烟草定量基因表达规范化优势内参基因的全基因组筛选与检测

Yushuang郭^1＃，李瑞元^2＃，泽山·阿斯格尔^3.伊姆兰·海德尔·沙姆西^{3 *}，余世洲¹，赵杰宏¹任学良^1＊

¹分子重点实验室遗传学，中国烟草总公司贵州省烟草科学研究所，贵州省贵阳市观山湖区龙潭坝路29号，邮编550083

²信息与信息重点实验室计算贵州省贵阳市宝山北路116号贵州师范大学贵州省科学部，550083

^3.浙江大学农业与生物技术学院作物种质资源教育部重点实验室，杭州310058

^＃这两位作者对这篇论文的贡献相当。

^＊通讯作者:: 伊姆兰·海德尔·沙姆西
作物种质资源重点实验室“，
农业与生物技术学院农学系“，
浙江大学，杭州
中国邮编310058
电子邮件: (电子邮件保护)

: Xueliang任
分子重点实验室
遗传学中国烟草总公司
贵州省烟草科学研究所29号
贵阳市观山湖区龙潭坝路
550083，中国
电子邮件: (电子邮件保护)

收到日期:2016年7月27日;接受日期:2016年9月6日发表日期:2016年9月12日

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摘要

qRT-PCR是一种非常精确的工具，用于测量所有生物的基因表达。准确和可重复的qRT-PCR结果依赖于使用可靠的内参基因对表达数据进行归一化。为了使烟草中可靠的内参基因库多样化，使用定制设计的微阵列在21个不同的样本中测量了44,873个烟草基因(ESTs)的表达稳定性，这些样本代表不同的组织类型和发育阶段。共有14个基因被选为候选内参基因，因为它们看起来最稳定。将这些基因与两个广泛使用的管家基因(L25和EF-1a)进行比较，并通过qRT-PCR进行进一步验证。结果表明，基因3 (NADH脱氢酶)和基因4(伴侣蛋白CPN60-2)的表达稳定性最高，甚至高于L25和EF-1a。综上所述，我们的结果为烟草基因表达分析提供了一个更广泛的稳定内参基因库。

关键字

内参基因，芯片，归一化，实时RT-PCR，烟草。

简介

qRT-PCR是一种标准和准确的方法，用于研究基因表达，并在生物学研究中进行其他深入分析[1］．稳定表达基因的转录本是基因表达数据规范化的重要内参，因为结果受到多种实验条件的影响，如样本量、引物性能和cDNA合成效率[2，3.］．通常，编码参与基本细胞过程的转录本的基因被用作内部参考。不幸的是，这些基因的转录水平并不总是稳定的，这些常用的内参基因的表达有显著的变化[4，5］．理想的内参基因是组成性表达的，存在于不同发育阶段的不同细胞或组织类型中，并在不同的实验条件下保持稳定[6-8］．因此，确定哪个内参基因最适合转录本归一化对于准确的数据分析和结论至关重要[9］．近年来，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物上的研究证实了内参基因的重要性[10]，土豆[4]，大豆[11]，葡萄[12]，西红柿[13]，大米[14，15]、烟草[16]，甘蔗[17]，黄瓜[18]，荔枝[19]、多年生黑麦草[20.]，花生[21]，亚麻[22]，西葫芦[23]和小麦[24］．在这方面，许多统计分析软件包，如geNormPLUS [8]、BestKeeper [25]和NormFinder [26]被认为是为了帮助研究人员在一系列样本中验证内参基因的适用性。

烟草(烟草)由于其经济价值和易于分子操作，是一种已建立的生理和遗传研究的模式植物[27-30.］．因此，扩大现有的烟草基因表达研究工具是非常重要的。此前，研究人员对烟草中8个潜在qRT-PCR内参基因的稳定性进行了系统评估，identiÃ¯Â¬Â发现了3个内参基因(L25、EF-1a和Ntubc2)，这些内参基因足以在几种器官类型和存在一些非生物胁迫或生理节律振荡的情况下进行正常化[16］．然而，这些和其他潜在内参基因在烟草中的相对稳定性尚未在全基因组水平或实验背景下进行研究，这限制了qRT-PCR在烟草研究中的应用。

