Oumar鬃毛,Fatimata Mbaye*,Mbacke Sembene
动物生物学,逃往安踏迪奥普大学达喀尔塞内加尔达喀尔
收到日期:10/03/2021接受日期:24/03/2021发表日期:31/03/2021
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发展中国家占世界上72%的人死于癌症,这个灾难是这些国家的第三大死因。每年的死亡率在西非估计为76.23%。在塞内加尔,卵巢癌是所有两性结合的第八大癌症;其发病率在2018年估计为2.5%。大多数的癌症是由于染色体不稳定(80%)或相关故障修复核苷酸不匹配。本研究的总目标是理解的影响不稳定的微卫星位点在塞内加尔妇女卵巢致癌作用。我们研究这两个基因座的可变性(BAT25和BAT26)通过PCR /测序在37个塞内加尔的卵巢癌患者。BAT25和BAT26位点多态性的分析表明,卵巢致癌作用与不稳定的微卫星位点MSI-H表现型。这MSI-H肿瘤级别的不稳定为特征的删除,插入,替换。BAT-26标记的不稳定性的特征是10模式。 BAT-25 mutations are more prominent. Ovarian carcinogenesis could be due to a defect in the MMR system.
癌症、卵巢、微卫星多态性
人体包含数以百万计的细胞含有遗传信息的载体,DNA。每一天,后者受数以百万计的攻击,但是在绝大多数情况下,这些都是非常有效地修复。然而,它只需要一个失败的错配修复系统启动或继续一个细胞转化的过程,导致癌症。发展中国家占世界上72%的人死于癌症,这灾难死亡的第三个原因是在这些国家(1]。根据相同的研究,妇科癌症占全球癌症的19%。女人是最暴露;他们代表了68%的情况下2]。在这些癌症我们可以引用的卵巢腺癌。卵巢癌被认为是最严重的妇科癌症。他们在世界上第七位女性癌症和18处无论性别2]。我们注意到一个大型的地理变异在卵巢癌的发病率以及各种各样的组织学类型。Ba et al。(2014),表明在西非每年的死亡率估计为76.23%。这些癌症,像大多数发展中国家的癌症,通常发现在晚期5年生存很少超过40%,尽管治疗[3]。风险因素包括未产妇,卵巢癌的家族历史,患者BRCA1或BRCA2基因突变。然而,90%的恶性肿瘤发生在缺乏这些因素(3]。在塞内加尔,死于卵巢癌妇女的数量已经成为引人注目的,在2018年,211个新的死亡记录(Globocan, 2018)。根据(民主党et al ., 2008),这些癌症发生在老年妇女(平均54.3年),绝经后,物理性能较差,在晚期(57.3%被认为在转移的情况下)。分子生物学的进步使人们有可能对癌症疾病的遗传物质进行分类。事实上,肿瘤变换是一个过程,通常的克隆起源,细胞逐渐获得选择性优势其副产品。这些阶段是收购非常不同的基因组的改变。这些基因改变有两种截然不同的后果。他们会导致某些基因的活性的增加通常促进肿瘤的生长;这些基因被称为致癌基因。相反,他们可以灭活其他基因的生理活动反对肿瘤变换,因此他们的名字肿瘤抑制基因。 The discovery a few years ago of a link between the occurrence of certain cancers and the existence of abnormalities in the DNA replication error repair system (MMR system, for mismatch repair) opened up new horizons in the study of carcinogenesis in humans [4]。这些异常,由于DNA核苷酸不稳定,主要影响基因组的微卫星序列不相关的染色体异常(5]。基于此背景下,我们假设存在不稳定的微卫星位点在卵巢肿瘤。本研究的总目标是理解的影响不稳定的微卫星位点在塞内加尔妇女卵巢致癌作用。这个总目标被分成三个具体目标:
——确定的频率不稳定的BAT-25 BAT-26标记;
——的多态性和遗传多样性评估BAT-25 BAT-26标记;
——确定微卫星标记的基因进化。
病人和样品
本研究涉及37塞内加尔的卵巢癌患者。获得的癌组织样本后手术治疗在癌症中执行部门Joliot居里研究所阿里斯蒂德Le Dantec医院在达喀尔。健康受试者的血样被用作控制。
基因研究
组织总DNA提取使用试剂盒Dneasy组织方法根据制造商的指示。埃普多夫的放大进行了品牌thermocycler 50μl反应体积的条件下给出了表1。测序反应进行了热循环MJ研究ptc - 225的珀尔帖效应类型装备。ABIPRISM和受到电泳ABI 3730 XL音序器。
| 标记放大 | 引物 | PCR(50μl)混合 | 放大的条件 |
|---|---|---|---|
