高效和稳定的青霉菌sp的RNA干扰载体建设。

文摘

RNA干扰(RNAi),它可以拒绝具体有效的基因表达,显示巨大的潜力在基因功能研究及基因修改。在这项研究中,RNA干扰向量pHX-RNAi,潮霉素抗性盒和一个转录单位发卡RNA表达构造。amy15A基因编码产生的主要淀粉酶高纤维素酶生产菌株特异oxalicum A11目标击倒。sds - page和RT-qPCR的结果表明,转录和分泌水平的Amy15A急剧衰减,这暗示RNAi发挥重要作用在调节基因表达转录。所有的hygromycin-resistant转化株的消声结构显示高度的沉默amy15A的表情。考虑到保守主义RNAi机械的真菌,RNAi向量建立在这项研究中,pHX-RNAi可以应用到其他丝状真菌。

关键字

RNA干扰,青霉菌oxalicum;丝状真菌;淀粉酶、Amy15A PHX-RNAi质粒

介绍

核糖核酸干扰(RNAi)是一个转录后基因沉默机制,广泛存在于真核生物。RNAi是由双链RNA(极)或微RNA (microRNA)和降解特定的信使RNA (mrna) RNA-induced沉默复杂(RISC),然后它特别损害目标基因的表达(1,2]。因此,RNAi已经成为一个有效的工具来探索基因功能(图1)。

RNAi一直是一个引人注目的技术在动物和植物物种的研究[3,4]。然而,这没有被广泛用于基因沉默的工具丝状真菌。一般来说,调查在真菌基因功能是通过基因删除。然而,传统的基因淘汰赛不工作当polykaryocytosis和异源重组通常发生在丝状真菌。特别是,一些功能基因对细胞活力至关重要,因此他们删除是致命的。相对于基因淘汰赛相对复杂和费时,RNAi更适合学习那些重要但致命的基因。极目标基因的RNAi是必要的。有两种策略来生成dsRNA:一是合成dsRNA体外直接转移到细胞(5,6];,另一个是介绍一个序列可以表达dsRNA或发夹结构对目标基因mRNA为基因组(7,8]。第一个经常被用于哺乳动物细胞,但它不是广泛应用于真菌由于RNA干扰的不稳定性9]。相对于第一个,第二个策略是更适用于真菌的高转换效率和持续dsRNA的形成。向量表达式pSilent-1据报道已经应用于曲霉菌和一些干扰效果取得了绿色荧光基因egfp和其他基因10]。他们的研究表明RNAi可能是一个有用的丝状真菌的基因改造工具。然而,pSilent-1不稳定时应用青霉菌sp.可能由于其多拷贝功能元素(两份trpC启动子和终止),导致self-recombination消除和功能元素。最近,王等人的表达增强纤维素酶和木聚糖酶通过RNA干扰aceI基因木霉属koningii(8]。和秦等人改进了重组脂肪酶生产通过下调RNAi CBHI的t . reesei [11]。这是强烈表明,RNAi-mediated基因沉默可能会非常有效地应用于丝状真菌。

青霉菌oxalicum是一个快速增长的纤维素分解真菌,其突变株自1996年以来一直用于工业生产纤维素酶(12]。的基因组p . oxalicum野生型菌株114 - 2已经测序(13]。编码转录因子的基因,染色质重塑带注释的蛋白质和G蛋白亚基,在调节基因表达及其功能的多种纤维素酶和淀粉酶阐明(14,15]。一些基因注释作为多种纤维素酶的转录因子表达尚未研究,因为他们不能获得的突变体基因淘汰赛。

淀粉酶对一个具体的酶活性极高,占总细胞外蛋白质的40%以上p . oxalicumA11当培养小麦bran-cellulose [16,17]。本研究的目的是构建一个向量可以用于通过RNAi在丝状真菌基因表达的下调p . oxalicum。在这里,我们建立了质粒骨干的pHXRNAi质粒pUC19, amy15A被选为记者核实pHX-RNAi因为方便检测的效率。此外,没有观察到影响应变增长尽管amy15A被删除(17),这使它适合验证向量构造的影响。

方法和材料

菌株和文化条件

大肠杆菌DH5α作为宿主菌株重组质粒结构。的大肠杆菌应变是种植在Luria Bertani(磅)汤,氨苄青霉素(100μg /毫升;英杰公司)必要时补充。p . oxalicum114 - 2 (CGMCC 5302) (18),是一种野生型糖苷hydrolase-producing压力。p . oxalicumA11生成从p . oxalicum114 - 2的主导性acitivating G蛋白PGA3 [19]。分生孢子收集的p . oxalicum栽培对小麦麸皮在30°C 3 d (20.]。对基因组DNA提取,分生孢子接种沃格尔的媒介补充1%葡萄糖作为碳源和培养48 h (21]。基因组DNA的p . oxalicum114 - 2是用作PCR模板。转化株,被选中的原生质体培养筛选培养基与400μg /毫升潮霉素b .淀粉酶生产菌株在液体葡萄糖precultivated媒体(傅高义的媒介与1%葡萄糖作为碳源)18 h。然后,0.5 g湿菌丝被转移到100毫升淀粉酶发酵媒体(傅高义的媒介1%可溶性淀粉作为唯一碳源)和培养30°C, 200 rpm。纤维素酶的生产,pre-cultivated湿菌丝(0.5 g)转移到纤维素酶发酵媒体(傅高义的媒介1%纤维素为碳源)和培养30°C, 200 rpm。