在本研究中，使用定制设计的微阵列在21个不同的组织样本中测量了44,873个烟草基因(ESTs)表达的稳定性，这些组织样本代表了正常生长条件下的一系列组织类型和发育阶段。选择最稳定的基因作为新的候选内参基因，并使用两个广泛使用的管家基因(L25和EF-1a)进行qRT-PCR验证。通过Ct分析和geNorm统计软件检测候选内参基因表达的稳定性。这些结果为qRT-PCR在烟草中的准确和广泛应用提供了更稳定的内参基因。

材料与方法

植物材料

在贵州贵阳地区，在正常的烟草生产条件下，种植了烟草品种K326。将5株单株的叶、茎、根和花进行混合，分别在移植后0、20、40、60、70和100天采集叶、茎和根，花(F)在开花后0、5和10天采集，共21个样品。所有样品保存在-80°C。

RNA提取和微阵列分析

使用植物RNA纯化试剂(Qiagen)提取总RNA，并使用DNase I (Takara)处理，根据制造商的方案去除任何DNA污染。使用SuperScript double -strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)和oligo (dT)引物按照制造商的方案合成双链cDNA。Cy-3标记和杂交步骤按标准程序进行。

使用了定制设计的微阵列平台，包括3个60探针，用于检测来自公共EST烟草数据库的44,873个unigenes。每个60 mer探针是从针对基因模型不同部分设计的6到7个不重叠探针组中选择的。与6到7个非重叠实验探针的平均值最相似的探针被认为是最可靠的转录水平估计探针。Roche NimbleGen使用四分位归一化和鲁棒多芯片平均算法生成表达式值。

定量逆转录实时PCR分析

通过qRT-PCR分析了14个比L25核糖体蛋白编码基因和EF-1a表达更稳定的潜在内参基因。根据14个潜在烟草内参基因序列，使用Primer 5.0软件(Applied Biosystems, CA, USA)手动设计引物，并从GenBank (表1)．每个引物对扩增产物的特异性通过琼脂糖凝胶电泳检测到预期大小的单个条带，通过产物的qRT-PCR熔解曲线检测到单个峰来验证。