| BAT-25 | BAT-25 (F) TACCAGGTGGCAAAGGGCA BAT-25(右) TCTGCATTTTAACTATGGCTC |
MilliQ水(33.9μl), 10 X缓冲(5μl), Mgcl2(2μl)、核苷酸(2μl),底漆(2.5μl每个底漆),聚合(0.1μl)和2μl DNA。 | 最初的变性为10分钟94°C;30周期(初始变性94°C 45秒;杂交58 45 s°C;延长72°C 45 s);最终伸长72°C 10分钟。 |
| BAT-26 | BAT-26 (F) CTGCGGTAATCAAGTTTT BAT-26(右) AACCATTCAACATTTTTAACCC |
初始变性95°C 5分钟;35周期(初始变性为30年代95°C;杂交47°C 1分钟;延长70°C 1分钟);最终伸长70°C 10分钟。 |
表1:BAT-25和BAT-26位点扩增条件
BAT-25和BAT-26位点的序列彻底纠正,验证和与生物编辑软件版本8.0.5 [6)使用Clustal W多个对齐算法(7]。大量的分析进行:
1。为每个轨迹不稳定的频率计算。任何差异模式和/或规模被认为是不稳定的。肿瘤被定义为稳定(MSS)如果他们不显示模式和/或大小差异的两个位点。他们被定义为弱不稳定(MSI-L)如果他们呈现不同的模式和/或大小至少一个轨迹。肿瘤是高度不稳定(MSI-H)如果他们显示不同的模式和/或大小的两个标记研究。
2。多态性和遗传多样性的基本参数,如网站(N)的数量,数量的变量和不变的网站,信息网站的数量少,单的数量(h)和遗传多样性的指标,如单体型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)测定使用DnaSP 5.10版本软件(Librado Rozas, 2009)。核苷酸的平均数差异(K)和突变的总数(Eta)测定相同的软件。核苷酸频率和突变的性质(转换和颠换)测定使用大型10软件版本0.5 (Kumar et al ., 2018)。
3所示。研究基因进化的BAT-25 BAT-26标记,我们测试了偏离中立假说D从日本田岛,Fs从Fu和D *和F *傅和李DnaSP软件5.10版本(Librado Rozas, 2009)。不匹配两个标记分布曲线确定使用相同的软件。扩张的有效性模型我们寻找的SSD和破布人口指标的ARLEQUIN软件版本3.5.1.3 (Excoffier Lischer, 2010)。重要性水平是评估1000年之后模拟。
BAT-25和BAT-26位点不稳定分析
的规模和模式是有区别的两个位点在患有卵巢癌。所有的肿瘤都不稳定的两个位点(c - kit BAT-25原癌基因和BAT-26 MSH2基因)。然而,BAT-25标记的胞嘧啶位置7 - 8之间插入一被发现,16 - 17和17 - 18,胸腺嘧啶替换由鸟嘌呤在24日和25日最后胸腺嘧啶删除25th位置为癌变的个人。不稳定的特征是9的原因。
BAT-26轨迹,控制个人我们发现25和26日的鸟嘌呤位置而不是26。不稳定的特征是10的原因。在大多数情况下,有腺嘌呤删除开头和结尾的轨迹与鸟嘌呤和腺嘌呤替换其他的(表2和3)。
| BAT-25 | 图案 | 变体 | 病例数 |
|---|---|---|---|
| TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT | 25 t | 3 | |
| TTTTTTTCTTTTTTTTTCTCTTTTTTT | [(7 - 8),(16 - 17)等(17 - 18)]insC | 6 | |
| TTTTTTTTTTTTTTTTTCTCTTTTTTG | [(16 - 17)等(17 - 18)]insC, 25 t > G | 1 | |
| TTTTTTTCTTTTTTTTTCTCTTTTTGG | [(7 - 8),(16 - 17)等(17 - 18)]insC, (24 _25) T > G | 1 | |
| TTTTTTTCTTTTTTTTTCTCTTTTCTT | ((7 - 8),(16 - 17),(17 - 18)等(21)]insC | 1 | |
| TTTTTTTCTTTTTCTTTCTCTTTTTTT | [(7 - 8)、(12 - 13)(16 - 17)等(17 - 18)]insC | 1 | |
| TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG | 25 t > G | 14 | |
| TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT - | 25日解决 | 4 | |
| TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG - | 25解决,24 t > G | 8 | |
| TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGG - | 25日解决,(大于23日)T > G | 1 |
表2:模式和/或大小差异BAT-25标记
| BAT-26 | 图案 | 变体 | 病例数 |
|---|---|---|---|
| AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAG | Het26A > G | 3 | |
| AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | 26日菲律宾人质 | 2 | |
| 一个AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | (1 + 26)菲律宾人质 | 4 | |
| 一个一个AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAG | (1-2-3 + 26)德尔,25 G > | 2 | |
| 一个AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAG | (1 + 26)德尔,25 G > | 1 | |
| 一个AAAAAAAAAAAAAAGGAAAAAAAA | (1 + 26)德尔,(16 _17)> G | 1 | |
| 一个AAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAG | (1 + 26)德尔,[(4 _5)+ 25]> G | 1 | |
| 一个AGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | (1 + 26)德尔,> 3 G | 2 | |
| 一个AAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | 1德尔,> 3 G | 1 | |
| AAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA | 26德尔,> 3 G, | 1 | |
| 一个AAAAAAAAAAAATAAAAAAATAAA | (1 + 26)德尔,(13 + 21)> T | 1 |
表3:模式差异和BAT-26标记/尺寸
评估BAT-25和BAT-26位点的多态性和遗传多样性
表4显示了BAT-25 23多态网站BAT-26轨迹和8。核苷酸频率的计算揭示了一个优势的T的百分比(74.41%)和G标记BAT-25(11.66%)和一个(96.09%)和G (3.39%) BAT-26转换(57岁的31%)的比例略高于颠换(42.69%)BAT-25标记另一方面转换非常重要(99.48%)和蝙蝠的颠换太弱(0.52%)——26岁。多态性haplotypic多样性分析显示高值(Hd)在这两个标记为BAT-25 (0.755±0.063, 0.675±0.117 BAT-26)核苷酸多样性和较低的值(π);0.045±0.048,0.059±0.065。核苷酸差异(K)的平均数是2.619 BAT-26 BAT-25为1.317,变异的总数(Eta)是20为BAT-26 BAT-25是7。BAT-25突变在卵巢癌似乎更重要
| 位点 | BAT-25 | BAT-26 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 的组合数 | 37 | 16 | ||||||
| 序列的大小(N) | 60 | 26 | ||||||
| 多态的网站 | 23 | 8 | ||||||
| 信息网站很少 | 7 | 3 | ||||||
| 核苷酸频率(%) | 一个 8.87 |
T 74.41 |
C 5.06 |
G 11.66 |
一个 96.09 |
T 0.52 |
C 0.00 |
G 3.39 |
| 转换(%) | 57岁的31日 | 99年,48 | ||||||
| 颠换(%) | 42岁,69年 | 0,52 | ||||||
| 单数量(h) | 11 | 6 | ||||||
| 核苷酸多样性(π) | 0045±0048 | 0059±0065 | ||||||
| Haplotypic多样性(高清) | 0755±0063 | 0675±0117 | ||||||
| K | 2619年 | 1317年 | ||||||
| 总数量的突变(Eta) | 20. | 7 | ||||||
