基因组的多样性Arcobacter spp。从表层水分离

文摘

总共45 non-clonalArcobacter隔离从废水和河水样品收集在威托利亚-加斯泰兹,西班牙北部。我们的研究结果证实答:butzleri作为最主要的物种,虽然答:cryaerophilus和答:lanthieri也被确定。八个隔离显示与识别m-PCRs不和谐的结果。基于rpoB基因序列,其中两个八个隔离答:lanthieri。然而,似乎剩下的六个可能的新物种需要额外的分析。virulence-associated基因的发生明显高(P < 0.05)答:butzleri。七的十virulence-associated基因调查(ciaB、mviN tlyA、cadF pldA cj1349和hecA)出现在大量的隔离。其中,hecA基因显著相关(P < 0.05)从废水分离。MLST显示很高的遗传率多样性为答:butzleri隔离。不过,没有迹象显示STs之间的关系和毒力相关基因的存在。总之,Arcobacter地表水人口可能比发现更多的不同的物种,因为大多数的浓缩媒体和分子技术是基于设计的答:butzleri这可能是偏置赞成这个物种的信息。此外,我们发现了一个可能的关系的内容virulence-associated基因和隔离的起源。

关键字

Arcobacterspp。水性;遗传多样性;MLST;virulence-associated基因

介绍

Arcobacter物种被认为是人畜共患的代理,已经成为特别相关的在过去的几年里,由于他们与人类感染的增加(1]。近年来描述物种的数量大幅度增长,尽管这属首次承认在25年前(2]。属Arcobacter包括越来越多的物种答:butzleri,答:cryaerophilus和答:skirrowii的物种通常与人类感染有关3]。

Arcobacter种虫害已发现人类和牲畜粪便(4),野生动物5),食品(6和几个水源包括饮酒7],休闲[8)、地表水以及未经处理的废水处理,这可能表明一个可能无效的废水处理(9- - - - - -11]。此外,Arcobacter种虫害疫情与人体接触faecal-contaminated饮用水(12食用受污染的生的或未煮熟的食物,动物源(1),甚至与直接接触动物。雷竞技网页版然而,从流行病学的角度来看,其水库和传播途径验证人类是不佳。的流行病学调查Arcobacterspp。,包括typing-based监视,声称阐明这个紧急病原体的传播模式的移动环境潜在的主机(11,13]。

分子分型方法适用于临床流行病学追踪相关隔离,这是在流行病学监测和感兴趣的预防和控制感染。不同的基因分型技术已经被用来评估的多样性Arcobacter隔离,包括ERIC-PCR [14),但是脉冲场凝胶电泳的出现(15],MLST [16CGF]或[10]。虽然没有标准的打字方法提出了MLST已经成为一个健壮的工具对全球流行病学和分子进化的研究Arcobacterspp。16- - - - - -18]。

的毒性机制Arcobacter种虫害也不好验证。尽管许多研究都调查了假定的毒性基因的存在Arcobacter,其中大部分都集中在人类,动物和食物来源的隔离(19- - - - - -21]。据我们所知只有两个作品进行分析这些基因从环境样品分离的发生。第一个举行隔离来自不同环境网站整个乳业链(22用隔离来自水)和第二个样本(23]。

此背景下,研究Arcobacter种虫害和水源必须阐明传播的作用,生态特征和人畜共患的风险病原体。本研究的目的是确认的存在Arcobacter种虫害在威托利亚-加斯泰兹地表水样品从不同的位置,西班牙北部,并评估其遗传多样性,包括假定的毒性的检测基因。

材料和方法

样品收集

总共十个样品包括废水(n = 7)和河水(n = 3)收集2010年10月至2011年1月进行分析。河水样本取自Zadorra河周围的威托利亚-加斯泰兹(西班牙北部)和污水收集的样本Crispijana污水处理厂位于威托利亚-加斯泰兹以西约6公里。样本收集使用无菌塑料瓶,运送到实验室并立即处理。四窝的河水和500毫升的顺序废水过滤膜过滤减少孔隙大小:20日5、3、0.8、0.45和0.22μm过滤器(微孔,麻萨诸塞州,美国)。

