利用微卫星标记研究波黑Borike种阿拉伯马的遗传多样性

摘要

本研究首次对来自波黑种马“Borike”的阿拉伯马进行遗传多样性评价。从20匹阿拉伯马的全血中提取基因组DNA。PCR扩增出17个微卫星位点。每个基因座的平均等位基因数为4.29个，从3个(HMS7、AHT5、HMS3、HMS1和CA425)到8个(HTG6)不等。观测杂合度范围为0.4 (HMS1) ~ 0.8 (ASB23, HTG7)，平均为0.6291;预期杂合度范围为0.5088 (HMS1) ~ 0.7938 (HTG6)，平均为0.6529。PIC值波动范围为0.4023 (HMS1)至0.7643 (HTG6)，平均值为0.5901。近交系数为-0.0082 (CA425) ~ 0.4213 (HTG10)，平均为0.0621。5个位点(HTG6、HTG10、HTG7、ASB17和LEX3)偏离Hardy-Weinberg平衡(p<0,05)。HTG6位点的遗传多样性最高，HMS1位点的遗传多样性最低。结果表明，从种马“Borike”中提取的阿拉伯马遗传多样性的重大损失并没有影响到该群体，表明来自波斯尼亚和黑塞哥维那的阿拉伯马属于现代阿拉伯马群体。

关键字

阿拉伯马品种，群体结构，遗传标记

简介

阿拉伯马是世界上最古老、最具影响力的马品种之一，分布在世界各地。它还涉及到许多其他马品种的遗传构造，如纯种马和利比扎马[1，2］．阿拉伯马也参与了波斯尼亚和黑塞哥维那山地马的形成[3.］．历史记录表明，阿拉伯马在奥斯曼帝国时代被引入波斯尼亚和黑塞哥维那(B&H)。种马“Borike”成立于1895年，从那时起阿拉伯马就在B&H繁殖和生长。如今，来自B&H的阿拉伯马种群很好地适应了该地区的生态和地理条件[3.］．

短串联重复序列(STR或微卫星)位点多态性的发现和聚合酶链式反应(PCR)方法的引入，为人类和动物的个体识别和亲子控制建立了极其强大的“通用”方法[4］．微卫星是高度多态的遗传标记，具有显性遗传等位基因，相对容易得分。微卫星是两到七个核苷酸单位的重复区域，主要出现在DNA的非编码区域[2］．微卫星已被用于构建连锁图，检查群体遗传结构，遗传变异，分子进化研究，基因流研究，法医科学，并作为亲子鉴定标记[2，5］．

利用微卫星研究了阿拉伯马的遗传多样性，包括阿尔及利亚阿拉伯马[6]，西班牙阿拉伯马[7]，来自Charmahal-va-bakhtiari省的阿拉伯马[4]，罗马尼亚阿拉伯马[8]，波兰阿拉伯马[9]、叙利亚阿拉伯马[1]、中东阿拉伯和西方阿拉伯的马种群[10]，伊朗阿拉伯马[2]和欧洲盎格鲁-阿拉伯马[5］．

然而，利用微卫星对来自B&H的阿拉伯马的遗传多样性进行研究还没有。本文利用国际动物遗传学会(ISAG)推荐的17个微卫星标记，首次对B&H阿拉伯马群体的遗传多样性进行了分析。

材料与方法

样本包括20匹阿拉伯马，饲养在种马“Borike”，B&H。从全血中提取DNA进行基因分型分析。使用无菌针头和EDTA真空容器，从v。jugularis每一种动物。基因组DNA分离的盐析法，最初是为人类血液而开发的[11]，针对马血和我们的实验室条件进行了修改和调整(3毫升血液;裂解液10 ml;4毫升PBS;Kern-lysis buffer 4 ml;150 μl 20% SDS;Qiagen蛋白酶100 μl和0.5 ml 6 M NaCl);采用分光光度法测定DNA提取物的浓度，使用紫外mini -1240分光光度计(日本岛津公司)．核DNA多态性采用改良StockMarks进行评价^®马基因分型试剂盒(应用生物系统公司)设计用于同时扩增17个马微卫星位点。利用ABI Prism分析了放大后微卫星碎片的大小^TM基因分析仪。使用GeneMapper ID v3.2软件测定扩增片段的大小。等位基因大小范围，主等位基因频率(f_米)，不同等位基因的数目(A_N)、多态资讯含量[12]，观察杂合度(H_O)，期望杂合度(H_E) [13]，近交系数(f) [14]和偏离Hardy-Weinberg平衡(HWE) [15]使用POWERMARKER 3.25计算[16］．有效等位基因数估计为1/Σpi²，其中p为给定位点的等位基因频率。有效等位基因数与被检测等位基因数的简单比值(A_E/一个_N)和主等位基因频率指数(If_米)的计算方法与Pojskic [17］．比值表示有效等位基因数与直接计数检测到的等位基因数之间可能存在不比例。主等位基因频率指数表示较大的频率比预期的频率大多少，假设在给定位点上所有检测到的等位基因频率相等。它表示为f_米/ (1 /_N);f_米为主等位基因频率，A_N是在给定位点上检测到的等位基因的数量。不同基因型(G_N)，因为最大可能的基因型数(G_E)计算为k(k+1)/2，其中k为给定位点上检测到的等位基因数。此外，检测到的基因型数量与最大可能的基因型数量之间的比率(G_N/ G_E)。

