研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
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P - ISSN: 2347 - 2286
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1化学和生化工程系、化学与化学工程学院,厦门大学,厦门,361005年,中国
2厦门市的合成生物技术重点实验室,厦门大学,厦门361005年,中国
3化学与化学工程学院,厦门大学,厦门、福建,361005年,中国
5化学生物学重点实验室的福建,厦门大学,厦门、福建,361005年,中国
收到日期:19/07/2015接受日期:19/01/2016发表日期:29/01/2016
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目的:合成生物学领域的展示了其广阔的应用前景医学、化学合成和生产能量。方法:对大肠杆菌的特性刺激命名为化疗出租车已被广泛应用,如苏格兰皇家银行(RBS)的测量效率和启动子,自杀机制,振荡计时器等。结果:运动性的电路来控制大肠杆菌(运行或下跌),建立了圆锥曲线等形式的模式。启动子的强度和苏格兰皇家银行的效率是成功的特点是使用电路和化疗出租车,可以用来描述大多数推动者,苏格兰皇家银行效率,终结者效率和目标基因的表达强度等新的自杀机制,利用高渗的压力,建立了诱导大肠杆菌的生长模式模型是多细胞行为的根本力量协调细菌社区或一个大型复杂的系统。结论:压力的来源(如氯化钠和蔗糖)来生成高渗很便宜、方便、环保抗生素是昂贵的,因为耐药微生物对环境的不良影响。
趋化作用、抛物线和双曲线模式,启动子标准,黑洞,大肠杆菌,大肠出租车
显示合成生物学领域的广阔的应用前景制药、化学合成和能源生产。他们的应用程序允许的多样性转录监管机制的探索,甚至可控提供治疗的发展工程菌(1- - - - - -4]。的运动大肠杆菌可以应对刺激遵循法律。因此,精确控制可以实现,如果我们发现运动的数学原理。化疗出租车建筑更深入地理解细胞分化[5]。细胞分化,形成不规则的几何器官的早期阶段。这仍然是一个秘密,他们是如何做到这一点。
设计网络的主机和拷贝数之间的比例质粒构建网络是两个主要因素影响同步振荡的表达。细菌化疗出租车(6,7),这是普遍的大肠杆菌,被定义为移民的细菌在回应一个化学刺激。自然大肠杆菌化疗出租车受体蛋白有限,只能对六种氨基酸。然而,重组化疗出租车叫伪出租车使工程大肠杆菌能够响应分子的受体蛋白不存在经典大肠杆菌,如IPTG和L-arabinose等等。
大肠杆菌通常每个细胞有几个鞭毛(十),可在两个方面:旋转顺时针逆时针(公约)和(CW) [8]。前鞭毛对齐到一个旋转包,导致细菌游泳,虽然后来摧毁鞭毛包分开,这样每个鞭毛点方向不同,细菌大跌的原因。能动性是决定的磷酸化的崔氏由大驾光临。的大驾光临,CheY-P脱去磷酸生产崔氏,因此崔氏导致鞭毛马达旋转CCW导致游泳。在缺乏大驾光临,崔氏磷酸化成CheY-P绑定到鞭毛可以开关电影导致暴跌(8- - - - - -10]。因此,如果不表示(如大驾光临大肠杆菌CL-1没有在基因),无法脱去磷酸CheY-P鞭毛保持连续波,因此大肠杆菌持续下滑和半固态培养基上执行non-motile能力。有足够的大驾光临表示,大肠杆菌恢复化疗出租车在半固态培养基的能力。如果一种分子(如IPTG)可能会刺激电路来表达大驾光临,重新编程大肠杆菌会倾向于迁移到它。我们叫出租车的重组化疗伪出租车。因此,我们能够重组细菌化疗出租车通过在基因的野生型基因控制的表达在基因电路的逻辑操作的运动细胞,让他们形成圆锥曲线等模式。