隔离Arcobacter

0.45μm和0.22μm过滤器被浓缩在10毫升Arcobacter汤(Oxoid贝辛斯托克,汉普郡,英国)与猫补充(Oxoid)和耗氧孵化后24 h。在30°C浓缩、膜过滤技术应用使用0.45μm孔隙大小硝化纤维膜过滤器(微孔)如前所述[6]。板块在30°C孵化最多7天在有氧条件下,检查每一个24小时的存在怀疑Arcobacter殖民地。三到四个嫌疑人殖民地(小,光滑,透明或白色)从每个盘子和选择他们的亚文化,至少三次,裸奔在哥伦比亚血液琼脂板(Oxoid)。这些隔离呈现弯曲螺旋形状和能动性在显微镜检查受到PCR鉴定。

基因组DNA的隔离

DNA分离肉汤文化使用PrepMan™超试剂(美国应用生物系统公司、FosterCity CA)根据制造商的规格。浓度测定spectrophotometrically(美国马萨诸塞州NanoDrop-Thermo费舍尔科学),稀释到20 ng /μl和储存在−20°C。

的识别Arcobacterspp。隔离

为了证实隔离Arcobacterspp,一双genus-specific PCR进行使用底漆被Bastyns et al。24]。确定了隔离物种水平两个复合pcr (m-PCR)方法。描述的m-PCR Houf et al。25)进行识别的物种答:butzleri,答:skirrowii和答:cryaerophilus。另外,隔离受到复合pcr鉴定特定答:butzleri,a . cibarius a . cryaerophilus skirrowii和答:thereius描述Douidah et al。26]。参考菌株的DNA和去离子水作为积极的和消极的控制,分别。当一个孤立m-PCRs都显示不一致的识别,16世纪rRNA-RFLP (RFLP-PCR)测定被费卡洛斯et al。27]。

Enterobacterial重复序列PCR基因间的共识

为了避免重复的菌株的使用,隔离恢复从同一水样都使用ERIC-PCR基因分型技术的引物和条件描述Houf et al。14]。模式至少有一个不同的乐队被视为不同的基因型。

测序的rpoB基因

的rpoB在那些情况下,基因测序m-PCR PCR-RFLP结果与获得的结果不一致。的rpoB基因放大如前所述巷(28]。

PCR产物纯化使用NucleoSpin®凝胶和PCR清理(Macherey-Nagel Duren,德国)根据制造商的指示。的扩增子被sistema双向测序Genomicos(瓦伦西亚,西班牙)。

Sequenced-based系统发育分析进行分类分类属内的一些隔离Arcobacter。系统发育分析的rpoB序列进行了分析和比较,多重序列比对和系统发育分析与已知参考属的物种Arcobacter。Clustal 6 W和大型软件被用于多重序列比对,计算遗传距离,和集群使用neighbor-joining算法构建系统发育树。

茎序列输入(MLST)

MLST根据米勒的方法进行et al。16]。等位基因数和序列类型(STs)被分配使用PubMLST数据库(http://pubmlst.org/arcobacter/)。新等位基因和STs被提交给数据库管理员分配新等位基因或圣号。序列类型之间的关系进行了连接等位基因序列组成每一个独特的圣使用neighbor-joining方法建立了系统树图与木村出现距离估计方法。使用超级集群分析6 (29日]。多态的网站和dN / dS比率测定使用START2程序(30.]。

假定的毒力基因的检测

十的存在公认的毒性基因(cadF, cj1349、ciaB mviN、pldA tlyA, irgA, hecA, hecB iroE)检测使用设计的引物和条件Douidah et al。19和卡拉达等。31日]。放大产品在2%琼脂糖凝胶电泳分离沾GelRed(美国Biotium,海沃德,CA)。分析协会的假定的毒力基因Arcobacter菌株的生物来源、卡方检验和确切概率法进行与SPSS统计软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。P < 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