表4:参数BAT-25和BAT-26位点的遗传多样性。
基因进化BAT-25和BAT-26标记
日本田岛的统计值D和傅的Fs是负面的和无关紧要的两个标记,另一方面傅的D *和F *指数和李在BAT-25显著负面和消极的和无关紧要的蝙蝠- 26日(表5)(图1和图2)。
| D从日本田岛 | 从傅和李D * | 从傅和李F * | Fs从傅 | |
|---|---|---|---|---|
| BAT-25 | -1.52004;p > 0.10 | 3,38357;p < 0.02 | 3,26780;p < 0.05 | -2282;p = 0.052 |
| BAT-26 | -1.32436;p > 0.10 | 1,61052;p > 0.10 | 1,75959;p > 0.10 | -1850;p = 0.092 |
表5:中立BAT-25指数和BAT-26标记
图1:不匹配的分布曲线BAT-25常数大小(a)的人口和不断增长的人口(B): SSD = 0037, P = 0157;RI = 0130 P = 0029
图2:不匹配的分布曲线BAT-26常数大小(a)的人口和不断增长的人口(B): SSD = 0, 0034 P = 0, 85;国际扶轮= 0030 P = 0, 99年
本研究的总目标是理解的影响不稳定的微卫星位点在塞内加尔妇女卵巢致癌作用。基因研究的选择落在BAT-25 BAT-26标记。根据Sood et al。(2001),这两个位点的quasi-monomorphic概要促进MSI的识别,因为缩短不稳定的等位基因可以很容易地从正常大小的等位基因分化8]。据郑et al。(2012)这两个标记是敏感和已经成为最著名的评价MSI-H字符在肿瘤(9]。
对照组BAT-25轨迹是单型的25 t和BAT-26在25和26日的鸟嘌呤(G)位置而不是26。这个结果支持的杂合性的存在G在26日在BAT-26轨迹中的位置。然而,根据De拉夏贝尔Hampel, (2010), BAT26标记包括26个腺嘌呤在超过99%的欧洲人等位基因与不同数量的腺嘌呤在这个位置观察到25%的非洲人,y包括非洲裔美国人。Pyatt et al .(1999)确定BAT-26位点的等位变异健康的非裔美国女性的12.6%,这2.9%的人在两个位点多态(10]。根据Pyatt et al。(1999)和Mbaye et al .(2015)在非洲,特别是,有自然这两个标记的多态性,这突显出需要小心使用它们对患者所属民族(5,10]。
塞内加尔卵巢癌患者为谁2标记排序都有MSI-H表型(不稳定在2标记)。事实上,MSI-H肿瘤表现出不同的二特征相比,肿瘤没有这种表型(3]。这MSI-H表型特征变量的一系列肿瘤定位的预后优于non-MSI肿瘤,和更敏感的化疗(杜瓦和哈梅林,2003)。
这种不稳定性的特点是在大多数情况下,插入,删除和替换。这种高水平的不稳定可能是由于未能修复不匹配从而导致卵巢癌。的确据Sood et al。(2001), MSI-H发生在12%的浸润性卵巢肿瘤(8]。
多态性和遗传多样性评价BAT-25和BAT-26位点表明BAT-25轨迹比BAT-26多态突变(Eta)总数的20和7,分别。有关所有样本显示的核苷酸频率值T的优势和G为BAT-26 BAT-25和a和G。在这项研究中,转换控制两个位点(BAT-26 BAT-25为57.31%和99.54%)相反的工作高et al .(2009)和Ndiaye et al。(2017),这表明,颠换更频繁的在肿瘤组织11,12]。癌组织分析显示高haplotypic多样性(Hd)在这两个标记为BAT-25 (0.755±0.063, 0.675±0.117 BAT-26)和一个低价值的核苷酸多样性π(0.045±0.048,0.059±0.065)那些使我们得出这样的结论:两个位点的突变观察将会快速增长从一个原始小克隆在卵巢癌有效。这个结果与文献一致。中立的分析显示,日本田岛的D和傅的Fs是负面的和微不足道的建议适度扩张癌细胞的突变。因此不匹配曲线给出了多重模态分布,证实了这种温和扩张的癌细胞(13- - - - - -21]。
卵巢癌是最致命、最复杂的妇科和乳腺癌。这些癌症发生在老年妇女和被发现在一个高级阶段,5年存活率很少超过40%。分析BAT-25和BAT-26位点的多态性表现出强烈的变化反映了他们的肿瘤MSI-H不稳定状态(100%),证实了微卫星位点的不稳定之间的关联、卵巢癌在塞内加尔妇女。MMR联合系统可以影响这个强烈的不稳定。
这将是有趣的在这个分析包括一定数量的变量,比如年龄,种族,肿瘤阶段,成绩和对化疗的反应和完成分析与其他三个单核苷酸的标记pentaplex (NR-21 NR-24和NR-27)。
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