圆锥曲线普遍存在于自然和科学研究意义重大,生产和生活。例如,许多行星的轨道是椭圆和抛物柱面天线被广泛用于电信(11]。因此,我们可以模仿细胞菌落天体的轨道,或形成圆锥曲线的精确的数学规律,在实践中应用它们。此外,寡核苷酸适配子有可能应对几乎所有种类的分子,已经被用来调节基因的表达在等重组化疗出租车(12]。在这个工作中,描述我们构建的电路,和数学建模与实验相结合。这是证明了能动的能力与表达在强度呈正相关,因此,活动发起人和苏格兰皇家银行的效率可以为特征。与此同时,一个生物安全系统依赖于重组化疗出租车。
数学是最简单、最明了的语言,其价值为人类文明的发展是现在被广泛认可,因为它广泛应用在科学、甚至社会和我们的日常生活中。然而,生命科学的数学法则仍不清楚,甚至在混乱13,14]。幸运的是,合成生物学一定可以克服这些缺点。在此基础上,我们设计一个基因电路,希望数学规律可以实现生命活动的调节和控制。我们希望我们的工作能激发人们的兴趣与合成生物学结合数学。
formation-Parabola圆锥曲线和双曲线
数学定义:在数学中,双曲线可以定义为一个圆锥那些距离的点组成的一个焦点,和一个准线,在一个固定的比率(> 1),称为偏心(e)抛物线。圆锥的偏心度等于1。
假设:焦点,常数k和偏心率e是圆锥曲线的关键因素。因此,我们可以很容易地得到任何eclipse通过预设定合理的焦点一个可接受的常数,以及抛物线和双曲线的固定比例。在此基础上,我们需要把这些数学概念和模式形成系统。如果我们在半固态板点刺激,它就会从发现中心向外围扩散。在传播过程中,浓度是负相关的距离中心。如果我们画一条线与刺激,与正方形将形成浓度梯度。和两个浓度梯度将维持很长一段。一般来说,刺激点被定义为被定义为准线的集中而行。
有一个阈值的比率的诱导物浓度和抑制因子(15]。这意味着更多的镇压者将导致更多的压迫,因此需要更多的诱导物来缓解压抑,反之亦然。诱导物的浓度和抑制因子直接连接到集中的刺激来源,我们可以告诉常数k和离心率e结合距离和浓度之间的关系。
电路设计:电路由两部分组成,其中1名为C(约束),另一个是名为M(运动型)(图1)。电路转换成大肠杆菌CL-1缺乏基因lacI和在(ΔlacIΔcheZ)。没有在,CL-1采用non-motile表型。没有任何外源刺激,大肠杆菌会产生背景的AraC压制pBAD限制程度。这意味着即使noL-arabinose参与,发起人pBAD泄漏表达,所以这部分C将产生阻遏LacI可以绑定到子温馨的操纵子,从而抑制其转录。因为L-arabinose可以诱发pBAD,在一定浓度范围内,L-arabinose参与越多,越阻遏LacI部分C可以生产产生的抑制趋化性。因为它限制趋化作用的能力,这部分被命名为C。
图1所示。部分C产生LacI镇压M M可以产生部分的表达在CL-1恢复能动的能力。
IPTG参与时,它可以从阻遏LacI减轻压抑,因此在使我们的工程(CL-1)恢复细菌产生能动的能力。这意味着某些特定L-arabinose浓度范围内约束条件、IPTG参与越多,越在产生能动的能力更强。因为它的能力CL-1能动的,这部分被命名为M。
材料与方法:介质:M63半固态介质制备(16)(注:0.25 g琼脂添加到一个锥形烧瓶第一,然后倒入96毫升H2O,摇晃起来,继续添加甘油使用吸管。低浓缩铀,遇见他,为方便刺可以预先混合,应该添加氨基酸通过注射器0.22μm过滤膜。注意,这个过程必须进行高温杀菌后M63半固态介质)。
Mix-doting细菌,电感器和抑制剂M63半固态介质板:(我)倒20毫升M63 [8)半固态介质板,离开板风干90分钟的层流洁净工作台;(2)点15μl电感(IPTG)或抑制剂(L-Arabinose)板通过吸管,照顾当尖端插入介质。离开20分钟的板脱水层流洁净工作台;(3)点3μl培养基在同一位置的电感器(IPTG)或抑制剂(L-Arabinose),离开5分钟的板脱水层流洁净工作台;(iv)密封板。
电感的线理和抑制剂M63半固态介质板