结果

检测Arcobacter种虫害的地表水

Arcobacter10种虫害是孤立的地表水样品包括废水和河水。基于genus-specific PCR, 77隔离被确定为Arcobacter产生331 bp的片段。这包括61分离废水从河水和16。所有隔离恢复从同一水样受到ERIC-PCR避免包含相同的菌株遗传变异的研究。之后,只有45分离显示不同ERIC-genotype 33从河水从废水和12。

Houf m-PCRs后et al。25)和Douidah et al。26明确了工作),37个分离株(82%),36答:butzleri(25从废水,河水和11)和一个答:cryaerophilus(从河水)。然而,八个污水隔离(18%)显示不一致的结果。他们生成一个相同大小的扩增子的预期答:butzleri(401个基点)的m-PCR Houf et al。25]。然而,与由Douidah et al。26)、5 (FW-4 FW-8、FW-53 FW-54, fw - 61)生成一个相同大小的扩增子的预期答:skirrowii(198个基点),两个隔离(FW-34 FW-40)给两个扩增子相同尺寸的预期答:skirrowii(198个基点)答:cibarius(1125个基点),和一个隔离(FW-59)给两个相同大小的扩增子的预期答:butzleri(2061个基点)答:skirrowii(198个基点)。当受到16 s rRNA-RFLP化验,这八个不和谐的隔离了乐队模式相似答:trophiarum(578、256和175个基点)与核酸内切酶消化后论坛。然而,当种特异的PCR答:trophiarum(32没有特定的扩增子获得执行)。由于他们这些不和谐的结果进行进一步的分析基于sequenced-based系统发育分析。

不和谐的隔离从废水

Sequenced-based系统发育分析rpoB基因序列进行了比较分类分类的八个不和谐的隔离。的序列ropB基因从这些隔离存放在基因库下加入数字:KY002770 (FW-34);KY002772 (FW-40);KY002771 (FW-4);KY002773 (FW-53);KX962637 (FW-54);KY002769 (fw - 61);和KX944697 (FW-59)。获得的种系发生树所示图1。的顺序rpoB基因FW-34和FW-40隔离显示相似比例99.84%和99.52%,分别与答:lanthieri应变AF1440T类型。此外,系统树分组都隔离在一起答:lanthieri在同一集群。根据这些结果,FW-34 FW-40隔离和标识答:lanthieri。

剩下的六个分离株表现出密切的相似之处答:lanthieri(92.58 - 97.91%)的顺序rpoB基因,但也有答:skirrowii(90.66 - 91.30%)答:faecis(87.12 - 88.24%)类型菌株。的rpoB基因的系统发育树显示,尽管密切相关答:lanthieri、隔离FW-4 FW-8 FW-53、FW-54和fw - 61分开这个物种在不同的集群中,而隔离FW-59形成一个独立的线从属的其他物种Arcobacter(图1)。

总的来说,结果来源于sequenced-based系统发育分析的基础上rpoB基因显示隔离FW-4, FW-8、FW-53 FW-54,和弗兰克-威廉姆斯- 61是一个封闭的群分开隔离FW-59,相关。lanthieri但属于不同未定种的属Arcobacter。证实这一假设,我们启动了多相分析来描述可能的新物种,在初步的水平。

通过pcr MLST

总共33 STs 36中被识别答:butzleri由MLST隔离分析(表1)。总的来说,26 STs(78.8%)曾报道,来自新等位基因的序列(n = 19)或新组合的等位基因(n = 7)。多数新STs(23/26, 88.5%)是由一个隔离,而只有三个STs两个隔离。