基因没有。	加入不。	基因产物	扩增子的大小	PCR效率(±S.D)	引物序列5’→3’
基因1	胃肠道\| 158189353	锌指蛋白	239个基点	1.970±0.014	F: 5“-TTAGGCATCCTTTCCCTCCT-3”R: 5“-CAATACTGCAGCCATAGTGC-3”
基因2	XM_009759509	盒蛋白质	142个基点	2.012±0.012	F: 5“-GTCTCAATAACCGGAAGAGC-3” R: 5“-CTAACAACACCAAGCCCACC-3”
基因3	Y09109	NADH脱氢酶	228个基点	1.976±0.017	F: 5“-TTGGTGGATCTGACCTAGTG-3” R: 5“-ATGGTGTGAAAGAGCGTTCG-3”
基因4	XM_009760119	分子伴侣蛋白CPN60-2	190个基点	2.010±0.014	F: 5“-AGCACTAGGCATTGCCATTG-3” R: 5“-ATGGCACTCTTGATGGGTTC-3”
基因5	胃肠道\| 192177446	atp酶蛋白	203个基点	1.987±0.021	F: 5“-TCTCAGGACACGCCAATATC-3” R: 5“-TAGGTTGAGTTCCGCTTCAC-3”
基因6	XM_009612124	锌指蛋白	165个基点	1.905±0.013	F: 5“-GAGGAGGCGCAACATTACAG-3” R: 5“-GGCAGGATCATAACCAAGAC-3”
基因7	胃肠道\| 191971597	PKHD-type羟化酶	177个基点	1.876±0.011	F: 5“-TCCGGATGGACTAGCAGAAG-3” R: 5“-GGAACGCATAAGCAAGTCCA-3”
基因8	胃肠道\| 192049848	III型分泌成分蛋白	263个基点	1.967±0.014	F: 5“-GATATGAGCCAACTCGACTG-3” R: 5“-AAGACATCGAGCTGTGAGTG-3”
基因9	胃肠道\| 191729256	葡萄糖脱氢酶	210个基点	2.011±0.015	F: 5“-CCTGACTCTAGGTGGCATGT-3” R: 5“-TCCAACCACTGACGGACACA-3”
基因10	胃肠道\| 192222232	RNA聚合酶-24亚基	285个基点	2.003±0.013	F: 5“-GCTTGAGTAGCCTTTGAGAG-3” R: 5“-ACTCACACTGTGCTCATTCA-3”
基因11	胃肠道\| 192221411	假设蛋白质	161个基点	1.992±0.014	F: 5“-TTGAGGCATTGGAGAGTGAG-3” R: 5“-CTCCACTTTTCTCAAGCCCA-3”
基因12	胃肠道\| 191769435	驱动蛋白样蛋白kifc3样	263个基点	2.013±0.011	F: 5“-CACCTATAGTCCGACTTCTG-3” R: 5“-GCACGATGCTGAATTGAGAG-3”
基因13	胃肠道\| 191822098	Diguanylatecyclase	207个基点	1.955±0.010	F: 5“-GTGATACTGGTGGTGGTCAT-3” R: 5“-AGTGTATCCACCGAGGTGAC-3”
基因14	胃肠道\| 191898125	NAD-dependent脱水酶	215个基点	1.999±0.014	F: 5“-TCAACCGCCACCTCTTCAAT-3” R: 5“-TCAACAGCTCGAGATCTACG-3”
基因15	AF120093	EF-1a	135个基点	2.002±0.009	F: 5“-CAAGCGGTCATTCAAGTATGC-3” R: 5“-TGTCCAGGACGATCAATCACA-3”
基因16	L18908	L25核糖体蛋白	140个基点	1.998±0.012	F: 5“-TTGAGGACAACAACACCCTTG-3” R: 5“-TGCTTTCTTCGTCCCATCAG-3”

表1:用于qRT-PCR的候选内参基因和优化引物序列描述。

根据厂家说明书，以0.1 μg总RNA为模板，采用寡核苷酸(dT)引物，用mmlv -逆转录酶(Promega)合成第一链cDNA。qRT-PCR使用SYBR实时PCR检测系统(MJ Research, Waltham, MA, USA)按照制造商说明进行。每个反应的总体积为20 μl，其中SYBR Green Mix (Takara) 10 μl，稀释cDNA 1.5 μl(对应逆转录总RNA 1.5 ng)，每个引物0.2 μl(工作浓度为200 nM)。反应的初始变性步骤为95°C，持续10秒，然后是95°C，持续5秒，60°C，持续30秒，72°C，持续10秒的35个循环。对所有内参基因进行重复评估，每个样本制备三份。

数据分析

用每个参比基因的Ct值比较所有21个样本的表达水平。利用LinReg PCR软件从扩增图中确定PCR效率[16］．将结果导入Excel，使用geNorm对所有21个样本中每个参比基因进行归一化的有效性进行测定。geNorm软件提供稳定性测量(M)，并使用逐步方法排除最不稳定的基因，并创建折线图来演示所选基因的稳定性[12］．

结果

IdentiÃ¯Â¬Â通过微阵列数据获取最稳定的烟草基因

以21份样品(GEO Accession No: GSE73440)归一化基因表达值的变异系数(cv)评价基因表达的稳定性。44873个基因的cv范围为0.0345 ~ 4.3080，平均为0.2665。44873个基因表达值cv的频率分布有2个峰，表明基因表达稳定性呈混合分布(图1)．除了cv之外，还使用21个样本中每个基因的表达范围来评估基因表达的稳定性。21个样本中最小的表达范围为0.045，最大的表达范围为250.788，平均为1.580。通过结合每个基因的最小CV和范围值，筛选出14个比L25和EF-1a更稳定的候选基因进行进一步的qRT-PCR验证。所选基因的平均表达范围分别为1.010、0.042和0.2062 (表2)．