(1)倒20毫升M63半固态介质板,离开板风干90分钟的层流洁净工作台;(2)吸入15μl电感(IPTG)或抑制剂(L-Arabinose),溺爱的沿线pre-pianted小心,记住不要破坏半固态介质时阿龙g线;(3)离开板风干90分钟的层流洁净工作台;(4)mix-doting重复的过程细菌、电感和抑制剂M63半固态介质板。
描述的活动发起人和苏格兰皇家银行通过趋化作用的效率
方法:所有三个殖民地不同启动子被刺伤在同一个半固态培养基L-arabione 0.02%和50μg /毫升氯霉素在补充道。培养了36小时之后,每个殖民地之间趋药性的直径差可能是杰出的。
应变文化:(1)添加50μl细菌的解决方案(pLac-RBS (1.0) -CheZ-TT, pLac-RBS (0.3) -CheZ-TT, pLac-RBS -CheZ-TT(0.01))为5毫升新鲜LB液体介质,氯霉素的浓度是50μg /毫升;(2)在一夜之间文化条件下的37°C, 200转;(3)添加50μl细菌溶液从上面的LB液体介质到另一个5毫升新鲜LB液体介质,氯霉素的浓度是50μg /毫升;(4)文化条件下37°C, 200 rpm为3小时。股票在4°C;(5)准备M63半固态介质之上;(6)画上的三个点M63半固态介质板第一,和接种三种细菌的解决方案在三个点,分别。接种细菌溶液的体积是3μl;(7)文化孵化器在37°C。
测量:(我)使用尺子测量半径的殖民地从半固态介质板的底部。初始半径是记录为R1殖民地,半径测量在12 h, 24 h, 30 h, 36 h, h 42…R2、R3、R4、R5 R6, R7 et al。(2)表中的记录时间和直径;(3)与excel处理数据。
黑洞
电路设计:大肠杆菌利用EnvZ / OmpR系统协调信号转导在应对环境渗透性的变化。组氨酸激酶和响应监管EnvZ高能磷酰基集团经历了trans-autophosphorylation随后被转移到OmpR。在我们的系统中,OmpR-controlled启动子(pOmpR)参与(图2)。pOmpR的表达强度取决于介质的渗透性。EnvZ将使磷酸化更多OmpR磷酸化OmpR (OmpR-P),而介质渗透性增加,导致强pOmpR表达内涵。在电路设计中,在上游受pOmpR (图2)。
图2。osmotic-taxis设计的示意图。
建设大肠杆菌应变CL-1:新的基因电路,PompC-cheZ pSB1C3被引入大肠杆菌应变CL-1的基因在被淘汰出局。
梯度平板实验(半固态介质,50厘米μg /毫升)
介质:介质(17),与修改(酵母提取物0.26%;蛋白胨0.27%;K2HPO40.37%;KH2阿宝40.13%;氯化钠0.05%;甘油0.2% g / ml)。蔗糖浓度梯度:0 ~ 20%,浓度梯度是2%。
Mid-log-phase细胞悬浮液制备
(i)在一夜之间文化所需的应变增长37°C中包含适当的氯霉素(改善);(2)稀释隔夜文化在新的文化1:10 0的比例(媒介),然后孵化的文化条件下37°C, 200 rpm,直到其OD590达到0.2;(3)股票在4°C。的方法制备梯度半固态介质(0.25%琼脂)显示在S2-1支持方法。离开板孵化在37°C。期间,测量直径的殖民地和取下来。
板交叉实验(半固态介质,50厘米μg /毫升):介质:一半介质(改善)。蔗糖的浓度:0%、10%。
的方法制备的液体培养基中含有不同浓度的蔗糖
(我)准备中相应成分的数量表1以上;(2)添加相应数量的固体蔗糖进入液体介质;(3)等灭菌。
Mid-log-phase细胞悬浮液制备
(i)在一夜之间文化所需的应变增长37°C中包含适当的氯霉素(改善);(2)稀释隔夜文化在新的文化1:10 0的比例(一半介质),然后孵化的文化条件下37°C, 200 rpm,直到其OD590达到0.2;(3)股票在4°C。的方法制备半固态介质与交叉(0.25%琼脂)s2 2显示支持方法。离开板孵化在37°C。在一段时间,拍照的殖民地。
抛物线和双曲线形式模式
