钟和7分钟72°C。

预期Gsp1扩增子是467个碱基对长度(bp),而Pina-D1和Pinb-D1 447 bp的长度和碧娜- D1b是778个基点。PCR扩增随后评估运行放大产品1,2% (w / v)琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色的,比较扩增子的大小和DNA凝胶电泳大小标准(DNA梯100 bp +, Applichem,达姆施塔特,德国;DNA分子量标记十七500个基点的梯子,罗氏诊断,德国曼海姆)。

提取DNA片段被re-amplified PCR克隆使用助教(美国表达载体)和测序克隆工具包。每个碧娜和Pinb PCR凝胶产品被切断,纯化Qiaquick凝胶萃取设备(试剂盒、希尔登,德国),克隆到pMOSBlue向量,pMOSBlue冲结束克隆工具,(美国新泽西州Amersham,皮斯卡塔韦),和用于将DH5α主管细胞(Stratagene拉霍亚,CA)。插入所需的大小进行评估使用PCR和T7和M13引物。

DNA序列分析

重组克隆测序两股使用大染料终结者v3.1循环测序工具通过DNA自动测序系统ABI棱镜3100自动测序仪(应用生物系统公司,培育城市,CA)。

限制性位点等位基因的识别

评估特定等位基因多态性的身份限制试验进行Pinb-D1扩增子,使用SapI限制性内切酶(预测削减只有Pinb-D1b等位基因)(美国热科学)。我们消化10μL扩增子5单位的SapI酶,2μL缓冲和孵化16小时37°C。在65°C失活进行了2个小时。凝胶电泳进行3%的琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。检测两个消化片段,而pBR322 DNA-MspI消化分子标记(美国新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)。

生物信息学分析

NE刀V2.0是用来评估限制性内切酶网站地图在每个已知Pina-D1和Pinb-D1等位基因,目的是评估存在的差异/缺失或限制性位点的位置。这样评价允许执行特定PCR扩增子消解时为了证实等位变异的存在。证实了克隆的序列执行计算机的本质与已知的冰镇和Pinb序列相似性搜索在NCBI数据库中使用BLASTN算法(15)评估的特异性放大对整个数据库产品。

野生型之间的直接比较puroindoline序列Pina-D1a Pinb-D1a和测序产品使用Clustal W程序执行(16)和验证,为每个序列位置,参考等位基因的核苷酸的信件。使用ExPASy的核苷酸序列翻译翻译工具和翻译序列提交PROVEAN软件工具来预测氨基酸替换或indels能否影响分析蛋白质的生物功能。截止值来预测蛋白质改变有害的是设定在-2.50 [17]。

结果

Gsp-1, Pina-D1 Pinb-D1基因扩增

分析了小麦DNA样本给GSP-1基因扩增(上述特定的扩增子467个基点),确认中提取DNA是否适合puroindoline基因调查。Puroindoline基因扩增被确认在每个软质小麦DNA样本。图1显示了克劳迪奥的扩增结果,瓜达卢佩和阿德莱德品种。

我们没有得到任何Pina-D1放大的品种分析,我们进行了PCR检测,具体评估零Pina-D1等位基因的存在(Pina-D1b) (图2)。

大的品种评估删除都是硬质小麦品种。以前曾有报道称,此外,由于瓜达卢佩品种缺乏Pina-D1放大,我们执行一个Pina-D1b特定PCR品种。瓜达卢佩旁边,我们有Pina-D1b扩增子美沙酮、普罗费,Ciano Sibilia品种(12]。图3显示Pina-D1b放大积极的结果。

碧娜和Pinb基因序列分析

为了确认Pina-D1的特异性,Pinb-D1 Pina-D1b放大和特定等位形式,我们从琼脂糖凝胶切除,克隆和测序的扩增子的兴趣。BLASTN分析显示,预计获得放大特定的基因相比,公共序列数据库。