结果

利用17个微卫星位点对阿拉伯马的遗传多样性进行了首次评价。本研究中报道的所有基因座都被成功扩增。结果为等位基因大小范围，主要等位基因频率(f_米)，主等位基因频率指数(If_米)，不同基因型数(G_N)，最大可能的基因型数(G_E),克_N/ G_E比例，检测到的等位基因数量(A_N)，有效等位基因数(A_E),一个_E/一个_N期望杂合度(H_E)，观察杂合度(H_O)、多态信息含量(PIC)、近交系数(f)和Hardy-Weinberg平衡偏差(HWE)见表1。所有位点共检测到73个等位基因。各位点等位基因大小在79 ~ 251bp之间。PCR产物大小从HTG6位点的79-97 bp到ASB2位点的237-251 bp不等。每个位点的等位基因数从3个(HMS7、AHT5、HMS3、HMS1和CA425)到8个(HTG6)不等，平均为4.29。ASB23的有效等位基因数与检测等位基因数之比最高(0.9804)，说明在某一位点上检测到的所有等位基因都是有效的。HMS2位点的有效度最低(0.5128)，只有一半的等位基因有效。该比值的平均值为0.6709。主等位基因频率指数以HMS2最大(2.7500)，但差异无统计学意义(P>0.05)。ASB23位点最低，为1.2000，差异无统计学意义(P>0.05) (表1)。该参数均值为1.9162。HTG6位点检测到的基因型数量最多(12)，HMS1位点检测到的基因型数量最少(4)。所有位点检测到的基因型平均数量为7.12 (表1)．HTG6位点检测到的基因型数与最大可能基因型数不一致(0.3333)。另一方面，ASB23位点检测到的等位基因数达到可能基因型的最大数目(GN/GE=1.0000)。观测杂合度范围为0.4 (HMS1) ~ 0.8 (ASB23, HTG7)，平均为0.6291;预期杂合度范围为0.5088 (HMS1) ~ 0.7938 (HTG6)，平均为0.6529。

AHT4、HMS7、AHT5、ASB23、ASB2、HTG7、HMS3、HMS2位点观察到的杂合度高于预期值。PIC值波动范围为0.4023 (HMS1)至0.7643 (HTG6)，平均值为0.5901。近交系数为- 0.0082 (CA425) ~ 0.4213 (HTG10)，平均为0.0621。HTG6、HTG10、HTG7、ASB17和LEX3 5个位点偏离Hardy-Weinberg平衡有统计学意义(P<0.05)。(表1)．

讨论

本文阐述了阿拉伯马居群遗传多样性的首次资料。Stock Marks Kit用于分析的所有位点均为二核苷酸重复序列。等位基因在单个位点上的大小在74 ~ 268bp [18］．我们的结果等位基因的大小范围在前面描述的范围内。我们观察到一个等位基因与预期大小范围(VHL20, HTG7和HMS1)重叠，并落在其预期大小范围(ASB17)之外。

在我们的研究中，每个位点检测到的有效等位基因的平均数量与Khanshour等人相似。[10[西方阿拉伯马种群的差异(2.12-3.41)，但低于中东阿拉伯马种群的差异(3.30-4.23)]10］．在我们的研究中，在单个位点上观察到的等位基因数量是高度可变的。叙利亚阿拉伯马的等位基因数量也有相同程度的变异(3到8)[1]和欧洲盎格鲁-阿拉伯马[15］．此外，Charmahal-va-bakhtiari省的阿拉伯马也有类似的变异范围(3 ~ 9)[4]和伊朗阿拉伯马[2］．本研究建立的每个位点检测到的等位基因的平均数量与Glovatzki-Mulls等人的结果相似。[19]其中阿拉伯马种群的等位基因平均数量为4.8，与Khanshour等人相当。[20.-24西部阿拉伯马种群(3.0-5.67)研究和Tozaki等人[5阿拉伯马种群研究(4.5)。另一方面，在Juras等人。20.在阿拉伯马遗传多样性研究中，平均等位基因数(2.132)远低于我们检测到的等位基因数。总体而言，我们的研究中等位基因的平均数量低于先前关于阿拉伯马的研究(5.13-8.47)[1，4，6，8，10，21-26］．一般来说，品种间的差异和平均等位基因数的差异可能取决于分析等位基因的数量、样本数量、所选微卫星标记的设置以及群体结构。