基因没有。	标准的变化	马克斯	最小值	范围	平均	简历
基因1	0.035	1.075	0.926	0.1486	1.000	0.035
基因2	0.038	1.091	0.921	0.1704	0.989	0.039
基因3	0.041	1.106	0.934	0.1720	1.017	0.040
基因4	0.041	1.135	0.916	0.2186	1.024	0.040
基因5	0.039	1.049	0.867	0.1820	0.943	0.041
基因6	0.041	1.070	0.845	0.2255	0.981	0.041
基因7	0.043	1.133	0.893	0.2391	1.005	0.043
基因8	0.050	1.276	1.046	0.2297	1.145	0.043
基因9	0.043	1.115	0.876	0.2391	0.990	0.043
基因10	0.043	1.101	0.903	0.1980	0.991	0.043
基因11	0.044	1.102	0.898	0.2039	1.014	0.043
基因12	0.044	1.154	0.907	0.2465	1.007	0.043
基因13	0.042	1.061	0.894	0.1669	0.978	0.043
基因14	0.044	1.126	0.912	0.2137	1.021	0.043

表2:所选14个基因归一化表达值的Standard Variation、Maximum、Minimum、Range、Average和CV (Coefficient of Variation)。

microbiology-and-biotechnology-frequency-distribution-CVs

图1:44,873个基因表达值的cv频率分布。所示为21个样本中44,873个基因表达值的cv(变异系数)的log2变换直方图。直方图的bin宽度设置为0.02 (x轴)。

引物的选择和特异性

在从微阵列数据中鉴定出稳定表达的基因后，我们的目标是将广泛使用的内参基因与新的内参基因进行比较。为了选择最好的稳定内参基因进行进一步的基因表达评估，我们为14个稳定基因设计了qRT-PCR引物作为新的候选内参基因(表1)。扩增特异性决定因素包括产物qRT-PCR熔解曲线中是否存在单峰(图2)表示没有其他non-speciÃ¯Â Â . c放大产品。此外，在没有模板的反应中未观察到qRT-PCR检测信号(数据未显示)。

microbiology-and-biotechnology-Primers-specificity-melt-curves

图2:对16个内参基因的扩增子进行引物特异性和熔体曲线分析。对21份烟草cDNA样本分别进行3个技术重复，构建了14个潜在内参基因与EF-1a和L25的分离曲线。

Ct分析

为评估基因稳定性，所有PCR检测均进行三次，并使用平均值进行数据分析。在本研究中，16个内参基因的Ct值范围较大，基因16的Ct值为19.62，基因1的Ct值为33.22 (图3)．基因4的标准差为0.43 ~ 7的标准差为3.9，说明所有内参基因的表达变化都很大，没有一个基因在所有实验条件下稳定稳定地表达。基因4在16个内参基因中表达最稳定，表明它是烟草中排名靠前的内参基因。基因12的表达稳定性虽然低于基因4和基因16，但高于基因15，表明它是一个适合数据归一化的参考基因。

microbiology-and-biotechnology-Absolute-cycle-threshold-values

图3:qRT-PCR检测21个cdna样本中16个内参基因的绝对周期阈值(Ct)。

geNorm分析

geNorm分析根据表达稳定性(M值)对内参基因进行排序，便于在不同条件下从不同处理样本的一组候选基因中筛选出最优的一对内参基因。一个内参基因的M值是该基因与所有其他检测内参基因成对变异V的平均值。逐步剔除M值最高的基因，根据表达稳定性对被测基因进行排序。M值最低的基因被认为表达最稳定。将所有21个样本综合考虑，基因3和6在不同组织和发育阶段的所有实验条件下表达最稳定，而基因7表达最不稳定。基因3、基因6和基因14与基因15和基因16这两个传统内参基因相比表达更稳定(图4一)．此外，基因4和基因5也表现出比基因15更稳定的表达，表明基因3、基因4、基因5、基因6和基因14有可能成为新的转录归一化参考基因。我们还分析了所有选择的候选内参基因的组织特异性。基因4和14在根中稳定表达，基因8最不稳定(图4 b)．基因6和基因14在茎中稳定表达，基因10最不稳定(图4 c)．基因5和基因16在叶片中稳定表达，而基因10似乎最不稳定，与它在茎组织中的表现相似(图4 d)．在花中，基因3和基因6稳定表达(图4 e)．综上所述，我们推荐基因3和基因4作为新的内参基因，因为与传统的内参基因基因15和16相比，基因3和基因4在不同组织中表达最稳定。

