重金属抗性CZC基因识别在蜡样芽胞杆菌、肠杆菌属asburiae和铜绿假单胞菌分离从河床沙岛工业,Tamilnadu

文摘

微生物与金属的相互作用对环境可能会有一些影响。二价的主要耐药机制重金属,如锌+铜+和Ni2 +活跃流出转运蛋白。这篇文章探讨了锌耐药性细菌的分子基础通过确定znt-related基因的存在和比较序列获得这些分离株与发表的文学作品。也研究了蜡样芽胞杆菌的适应和这些znt基因的表达。重金属抗性基因确定了蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌asburiae。CZC基因观察铜绿假单胞菌和肠杆菌asburiae。锌运输腺苷三磷酸酶基因观察蜡样芽胞杆菌。

关键字

铜绿假单胞菌;肠杆菌属asburiae;蜡样芽胞杆菌

介绍

微生物可能会起到很大的作用在生物地球化学循环的有毒重金属也在医治metalcontaminated清理或环境(1]。“重金属”的术语,指的是金属元素原子质量高(> 100)和相对密度> 5。一些重金属,如钴、铜和锌,是必不可少的微量元素对生物系统,尽管他们可能在大量有毒。其他金属,如汞、镉和铅,在生理上不必要的和有毒的任何数量2]。根据机构有毒物质疾病注册表(有毒物质,2013),砷,铅和汞组成列表中的前三排名前20位的有害物质,而镉排名第七^th。环境中重金属污染的主要来源是化石燃料的燃烧,冶炼厂的操作和其他工业活动,如矿产开采与加工、酿酒和酒厂废物和农业化学物质的产生和使用2]。土壤中重金属不降低,许多被认为是持久的生物体内积聚的毒素(pbt)。

人类和生态系统健康的风险来自于土地的剩余工资取决于溶解度和pbt生物利用度这些污染物的residual-treated土壤。不确定性存在于土壤有机质分解的影响复合物结合的金属和不确定性的影响较慢的长期反应之间的金属吸附在土壤无机氧化物表面金属溶解度和生物利用度。最近的研究结果显示重金属,这些氧化阶段的有机固体(3]。重金属被氧化的表面可能会保持隔离时间比金属复杂有机天然有机物。然而,金属的氧化物的稳定性取决于金属和矿物表面氧化。长期的矿物结晶反应可能“逐出”金属从固相到解决方案。

材料和方法

PCR分析锌的存在基于zntA基因的抗性基因大肠杆菌

测试的一个典型Zinc-transporting腺苷三磷酸酶/ cation-transporting腺苷三磷酸酶,p型,引物的设计。的zntA基因的大肠杆菌编码一个锌(II) -translocating p型atp酶也被用于一些引物的设计4]。引物对被特别设计放大重叠碎片基于这些锌耐药基因全序列覆盖任何放大部分。PCR片段的大小和数字生产使用提供的各种底漆对初步估计的基因可能存在或缺席表1。

表1:PCR循环条件。

PCR混合组件:示例gDNA: ~ 50 ng;正向引物:400 ng;反向引物:400 ng;反向引物:400 ng;10毫米混合核苷酸:4μl;10 X AMTaq波尔。缓冲区:10μl;AMTaq聚合酶:3 U;PCR年级水:100μl体积。