所有放大序列与参考等位基因(Pina-D1a和Pinb-D1a)使用ClustalW程序来评估特定的基因型和使用ExPASy翻译工具翻译序列得到。在软质小麦品种中,最常见的基因型产生Pina-D1a / Pinb-D1b(发现在阿德莱德,熊猫,Colfiorito和遭到品种)和Pina-D1a / Pinb-D1d(奥布松和博洛尼亚),但是Pina-D1a-b / PinbD1a(瓜达卢佩)基因型还发现(我们获得积极成果Pina-D1a和Pina-D1b放大)。此外,五软质小麦品种,美沙酮、普罗费,Ciano,瓜达卢佩和Sibilia显示Pina-D1无效等位基因的存在(Pina-D1b / Pinb-D1a基因型)。

表1。显示了识别Pina-D1 /每个t . aestivum Pinb-D1基因型和t . turgidum ssp。硬质小麦。Pina-D1序列被发现的野生型等位基因(Pina-D1a,基因库DQ363911)对所有剩余的面包小麦品种,因此预计将酸性氨基酸序列与野生型相同puroindoline蛋白质。Pinb-D1扩增子测序发现更高层次的异质性在调查品种,作为两个不同的等位基因被确定在野生型小麦。事实上,大多数品种分析显示Pinb-D1等位基因的野生型版本当与参考序列(Pinb-D1a,基因库DQ363913)。他们预计将蛋白质序列对应于野生型Pinb版本的蛋白质。

表1:Pina-D1 / Pinb-D1基因型小麦品种的调查。

然而,其他品种表现出比野生型等位基因核苷酸不匹配,具体来说,Colfiorito,遭到、阿德莱德和熊猫显示序列对应Pinb-D1b等位基因(G223A核苷酸变化,基因库DQ363914)和奥布松,博洛尼亚品种显示Pinb-D1d等位基因的存在(T217A、序列不沉积在基因库,)(图4)。

这些核苷酸变化诱发的aminoacidic改变蛋白质和所编码的预测,在细节,Pinb-D1b导致W73R和Pinb-D1d G75S氨基酸性变化(图5)。

Pinb-D1b等位基因扩增确认上执行SapI限制一点Pinb-D1扩增子。限制站点分析预测存在一个特定的站点被这种酶只在Pinb-D1b等位基因,在核苷酸多态性引起的223年和214年削减导致一个位置的扩增子。正如预期的那样,只有在Colfiorito,遭到、阿德莱德和熊猫Pinb-D1扩增子被消化和琼脂糖凝胶电泳显示两个片段的214个基点和233个基点(图6)。

蛋白质功能预测分析

蛋白质功能预测的影响发表wheat-related遗传多态性导致氨基酸性变化是评估使用PROVEAN软件,之后将核苷酸序列转换成相应的蛋白质序列。在这个分析中,所有已知Pina-D1和Pinb-D1基因变异决定一个氨基酸性改变小麦都包括在内。

生物信息学预测分析评估冰镇PINB氨基酸替换或indels是否影响蛋白质的生物功能。预测是基于变化引起的变异,在查询序列的相似性序列通过爆炸收集密切相关。预测结果可以确定5有害Pina-D1 (Pina-D1b、Pina-D1l Pina-D1m, Pina-D1n, Pina-D1p)和9有害Pinb-D1氨基酸性改变(Pinb-D1aa、Pinb-D1ab Pinb-D1c, Pinb-D1e, Pinb-D1g, Pinb-D1p, Pinb-D1r, Pinb-D1s, Pinb-D1u) (表2)。

表2:错义Pina-D1 / Pinb-D1小麦等位基因和编纂预测影响蛋白质功能(厦门市。=不可用)。分析了多个站点突变在同一多肽作为单独的突变。*与其他puroindoline野生型等位基因的基因如果不是另有规定。fs =转移。从最初的蛋氨酸Aminoacidic位置开始编号。

正如预期的那样,最有害的蛋白质改变导致Pina-D1b导致一个非常大的删除冰镇序列(只有第一个7个氨基酸是由删除基因)。相反,其他已知氨基酸性变化中发现我们的品种(Pinb-D1b和Pinb-D1d),如果导致蛋白质序列的变化(G75S和W73R),预计将有一个中立的表型效应。限制性内切酶预测允许确定一个独特的限制站点在Pinb-D1b变体,即。,SapI restriction site cutting at nucleotide position 214 of Pinb-D1b amplicon and resulting in a single cut in the amplicon and giving as results 214 bp and 233 bp long fragments.