microbiology-and-biotechnology-Selection-most-suitable-reference

图4:选择最适合qRT-PCR归一化的内参基因。数据来自3个生物重复。平均基因表达稳定性值(M值)用于对不同组内控制基因进行排序。计算使用geNorm进行，并表示为总量(a)，根(b)，茎(c)，叶(d)和花(e)。

讨论

qRT-PCR具有准确性、特异性和敏感性，是检测基因表达水平的重要技术。然而，目标基因表达分析的准确性受到数据归一化的内参基因的选择的强烈影响inÃ¯Â¬Â;因此，筛选合适的内参基因以确保适当的表达正常化是非常重要的[31，32］．通常，传统的管家基因被用作相对定量的内源性参考。然而，大多数传统的家政基因无法在qRT-PCR分析中提供准确的归一化，因为迄今为止还没有发现单一的通用内参基因[33］．因此，必须基于广泛可用的基因芯片表达数据、公开沉积的EST数据、RNAseq数据，开发发现和检测新内参基因的新方法，并通过qRT-PCR筛选和验证稳定性更好的新内参基因[34］．

烟草属于重要的农业茄科，在许多国家是一种有价值的工业和商业作物。它是基因表达研究的重要模式作物;然而，由于缺乏各种实验背景下内参基因稳定性的信息，qRT-PCR在该作物研究中的应用受到了限制。在本研究中，为了发现用于基因表达规范化的新的更稳定的内参基因，使用定制设计的微阵列在21个不同样本中测量了所有烟草基因(ESTs)的表达稳定性，这些样本代表了一系列组织类型和发育阶段。选择14个最稳定的基因作为新的候选内参基因，并使用两个广泛使用的管家基因(L25和EF-1a)进行实时PCR验证。基于real-time PCR数据进行Ct和geNorm分析。在geNorm分析中，我们发现15号基因似乎是一个很好的候选基因，因为它是整个组织中第二稳定的基因。然而，在根、茎、叶和花等组织中，基因15与其他候选基因相比似乎不太稳定。解释这一现象的原因是，实际上，基因15的M值在整个组织或各自组织(根、茎、叶和花)中几乎没有变化，但其他候选基因的M值在特定组织中发生变化，导致排名发生变化。这一结果证实了基因15是一个非常好的候选基因，而其他候选基因也有可能用于特定组织的定量基因表达规范化。 Similar results were also found in other plants like peach [34]，玉米[35和Hedera helix [36］．综上所述，我们认为基因3 (NADH脱氢酶)和基因4(伴侣蛋白CPN60-2)足以使发育不同的烟草组织中的基因表达正常化。既往研究表明伴侣蛋白CPN60-2参与线粒体蛋白导入和大分子组装。它还可以防止线粒体基质中在应激条件下产生的未折叠多肽的错误折叠，并促进其重新折叠和正确组装[37］．

结论

这是首次使用定制设计的烟草全基因组微阵列来研究传统内参基因的表达稳定性，并根据其Ct值确定在表达稳定性方面优于传统内参基因的新型烟草内参基因。我们的结果证实了基因3 (NADH脱氢酶)和基因4(伴侣蛋白CPN60-2)等许多基因与传统的内参基因相比表达更加稳定，且存在水平较低，为qRT-PCR在烟草中的更准确和广泛应用提供了基础。

确认

感谢国家973专项(517102-N51501/001)、贵州省青年人才培养计划(QKHRZ[2013]02)、中国烟草总公司烟草公司(CNTC- 110201201006, CNTC-110201301004)、贵州省农业重点科技计划(NY[2013]3020)、贵州省自然科学基金([2014]2117)的资助。感谢浙江大学基础科学研究专项资金(517102*172210152)、精英本科生培养项目(188190*170115101/013/002/001)和江苏省现代作物生产协同创新中心的资助。

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