表1:MLST输入的数据答:butzleri从表面分离水。

共有199个等位基因被确定在所有7个位点,从20个等位基因atpA, glnA和gltA在32glyA。总的来说,67年的199(33.7%)等位基因以前上报,包括他们的频率轨迹从10% (glnA)到56.3% (glyA)。等位基因(等位基因数/株)密度范围从约35%glnA轨迹的69%glyA轨迹(表2)。

表2:等位基因多样性在36答:butzleri从地表水隔离。

最变量轨迹是atpA 9.0%变量网站和最少的变量轨迹是gltA网站只有4.9%的变量。dN / dS比率变化在7个位点,从0.000 gltA glyA 0.101。这些比率与其他作者报道的协议(16- - - - - -18]。一个邻居加入树的连接序列(aspA、atpA glnA、gltA glyA, pgm, tkt;3341个基点)独特的STs (n = 33)是利用大型v6软件生成的。这个系统发育分析导致树,虽然不是很健壮(少数引导值高于50)显示没有隔离的集群。

假定的毒力基因

的发生率和分布十virulence-associated基因研究在所有45 non-clonal隔离通过PCR检测(表3)。总的来说,发生的基因ciaB(100%),mviN(87%),tlyA(87%),cadF(80%)、pldA (78%)、cj1349(73%)和hecA观察(60%),形成鲜明对比hecB(22%),irgA(4%)和iroE(18%)的基因那么频繁。所有的假定的毒性基因被发现在所有45隔离,尽管每个孤立的基因数量为变量。35分离株(77.8%)包庇超过一半的基因化验,而两个分离株(4.4%)包庇所有10个基因和一个隔离(2.2%)只有一个基因。答:butzleri怀着一个显著(P < 0.05)更多的假定的毒力基因与non-buzleri隔离。此外,一些基因只有在检测到答:butzleri隔离。这是基因的情况下cj1349、hecB irgA pldA和iroE。

表3:假定的毒性基因的存在Arcobacter种虫害隔绝水。

关于协会的假定的毒性基因的来源隔离是值得注意的基因hecA显著(P < 0.05)的分离废水中更普遍比从河水(表3)。其他9个基因化验,虽然差异有时重要来源,统计分析显示没有关系的来源隔离和virulence-associated基因的流行。

比较基因型和假定的毒力基因,观察之间没有关系答:butzleri隔离,根据MLST和virulotyping数据。事实上,隔离可能拥有不同的virulence-associated基因密切相关。这是两个隔离的情况下分享ST461和那些分享ST467,但不同virulotyping计划每一对。

讨论

自从ICFMS [33)分类Arcobacter作为一个新兴食源性和人畜共患病原菌,进展甚微的流行病学和发病机制,这种细菌。恢复的难度Arcobacter从复杂的矩阵,以及缺乏在大多数医院实验室的常规检测,导致科学贡献的稀缺性等病原体相比其他近属弯曲杆菌(21]。所有这一切都有助于这一事实Arcobacter很少被认为是负责任的人类疾病,感染导致肠胃炎弯曲杆菌产生的类似。

的存在Arcobacter在水域主要相关答:butzleri,因为这是最常见的已知物种中分离水的来源。我们的结果证实了这些结果,因为隔离被确定为80%答:butzleri,这个物种最主要在废水和河水。这个优势可以是由于浓缩媒体通常用于恢复arcobacter年代,特别是支持的隔离答:butzleri(11,34]。其他原因,建议解释这个优势是他们的污水处理更大的生存能力,这将取代其他细菌的数量10,35]。我们也指出识别其他non-butzleri物种的难度。令人惊讶的物种多样性是在这项研究中发现non-butzleri隔离:四个不同物种的九个隔离。类似的研究结果发表等其他作者Jalava et al。12和冈萨雷斯等。36]。这一切使我们考虑的Arcobacter人口在水中,并可能在其他环境中,可能比发现更多样的物种。事实上,最近的符合Talay等工作。7),我们发现许多隔离显示最常用的m-PCRs之间不和谐的结果Arcobacter物种鉴定。尽管非常有用和验证,这两个m-PCRs [25,26不确定,或识别错,新Arcobacter检测到的物种。因此,识别这些隔离,m-PCRs应该同时使用和不和谐的结果应该研究,至少,通过测序基因rpoB。新物种的描述需要漫长而昂贵的多相研究这些不和谐的分离通常保持Arcobacterspp。然而,越来越多的新物种被描述,这表明Arcobacter仍然是一个属与越来越多的物种。因此它应该有准确的文化媒体极大的兴趣和/或识别测试,以促进经济复苏和以外的这些物种的识别答:butzleri。