重金属抗性基因的识别铜绿假单胞菌和肠杆菌属asburiae

的基因表达重金属抗性基因在假单胞菌和肠杆菌属的物种进行了研究。RNA分离试剂盒方法(5]。1毫升的三试剂添加每10平方厘米的玻璃直接溶解细胞培养板。溶菌产物被轻轻移液混合的几次直到同质悬挂成立。样品被转移到一个新的2毫升埃普多夫管和允许在室温下站5分钟。200μl氯仿然后添加每毫升的三试剂用于溶解。microfuge管涡几秒,允许在室温下站12 - 15分钟相分离。样本离心机在12000 xg 15分钟2 - 80°C。离心分离混合物倒入3阶段:一个红色的有机相(含蛋白质),间期(包含DNA),一种无色上层水相(含RNA)。上层水相转移到一个新的1.5毫升埃普多夫管和0.5毫升每毫升的三异丙醇试剂添加,紧随其后的是温柔的吸量。样品被允许站在室温下5 - 10分钟,离心机在12000 xg 10分钟40°C。 The supernatant was carefully aspirated off the tube, leaving behind the precipitated RNA pellets on the sides of the tube. The RNA pellet was washed by adding a minimum of 1 ml of 75% ethanol per 1 ml of TRA reagent. The sample was then vortexed and then centrifuged at 7500 xg for 5 minutes at 2-80°C. Note: Samples can be stored in ethanol at 2-80°C at upto 1 year at -200°C. The RNA pellet was air-dried and re-suspended in 20-30 μl of RNase free water. Preparation of RNA - (No DNA Contamination)

添加到一个RNase-free管

RNA: 1μg;10倍反应缓冲MgCl2: 1μl;DNase 1, RNase-free: 1μl;DEPC-treated水(# R0601): 10μl

管是在370°C的环境30分钟。1μl 50更易与EDTA和孵化650增加了10分钟。然后之前cDNA转换表2和3和图1。

表2:蜡样芽胞杆菌——金属电阻的基因。

表3:中使用的引物的细节铜绿假单胞菌和肠杆菌属asburiae。

基因1:(Zinc-transporting腺苷三磷酸酶/ cation-transporting atp酶、p型)底漆使用

正向引物:ATGGCTGAAGCGTTAGTGAAAAAGAAACT

内部引物:GTCGGTGGAGATATCGTTTGGAGA

反向引物:CTTATAAATCTTTCACTCGTAATACACGCAT

2号基因(锌吸收p型atp酶):引物:

正向引物:ATGAACTCAGAAGTAAAAACGTTACACGCA

反向引物:CGTTATTTGCTTCCTTTTAGTAATCGTAAGC

结果和讨论

识别(Zinc-transporting腺苷三磷酸酶/ cation-transporting atp酶、p型和2号基因:(锌吸收p型atp酶)蜡样芽胞杆菌

色谱的结果基因补充1中确定。实时PCR进行ABI 7900快HT序列检测器(应用生物系统,加州福斯特城。)(图2一个和2 b)。Q-PCR混合物包含SYBR绿色主人混合。退火温度、引物浓度和MgCl2浓度进行了优化。荧光测量是最后的温度斜坡时拍的照片。RT PCR扩增是使用这些特定的引物来研究基因表达δCT值。基因CZC PCOA,警察和NCC内生控制肌动蛋白。内生控制基因的基因表达水平不应在不同样本,如客房服务或维护基因。比较的CT值的目标基因与内生控制允许目标基因的基因表达水平(CZC PCOA,警察和NCC)是RNA、cDNA规范化的输入。CZC基因表达的调节(图3和4)这两种细菌,表示的CT值,而对于其他基因不表达(监管)。