电路的特性:电路设计、建造和特征大肠杆菌CL-1。CL-1缺乏lacI基因、启动子温馨的阻遏lacI不会压抑的背景。我们应用梯度测试,找出影响将在重组趋化作用以下参数:IPTG和氯霉素的浓度L-arabinose。
描述的中枢效应:首先,最好的氯霉素浓度进行了测试。氯霉素在半固态培养基的浓度梯度是S1图所示S1。这是表明,趋化性的活动没有明显的线性关系氯霉素。有趣的是,50μg /毫升的氯霉素CL-1最好的趋化作用。这是应用于以下特征。
表征IPTG效应:作为发起人pBAD导致一定程度的表达式LacI泄漏,CL-1最糟糕的趋化作用没有任何刺激。我们添加了IPTG浓度梯度和得到结果(图3)。发现趋化性的活动不断增加,当IPTG浓度的增加从0.02 0μMμM并获得最佳性能和IPTGμMμM范围从0.02到0.025。我们应用0.025μM IPTG下面描述。
图3。曲线趋药性的直径随时间在IPTG浓度梯度。
IPTG趋势的描述:为了进一步描述IPTG的效果,我们发现IPTG和细菌的图显示(S1图S2)。IPTG浓度的不断减少,因为它传播出去。我们发现IPTG浓度略高于最优。是观察重组细菌游IPTG源似乎细菌被IPTG吸引。
表征L-arabinose效应:随着更多L-arabinose补充说,启动子的表达pBAD变得更强,从而导致更多的LacI生产,导致抑制趋化性。作为我们的期望,趋化性的活动保持向下L-arabinose浓度的增加(图4)。证明0.2% L-arabinose的抑制作用最好的趋化性0.025μM IPTG补充道。
图4。直径L-arabinose梯度浓度下曲线的趋化作用。
抛物线和双曲线:最优IPTG浓度和L-arabinose诱导和阻遏,通过初步实验测定。因为刺激的浓度会降低在蔓延,所以他们的效果,我们用IPTG浓度和L-arabinose稍微高于我们的实验的最优值。一条直线与L-arabinose被拍到在半固体培养基,并和IPTG的混合CL-1一边。在现场周围地区,IPTG诱导比L-arabinose的镇压,在表达和细菌采用能动的表型。然而,当他们接近直线的抑制因子活性,有更大的影响,他们将失去了能动的表现型和停止。
根据假设,在阈值比诱导物的浓度和抑制因子,其影响抵消,形成关键线路。关键线路上的点的距离IPTG现货(焦点)和L-arabinose线(准线)是在一个固定的比率(偏心)。如果比率等于1,关键行是一个抛物线。如果比率大于1,它是一个双曲线的一个分支。然后我们进行实验来验证机制(图5 b)。殖民地的左边界被认为是关键。我们发现细胞倾向于远离L-arabinose游泳行这是一个预期性能的细菌。
图5。关键线路模型的示意图为抛物线和双曲线和B显示了一个实际的实验结果。
其他函数曲线——quasi-hyperbola:探索后,不同的方式安排细菌和刺激在半固体培养基也试过。和一些有趣的结果。我们在半固态培养基上画两个点,一个L-arabinose图S3A (S1)和其他CL-1和IPTG。同样,在阈值比诱导物的浓度和抑制因子,其影响抵消,形成关键线路。距离的点右边的殖民地的边界点A和B点是在一个非常狭窄的比例(图S3B S1)。实际上,作为关键的线是安静的类似于双曲线,我们quasi-hyperbola名字它。
其他有趣的方式发现细菌和刺激正在等待被发现,和想法可以扩展到其他函数曲线和模式。两种刺激构建一个平方了(图6)。两边铺了一种刺激形成薄的路径。编程的细胞被发现的中心广场上,我们有两个椭圆形环培养24小时后图6 b)。这是证明细胞环被IPTG双方同时挤压拉伸L-arabinose两侧。分析的过程和结果在模拟的数学模型。
图6 a。发现细胞在半固态培养基上两个IPTG线和两个L-arabinose线和6 b放大图片,左边两个椭圆形环可以观察到在媒介。