我们的平均HO结果与Conant等人先前报道的阿拉伯马的结果相似。[21] (0.64)， Glovatzki- Mulls et al. [19] (0.61)， Iwanczyk等。[23] (0.645)， Khanshour等。[10] (0.40-0.69)， Luis et al. [24] (0.624)， van de Goor等。[25](0.645)和Vega-Pla等。[26(0.6353)。Juras等人[20.]报告阿拉伯马的HO值较低(0.307)。本研究的HO平均值低于其他阿拉伯马种群研究报告的HO平均值(0.68-0.72)[1，4，6，8，10，22］．阿拉伯马杂合子的缺乏先前由Di Stasio等人描述。[22］．根据Khanshour和Cothran [27]现代阿拉伯马种群中每个位点的等位基因数在2.8 ~ 5.6之间，而老年种群为5.1 ~ 8.5。在现代阿拉伯马种群中，HO值在0.39 ~ 0.67之间变化，而在老种群中，HO值在0.68 ~ 0.072之间变化。现代人口普遍表现出较低的多样性。等位基因数和杂合度数据表明，来自B&H的阿拉伯马群体属于现代阿拉伯马群体。本研究中发现的HE值与Georgescu [8] (0.665)， Glovatzki-Mulls等。[19] (0.63)， Iwanczyk等。[23](0.646)和Khanshour等。[10(0.46 - -0.69)。Juras等报道了较低的HE值(0.327)[20.］．其他阿拉伯马种群的HE平均值大多在0.6725至0.772之间[1，4，6，10，21，22，24-26］．将我们的平均等位基因数、平均有效等位基因数、平均HO和HE值与Khanshour等人的结果进行比较。[10]的结果，我们可以假设来自B&H的阿拉伯马种群属于西阿拉伯马种群。这些结果支持了我们的结论，即来自B&H的阿拉伯马属于现代阿拉伯马。AHT4、AHT5、HMS7、ASB23、HTG7、HMS3和CA425位点的杂合度高于预期值，而其余位点的杂合度高于预期值。观察到的杂合度低于预期。在研究人群中，HO和HE的平均值相似。这些结果可能表明动物之间存在足够的异质性。大多数研究表明阿拉伯马种群的低变异性[22，28，29］．在我们的研究中，HO和HE之间最大的差异是HTG10位点。同一位点的近交系数最高，与HWE偏差最大，杂合子缺陷严重。根据Galov等人。[30.与HWE高度显著的偏差结合大量杂合子缺陷可能表明由于零等位基因导致的位点特异性基因分型问题。

在群体遗传分析中，PIC值高于0.5的遗传标记通常被认为是信息丰富的[31］．在我们的研究中建立的平均PIC为0.5901，尽管在HMS7、HTG7、HMS3和HMS1四个位点上的个体PIC值低于0.5。至少应使用10个微卫星位点，以最大限度地排除马匹[1］．在我们的工作中观察到的PIC值表明，76.47%的标记(13个微卫星位点)就其适合遗传多样性研究而言具有相当大的信息量，而其余的位点则具有相当大的信息量。在我们的研究中，HMS1位点的遗传多样性最低。然而，该位点与LEX3位点都不在粮农组织推荐的多样性研究标记之列[25］．在我们的工作中发现近亲繁殖系数增加。西班牙阿拉伯马种群也报告了同样的指标[7]和波兰阿拉伯马种群[9］．可能的原因是近亲交配。由于缺失等位基因，HTG10位点的价值可能受到位点特异性基因分型问题的影响。

本研究结果表明，来自种马“Borike”的阿拉伯马群体没有受到遗传多样性的重大损失的影响，表明来自B&H的阿拉伯马群体属于现代阿拉伯马群体。综合所有观察参数，可以得出在B&H阿拉伯马群体中，HTG6位点遗传多样性最高，HMS1位点遗传多样性最低。但是，假设HO、HE和PIC值在0.6左右，我们认为HTG6、ASB23、ASB2和ASB17位点多态性最强。近交系数的增加和动物间足够的异质性表明近亲交配的发生。本研究有助于了解被调查群体的群体结构和遗传多样性现状。同时，这些结果也可以帮助马育种者在设计育种策略时为品种管理提供建议。