讨论

Puroindolines角色在决定小麦谷物柔软近年来受到调查。差异的存在一个或两个puroindolines(或缺乏puroindoline蛋白质)导致表型,从软表型极其困难表型中遇到硬质小麦(18]。这个模型识别的软化效果puroindoline蛋白质。

今天,许多Pina-D1和Pinb-D1等位基因已确定在不同地理面包小麦品种来自世界各地。在小麦7中不同的冰镇等位基因和17个不同Pinb等位基因已被描述。(19]。最常见的冰镇等位基因导致困难的表型是冰镇的大删除包含大多数编码序列(删除23核苷酸从最初的ATG后开始,包括15380个基点),这就是冰镇。D1b等位基因,而最常见的是PinB-D1b遇到Pinb变体。在大多数地区,软质小麦品种与Pinb-D1b等位基因通常发现,虽然Pinb——D1p等位基因是普遍的在中国品种(4,20.]。Pina-D1序列点变化不太常见,但最新的三个SNP等位基因导致aminoacidic成熟的蛋白质序列的变化(Pina-D1m, n和q),一个SNP和单核苷酸缺失等位基因(确定前导肽的变化,造成移码的编码序列)(碧娜- D1p),一个单核苷酸缺失等位基因(Pina-D1l)和一个完整的基因缺失(Pina-D1k)描述了21]。

Pinb-D1序列变化更多,经常遇到比Pina-D1等位基因。在细节,8个snp等位基因导致前导肽的氨基酸性变化或成熟的蛋白质序列(Pinb-D1b、Pinb-D1c Pinb-D1d, Pinb-D1l, Pinb-D1q, Pinb-D1t, Pinb-D1v, Pinb-D1w), 4个snp等位基因导致成熟的无义突变蛋白序列(Pinb——D1e Pinb-D1f, Pinb-D1g, Pinb-D1ab), 5单核苷酸删除创建一个转移的蛋白序列(Pinb-D1p, Pinb——D1r Pinb-D1s, Pinb-D1u, Pinb-D1aa) (22]。

除了17描述序列变化,完成Pinb-D1删除被描述(23]。即使经常遇到的艰难的表型在t . aestivum品种是由在冰镇或Pinb序列改变,一些报道的当代删除两个基因被描述的19]。比较分析产生的表型表达当碧娜和Pinb突变提供了。“零等位基因”Pina-D1b负责更难比Pinb-D1b表型,据报道,在2005年和Pina-D1m Pinb-D1p诱导更难比Pina-D1b表型(零等位基因)突变12,13]。

此外,品种与Pina-null / Pinb-null等位基因显示最高硬度指数相比的不同组合Pina-D1 / Pinb-D1等位基因(24]。因此,内核结构之间的相关性和冰镇Pinb基因型可以为小麦质量的提高提供有用的信息,并扩展当前的理解分子和遗传机制决定小麦谷物纹理。Puroindoline基因表达和蛋白质定量分析表明,冰镇的存在直接影响小麦谷物硬度,而PINB影响相同的表型特征影响多肽三维稳定性及其关联极性脂质(25]。根据puroindoline的关键作用,冰镇转录和蛋白质合成已经发现高于Pinb在软质小麦14]。