的存在Arcobacter在表面水域很令人担忧,从流行病学的角度。随后使用这些水灌溉或娱乐水域增加接触和/或感染的风险雷竞技网页版Arcobacter人类和动物。事实上,一些与水有关的疫情描述虽然在某些情况下,是不可能从病人隔离剂(12]。考虑到这个风险增加隔离港毒力相关基因。根据我们的数据,所有地表水隔离检查携带一些假定的毒力基因,突出显著(P < 0.05)答:butzleri含有最多的。然而,这些结果可能再次被偏见,因为这些基因的引物用于检测基因组的设计答:butzleri。因此,当我们已经在先前的研究表明20.)有必要设计更具体的引物non-butzleri物种为了阐明是否答:butzleri是否真的积累更多的假定的毒性比其他物种的基因吗Arcobacter。在协议与其他研究集中在假定的毒性基因的流行答:butzleri从不同的主机和环境隔离20.- - - - - -23,37),最常发现的基因ciaB(100%),mviN(87%),tlyA(87%),cadF(80%),pldA(78%)和cj1349(73%)。这六个基因,主要是相关的粘附和入侵机制,被用来定义病变型(p型)5、由Piva et al。22),建议这个p型允许答:butzleri在不同的主机上保持竞争力在流通。5 p型的存在可以解释,反过来,更持久的物种在不同环境的网站。我们的结果支持这一假设,也指出可能的内容之间的关系假定的毒力基因和隔离的起源。情况就是这样的hecA基因,参与细胞的粘附,显著(P < 0.05)更丰富的废水中分离和比出现在更多的物种答:butzleri。这已经不是第一次这样一个协会被称为。在以前的工作,我们20.和其他作者19)发现hecA创是显著相关(P < 0.05)答:butzleri菌株分离蛤。其他作者如Laishram et al。23]表明,从粪便或食物源菌株携带更大比例的毒性基因相比,环境压力。然而,我们的研究结果只是部分支持这一假设。但尽管没有统计上显著的所有基因ciaB和hecA河水在更大比例的隔离从废水相比,粪便物质是丰富的。

树从MLST分析获得,虽然不健壮,揭示了高速率的遗传多样性答:butzleri人口,孤立的废水和河水。没有集群隔离观察的树,这是表明分散的人口。此外,大量的等位基因和新STs的确定,这是符合其他研究[11,17,18]。必须考虑,分析更高的隔离来自不同来源的数据,包括水,更准确的作业所需的数据基础。没有STs和virulence-associated基因的存在之间的关系,可能由于低的菌株数量检查在这项研究。

总之,我们调查了发生和人口的遗传多样性Arcobacter废水和河水,包括virulence-associated基因的存在。我们的研究结果证实答:butzleri作为最主要的物种和一个包含一个显著(P < 0.05)更多的假定的毒性基因以及高率的遗传变异性。至少一个基因,hecA,可以显著(P < 0.05)与隔离的来源,废水,尽管没有一个基因可能与一个特定的圣不过所有权证浓缩的进一步研究,因为大多数媒体和分子技术都是基于答:butzleri这可能是偏置赞成这个物种的信息。

Acknowlegements

本研究支持的西班牙经济和竞争力(agl2014 - 56179 p)和巴斯克国家大学UPV / EHU (PPG17/27)。赫克托•贝拉斯科是西班牙政府的资助的接受者(bes - 2009026202年)。

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