在现场周围地区,IPTG诱导比L-arabinose的镇压,在表达和细菌采用能动的表型。然而,当他们接近直线的抑制因子活性,有更大的影响,他们将失去了能动的表现型和停止。的阈值比诱导物的浓度和抑制因子,其影响抵消,形成关键线路。关键线路上的点的距离IPTG现货(焦点)和L-arabinose线(准线)是在一个固定的比率(偏心)。如果比率等于1,关键行是一个抛物线。如果比率大于1,它是一个双曲线的一个分支。(离心率e等于PF / PB。如果e = 1,我们定义的关键线路为抛物线。如果e > 1,我们定义的一个分支双曲线)。预计殖民地的左边界的关键。
启动子的标准
荧光测量的限制:一般来说,的效率荧光强度是用来检查启动子和苏格兰皇家银行,其中,主要由测量装置(18]。同时,测量数据的精度和准确度的仪器。没有相关仪器,研究人员不能做interlab研究等研究。更重要的是,如果我们需要测量荧光强度在连续时间,它要求连续采样产生的累积误差。
趋化作用可以做更多:是证明在的表达强度与能动的能力正相关,一个新系统与不同的启动子和苏格兰皇家银行效率是由趋化性。variable-controlling方法采用比较趋化现象的直径展出作为殖民地的大小标准组件和未知组件之间通过测量菌落直径。我们唯一需要的是一个统治者的设备。
为了演示新系统的可靠性,三个设备不同的启动子的特点是凯利,j . r .等人建立了[19]。所有三个殖民地不同启动子刺在相同的半固体培养基,其中L-arabione浓度0.02%和氯霉素浓度是50μg /毫升(图7)。培养36小时后,差异各殖民地之间的趋化现象的直径可以(图7 b)。
图7。发现细菌的示意图和B与0.02 L-arabione培养48小时内,每个殖民地之间区分不同的趋化作用直径。
实际上,测量三个殖民地加速直径在不同时间和启动虫胶设置与启动子Lac菌落直径1.0 (S1图S4)。36小时后,确定每一个菌落直径之间的比率。如果固定比率是我们设置的相关推广活动,根据我们的描述,启动子TetR (BBa_R0040)活动1.86高于发起人Lac (BBa_R0010)。在前面的工作[19],启动子活性pTetR和温馨的已经确定,和比率(pTetR /温馨的)是1.58。系统可以区分不同的启动子活动,它是可靠的和可用的。pBAD的相对活动的特征是进行0.02%的诱导物L-arabinose文化。和比率(pBAD /温馨的)是0.37。对我们来说有重要的参考价值选择一个不同的启动子和苏格兰皇家银行的数据告诉我们关于相对pBAD的推广活动(BBa_K206000),而pBAD (BBa_K206000)可以诱导L-arabinose(启动子活性表征)。
广泛应用:是证明在的表达强度与能动的能力正相关,一个新系统与不同的启动子和苏格兰皇家银行效率是由趋化性。作为结论,结果表明,新系统的工作原理和小错误,被吸引。和这种方法来确定大部分的发起人可以标准化。更重要的是,这将是美妙的,因为它可以用来确定苏格兰皇家银行效率(图8),《终结者》效率(图8 b)和目标基因的表达强度等(图8 c)。
图8。设备的效率不同的苏格兰皇家银行(A)和《终结者》(B),和设备描述目标基因的表达(C)。
黑色hole-suicide趋化性:在中国几千年前,人们开始保存食品通过固化,在公元540年左右的记录在《齐民要术》的书。治疗各种各样的食物,如肉、鱼和蔬菜保存和风味的过程,通过添加盐、硝酸盐、亚硝酸盐、糖和它是最古老的保存食物的方法(20.,21]。食盐的主要成分用于治疗食物。消除水和盐添加到肉类创造渗透soluterich环境吸引水微生物,经济增长放缓。这样做需要将近20%的盐浓度。已经证明,5%的氯化钠浓度会抑制增长大肠杆菌(22]。然而,利用高渗的压力大肠杆菌还没有完全在合成生物学研究。在这项工作中,我们将努力在这个主题,开发出一种系统,将有助于生物安全。
描述的电路
梯度平板实验:半固态介质文化与梯度浓度的蔗糖被用来描述设备(BBa_K1412010)。这是假定与动态能力和运动的半径成正比。在图(图9),没有添加蔗糖时,能动的能力是最弱的。能动的能力可持续增长随着蔗糖浓度的增加从0到4%。然后温和能动的能力下降,蔗糖浓度从4%上升到10%,但能力仍然比能力更强,浓度0。一个结论,我们的设备是期望可以得出,动态能力下降(4%到10%),因为高渗的抑制压力。