CT < 29是强阳性反应表明丰富目标核酸样本

CT 30-37是积极的反应表明适量的目标核酸。

CT 38-40软弱反应表明最小数量的目标核酸可以代表感染状态或环境污染重金属耐受性相关的基因分离菌株的基因组内。

讨论

锌耐药基因蜡样芽胞杆菌

基因筛查包括zinc-transporting atp酶基因、锌吸收p型atp酶基因在铜绿假单胞菌和蜡样芽胞杆菌和CZC基因肠杆菌asburiae。积分p型膜atp酶是一种重要的类离子运输蛋白,为保持合适的离子的条件。“p型”一词是指形成phosphoenzyme中间反应周期。释放的能量的移除从ATP gama-phosphate耦合离子在生物膜的易位。基质无机阳离子如H⁺,Na⁺K⁺、镁^{2 +}、钙^{2 +}、铜⁺、银⁺、锌^{2 +}、Cd^{2 +}、有限公司^{2 +}和铅^{2 +}。p型ATPase-based耐锌据报道在大肠杆菌和p . putida应变S4 [5]。ZntA p型atp酶的大肠杆菌一直预测zinc-specific运输车的第一个例子,基于近序列同源性的金黄色葡萄球菌的每atp酶和atp酶幽门螺杆菌酶,影响细胞锌含量。p型atp酶调节电阻也带来锌镉effux在大多数情况下,在p型atp酶运输锌只穿过细胞质膜[6]。p型ATP酶构成总科运输蛋白质运输离子的浓度梯度利用ATP水解提供的能量。

重金属抗性基因的基因表达在假单胞菌和肠杆菌属的物种

分析基因表达的变化是一个重要的基础和应用研究的一部分。北部污点,槽/点污点,DNA阵列,和逆转录(RT) - PCR分析建立技术来估计基因表达率,例如,在不同生长条件下。基因CZC PCOA,警察和NCC B与内生控制肌动蛋白研究铜绿假单胞菌和肠杆菌asburiae。存在CZC铜绿假单胞菌的基因表达。这三个结构基因czcCBA tricistronic信使rna的转录6200核苷酸(7]。这三个基因编码的结构基因地区位于czc行列式的中心。两个监管区域侧面结构基因上游调控区和下游地区的监管。九czc基因转录方向相同。这也表明CZC行列式不是物种之间的具体和广泛传播细菌隔绝完全不同的地理位置。最好的研究锌耐药机制是Ralstonia Czc系统操作,Gramnegative土壤细菌。Czc系统赋予耐镉、锌、钴在r . eutrophus应变CH34函数作为阳离子/质子转运体流出阳离子从细胞8,9]。czc行列式编码抗Cd^{2 +}、锌^{2 +}和有限公司^{2 +}由metal-dependent流出(10)由质子动力(11]。

引用

1. 西班牙a .微生物重金属耐受性的影响环境。牧师本科生Res.2003; 2:1-6。
2. 盖得通用。金属和微生物:一个定义的问题。《列托人。1992;100:197 - 203。
3. Hettiarachchi通用、et al。铁和锰氧化物的作用在金属有机和biosolids-amended土壤绑定。ChemSoc,华盛顿特区。论文摘要,223 ACS国家会议,Orlando2002; 124年。
4. 仁瑟C, et al . zntA基因的大肠杆菌编码锌(II) -translocating p型atp酶。ProcNatlAcadSci U S a . 1997; 94:14326 - 14331。
5. 麦基Chomczynski P和k .试剂盒试剂程序的修改隔离的RNA多糖和proteoglycan-rich来源。生物学技术。1995;19:942 - 945。
6. 胡子SJ, et al。运输的证据锌(II)通过坑无机磷酸盐离子运输系统在大肠杆菌。《列托人。2000;184:231 - 235。
7. DH。微生物重金属抗性。生物科技:Microbiol》。1999; 51:730 - 750。
8. Van der Lelie D, et al。双组分重金属体内平衡的监管体系参与转录控制产碱杆菌属eutrophus。摩尔Microbiol。1997; 23: 493 - 503。
9. Choudhury R和斯利瓦斯塔瓦美国锌在假单胞菌耐药性机制putida S4。世界生物科技JMicrobiol》17:149 - 153。2001;
10. Nies DH, et al .表达式和核苷酸序列plasmid-determined二价阳离子流出系统产碱杆菌属eutrophus。Proc NatAcadSci USA.1989;86:7351 - 7355。
11. DH。钴、锌和镉流出系统CzcABC从产碱杆菌属eutrophus函数作为cation-proton逆向转运在大肠杆菌。J Bacteriol。1995; 177:2707 - 2712。