对比数据出现Pina-D1或Pinb-D1基因的转录水平分析。他们并没有表现出软和Pina-D1a / Pinb-D1b硬小麦的差异在一些研究中,虽然Pina-D1a mRNA表达被发现为减少Pinb-D1b硬小麦相比,软Capparelli研究的。PINB蛋白质水平大幅减少在冰镇null (Pina-D1b / Pinb-D1a)硬小麦。然而,缺乏puroindoline(由两个完全没有puroindoline基因或Pina-D1b等位基因)就得以证实发挥关键作用的大幅减少puroindoline b的表达。虽然碧娜和PINB目前应该是小麦的主要分子参与谷物纹理的决心,其他因素可能复杂特征定义的角色。Gsp-1 Puroindoline b - 2基因,同样,也已确定在硬质小麦,暗示一个基因家族的存在——和/或B-genome,当前知识Puroindoline参与小麦质地测定提出了理解的基础这一重要表型性状的遗传因素,但新兴数据Puroindoline基因重复,puroindoline-related表达基因识别和调整控制表明,涉及更复杂的分子机制(26]。

意大利在地中海的国家中,有最长的传统在小麦育种和种质资源可以被认为是一个最富有、最有价值的。因为在意大利小麦种质收集从1947年开始,我们的调查,旨在找出小说puroindoline基因等位基因描述意大利小麦品种。第一次,我们发现三个硬质小麦品种空冰镇等位基因(完全没有放大Duilio和莱万特)。我们研究了零冰镇等位基因的存在品种缺乏冰镇放大。Pina-D1b等位基因扩增和随后的具体研究获得扩增子的序列分析允许冰镇无效等位基因的详细鉴定,提供确认缺少Pina-D1基因扩增是由于特定的等位基因的存在和没有其他基因删除包含Pina-D1基因。有趣的是,我们得到了,第一次从电晕不同的结果,这报道缺乏Pina-D1放大的瓜达卢佩品种,因此分配Pina-D1b等位基因。我们获得了放大Pina-D1a等位基因序列分析证实了品种。,当我们分析了特定Pina-D1b放大,获得预期的零等位基因的扩增子。我们可以假设这两个等位基因的存在在瓜达卢佩品种是由另一种形式的Pina-D1等位基因杂合性,从而影响谷物纹理(27]。

关于软质小麦品种我们确定了相对于野生型等位基因核苷酸不匹配,具体来说,Colfiorito,遭到、阿德莱德和熊猫显示序列对应Pinb-D1b等位基因导致W73R氨基酸性变化和奥布松和博洛尼亚品种显示Pinb-D1d等位基因的存在诱发G75S酸性氨基酸的变化。虽然基因序列分析代表基因分型结果最可靠的结果,简单和快速发展的分析来识别特定的冰镇或Pinb等位基因是必要遗传评估扩展到更大的样本和获取更多信息的遗传因素谷物纹理。我们评估的可能性Pinb-D1b等位基因识别通过特定的消化试验(SapI限制分析),因此我们进行了限制分析莱万特,阿德莱德和熊猫Pinb-D1b扩增子,他们包括限制性位点导致两个片段通过凝胶电泳可见。

报道,功能性质puroindolines驻留在它们的结构。最关键的地区丰富脂质绑定是色氨酸的循环区域(PINA-D1a主题WRWWKWWK;PINB-D1a主题WPTKWWK)。理解冰镇的功能效果和Pinb变异对小麦谷物纹理,我们进行了生物信息学分析28]。尽管大多数的预测显示puroindoline序列的有害影响改变在决定硬纹理表型,生物信息学预测,基于查询的比较序列与发表在国际相关序列数据库,无法识别变化影响功能aminoacidic地区,如色氨酸富领域puroindolines (TRD)。Pinb-D1b d预测是中性的,虽然他们都位于这个地区非常TRD旁边,可能影响合成多肽的功能(29日- - - - - -33]。

结论

总之,我们的研究孤立和特征在意大利小麦品种新等位基因的多态性。然而,生物之间的比较结果和数据从我们的研究强调需要在计算机预测功能的实验来验证。未来的研究是必要的澄清机制冰镇的角色/ Pinb变化对小麦谷物纹理。

确认

我们感谢CRA-SCS(意大利萨勒诺)和CRA-SCS(意大利维罗纳)提供小麦品种的种子。作者的贡献:快速公车提供构思和设计实验;快速公车提供,MB,调频,EB进行实验。快速公车提供和EB分析数据。快速公车提供和EB试剂/材料/分析工具。快速公车提供写的论文。

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