图9。感人的情节半径和蔗糖浓度。
板交叉实验:直立线与10%蔗糖水和一条水平线,并发现了细菌在十字架上(图10)。培养48小时,发现重新编程大肠杆菌高浓度的好方向线。事实证明,CL-1趋势游泳高渗透压高浓度蔗糖创建超级高渗透。
图10。画水平线与10%蔗糖和直立行水。
协调模式形成的根本重要性的多细胞行为在一个社区或一个大型复杂的系统。在物理和工程,精确控制部分的大小和验证,验证和预测能力的工程系统的性能奠定重要的理论基础在实际工程中的应用(23]。在生物学中,广泛的细胞内和细胞间耦合机制导致的形成模式,管理基本的生理过程,如胚胎发生、肿瘤发生和血管生成24- - - - - -26]。同时,工程师可以形成空间模式合成系统,同时为组织工程生物材料的能力是一个关键的一步,有针对性的治疗和制造(27,28]。虽然组件作为系统数量的增加,越来越多的难以协调的输入和输出组件,和他们的总体影响生产预期的价值,绝对限制基因疗法的应用,组织工程和生物材料的制造。
在此基础上形成的动机和我们的实验结果quasi-hyperbola在目前的阶段,我们要进行,调整实验根据更精确的建模,期望更高精度的实验。建模,由于非线性和特性转化产生自然,非线性动力学和统计物理学领域的工具是非常有用的一代的设计规范和仔细的对比实验和计算模型(12]。实验和理论分析表明,最重要的动力学参数随着时间的推移影响圈发展。建设和研究多细胞的合成系统,可以提高我们的发展自然形成定量的理解。那么它将引导我们更好地理解和解释自然。基于更精确的实验和建模,将考虑增加细胞之间的通信,引入群体感应为了建造更多的复杂的数学形状,发挥环境刺激。这样的系统级生物工程可以实现协同目标多个通路,症状或目标,如多个细胞群或器官创造潜在的创新环境和治疗应用29日]。
开发一个新的自杀机制,利用高渗的压力大肠杆菌根据描述,我们发现高渗的压力点和重组CL-1在半固态介质文化如图S5所示图S5 (S1)。浓度与距离的增加会降低高渗的压力点。渗透压介质浓度成正比,重组的移动趋势CL-1将东方高渗的压力点。甚至抑制渗透压,能动的能力仍然是比没有任何诱导物的运动。以便重新编程CL-1甚至游向high-osmotic网站而死。自杀机制就像黑洞。当细菌进入“视界”,渗透压达到临界值命名渗透压,细菌不能出去的边界,最后被杀。
来源(如氯化钠和蔗糖)来生成高渗的压力很便宜,访问和环保,而抗生素是昂贵的和对环境有坏的影响因为耐药微生物学。如果我们的黑洞系统可以充分发展,将减少壁垒微生物学研究尤其是对发展中国家的科学家们。
总之,电路控制的能动性大肠杆菌(运行或下跌)形式建立了圆锥曲线等模式。苏格兰皇家银行(RBS)的启动子的活性和效率被趋化性和电路特点。这个方法可以用来描述大多数推动者,苏格兰皇家银行效率,终结者效率和目标基因的表达强度等新的自杀机制,利用高渗的压力杀死大肠杆菌。协调模式形成的根本重要性的多细胞行为在一个社区或一个大型复杂的系统。廉价的来源(如氯化钠和蔗糖)来生成高渗的压力很便宜,访问和环保,而抗生素是昂贵的和对环境有坏的影响因为耐药微生物学。
作者认为他们没有利益冲突。
j•设计并进行实验,写的手稿;c . T。,J. L. C., Y. Y. L., Y. H. C., T. D. Z., R. H. Z., Z. H. C., J.X. H. performed the experiments; B.S.F. supervised the work; and all authors contributed to the discussion of the research.
我们感谢Sourjik教授和帕金森给了我们许多宝贵的建议。这项工作是国家重点支持的中国国家自然科学基金项目(21336009),国家自然科学基金(No.21076172 No.41176111)。