参考文献

1. Khanshour AM，等。叙利亚阿拉伯马品种亲子鉴定的微卫星分析。中国兽医学报(英文版);37: 9-14。
2. Moshkelani S，等。伊朗阿拉伯马14颗微卫星DNA指纹图谱。中国生物科学(2011);6: 402 - 405。
3. Telalbasic R，等。Borike种马和阿拉伯马育种的历史从1895年到2007年。Stocarstvo。(2008);62: 417 - 429。
4. Faghani M，等。查尔马哈尔-瓦巴赫蒂亚里省阿拉伯马14个遗传标记的鉴定。国际生命科学与技术会议IPCBEE vol.3 IACSIT出版社，新加坡(2011);202-204。
5. Tozaki T，等。日本马和亚洲马的微卫星变异及其与欧洲马外群的系统发育关系。J她。(2003年);94:374 - 380。
6. 柏柏尔N，等。利用多态微卫星标记对阿尔及利亚五个马品种的分子特征和分化。中国畜牧杂志(2014);131:387-394
7. 塞万提斯一世等人。通过谱系分析评估西班牙阿拉伯马的种群历史和遗传变异。牲畜Sci。(2008);113:24-33。
8. Georgescu SE，等。阿拉伯马基因分型使用17个微卫星。ArchivaZootechnica。(2005年);8:169 - 175。
9. 波兰阿拉伯马的谱系分析。牲畜Sci。(2004年);105:272 - 276。
10. 阿拉伯马群体遗传多样性和群体结构的微卫星分析。J她。(2013 b)。
11. Miller SA，等。从人类有核细胞中提取DNA的一种简单的盐析过程。Nucleic Acids Res.(1988);16:1215。
12. Botstein D等人。利用限制性片段长度多态性构建人类遗传连锁图谱。胡恩杰内(1980);32:31 -331。
13. 分子进化遗传学。哥伦比亚大学出版社，纽约(1987年)。
14. 堰BS。遗传数据分析II，桑德兰，马萨诸塞州:Sinauer Associates, Inc(1996)。
15. Guo SW, Thompson E.对多个等位基因进行精确的Hardy-Weinberg比例测试。生物识别技术(1992);48:361 - 372。
16. 刘凯，缪斯。Powermarker:遗传标记数据的集成分析环境。生物信息学(2005);21:2128 - 2129。
17. 鲑鱼b - h群体核微卫星标记的多态性。博士羞辱。科学学院(2005)。
18. 用户指南，马，牛和狗的StockMarks®套件。马，牛和犬基因分型试剂盒，应用生物系统公司。出版物编号4346135，修订F，第3章，(2014);21-22。
19. Glowatzki-Mullis ML，等。马种群的遗传多样性，特别关注弗朗什-蒙塔尼斯品种。动物麝猫。(2005);37:33-39。
20. Juras R等。三个立陶宛本土马品种的遗传分析。中华农学杂志(2003);53:180-185。
21. 科南特EK，等。对美国东南部殖民地西班牙马种群的微卫星分析。动物麝猫。(2012年);43:53 - 62。
22. Di Stasio L，等。利用微卫星标记的Bardigianohorse遗传特征。中华动物科学(2008);7:243-250。
23. Iwanczyk E等人。波兰重马的遗传结构和系统发育关系。应用科学学报(2006);47:353-359。
24. 路易斯C等人。基于蛋白质和微卫星位点变异的葡萄牙马和其他马品种的遗传多样性和关系。动物麝猫。(2007);38:20-27。
25. van de Goor LHP等。17种马STR的种群研究，用于法医和系统发育分析。动物麝猫。(2011年);42:627 - 633。
26. Vega-Pla JL，等。拯救野马种群:这真的重要吗?来自西班牙南部Don ~ ana国家公园的野马案例研究。动物麝猫。(2006年);37:571 - 578。
27. Khanshour A,Cothran EG;阿拉伯马品种遗传多样性与群体结构的微卫星分析。《植物与动物基因组XX》，2012年1月14-18日，加州圣地亚哥。
28. Marletta D，等。利用微卫星标记分析西地中海马品种间的遗传多样性和关系。动物科学学报(2006);123:315-325。
29. Arbele KS，等。利用微卫星DNA标记对德国役马品种与原始马、骑马马和野马的遗传多样性进行了比较。动物麝猫。(2004年);35:270 - 277。
30. Galov A，等。波萨维纳和克罗地亚冷血马与克罗地亚利皮赞马的遗传结构和混合。捷克动物科学(2013);58:71-78。
31. 王晓燕，王晓燕，王晓燕，等。里海马群体遗传多样性分析及近亲繁殖系数估算。生物技术学报(英文版)(2010);9:293-299。