质粒构建

基因组DNA是孤立的菌丝p . oxalicum114 - 2使用[17],描述的方法之前,所有的质粒应用于本研究新建如下。

建设hph标记包含向量k-hph: 1.9 kbHindIII/ SphI片段包含hph ORF区域与多个限制性内切酶切割网站使用的hph形成质粒pSilent-1作为参考。然后用底漆对hph的片段是放大Hphs-F (HindIII)和Hphs-R (SphI)。hph的片段被限制性内切酶消化是插入HindIII/原始质粒pUC19 SphI网站。

构建表达载体K -hph- p的pgmC: 470个基点的终结者trpC片段包含EcoRI /尚驰放大由质粒PCR pSilent-1使用底漆对Ttrp氟(尚驰)和Ttrpc - r (EcoRI)。然后,879年英国石油公司发起人的包含SphI pgmC / PstI放大p oxalicum 114 - 2基因组DNA通过使用底漆Ppgm-F (SphI)和P的pgm- r (P圣我)。两个DNA片段(TtrpC和P的pgmC)限制性内切酶消化的插入到质粒K -hph通过尚驰/ EcoRI和Sph值我/ PstI分别。由此产生的表达载体被指定为K -hph- p的pgmC。

构建RNAi表达载体PHX-RNAi: 134个基点合成内含子片段的p . oxalicum PGA3基因包含PstI,年代艾尔我,B.和X巴姨,K句,尚驰是插入PstI / K -尚驰的场所hph- p的pgmC生成矢量PHX-RNAi RNAi表达式。

建设艾米15一个干扰向量pHX-amyi:两个DNA片段(amy15一个,amy15A+)amy15A(EPS34453)被使用两对引物PCR扩增iamyF2 (尚驰)/ iamyR2 (XbaI)和iamyF1 (PstI)/ iamyR1 (BamHI),分别。然后amy15A- - -amy15A+是反向插入RNAi表达载体PHX-RNAi使用限制性内切酶尚驰/ XbaI和PstI / BamHI。这个向量被指定为amy15A向量pHX-amyi干扰。

在这项研究中使用的所有引物中列出表1。

表1。引物用于本研究;限制酶位点序列展露无遗。

真菌的转换

的原生质体转变p . oxalicum如前所述(执行22,23]。10μL的质粒DNA和100μL原生质体被传播到选择板块包含400μg /毫升潮霉素B和转化株被选中。候选人的分生孢子转化株被进一步蔓延到潮霉素B选择板块,形成单一的殖民地。

的分析艾米15 sds - page的分泌

sds - page进行聚丙烯酰胺凝胶板和凝胶染色与考马斯亮蓝r - 250 (Sangon生物技术,中国)。32μL文化浮在表面的每个应变加载。

表型分析

分生孢子长在PDA上的所有菌株都收获后3天在30°C。等分的分生孢子菌株接种在葡萄糖,淀粉或纤维素板4天在30°C。

酶活性的分析

淀粉酶活性化验根据以前描述的方法(24]。大量的释放还原糖测定使用二硝基水杨酸方法(25]。一个酶单位(U)被定义为所需的酶量每分钟释放1μmol葡萄糖当量。

的分析艾米15定量PCR的转录水平

总RNA提取,互补脱氧核糖核酸的合成和定量实时PCR (RT-qPCR)进行如前所述[26]。RNAiso试剂(豆类、日本)用于总RNA提取,和PrimeScript RT试剂盒gDNA橡皮擦(完美的实时)(豆类、日本)是用于互补脱氧核糖核酸的合成。定量rt - pcr进行罗氏480 LightCycler(罗氏,曼海姆,德国)使用SYBR预混料交货Taq™(完美的实时)(豆类、日本)。定量rt - pcr分析,每个基因进行了一式三份,利用引物。每个放大反应的反应总额中进行20μL。热循环协议如下:最初的变性在95°C 2分钟紧随其后40周期10年代在95°萤石30年代在61°C。荧光信号测量的每个扩展步骤在80°C。肌动蛋白基因的转录数量相同的样本被量化为一个内部标准。每个样本进行两个生物复制和复制三个实验。肌动蛋白基因作为内部标准。

结果

RNAi矢量pHX-RNAi和pHX-Amyi建设

密码子优化的抗潮霉素B基因hph是扩增和插入pUC19因此向量菌进行k -hph包含选择标记基因hph生成(图2一个和2 b),然后TtrpC和P的pgm插入到K - Chph构建一个表达式向量K -hph- p的pgmC (图2 c和二维)。内含子片段的G蛋白亚基PGA3基因插入到K -hph- p的pgmC构建RNAi表达载体pHX-RNAi (图3一)。然后amy15A- - -amy15A+是反向插入RNAi表达载体pHX-RNAi建造一个amy15A——沉默向量pHX-Amyi (图3 b- - - - - -3 d)。施工过程的RNAi向量在这项研究中所示图2。PCR验证(数据未显示)限制性内切酶消化和测序分析被执行来确保目标片段插入到适当的位置向量和没有突变(图4)。

一代的p . oxalicum amy15A沉默的菌株

测试的效率PHX-RNAi基因amy15A被选为记者。重组质粒的PHX-Amyi转化为p oxalicum A11击倒amy15A表达式。PCR分析表明,表达式的碎片从上游的盒式hph promoter-p表达盒通用汽车C分别放大应用来验证PHX-Amyi表达盒是否完全集成到转化株的基因组。最后,PCR分析表明,所有的七个随机选择的转化株包含完整PHX-Amyi表达盒(数据未显示)。这七个积极的转化株被分配Amy15Ai-1、Amy15Ai-2 Amy15Ai-3、Amy15Ai-4 Amy15Ai-5, Amy15Ai-6,和Amy15Ai-7。

下调表达的Amy15A RNAi介导的基因沉默

这些积极的转化株种植在摇动烧瓶淀粉作为唯一碳源。这些转化株的细胞外蛋白质分泌培养基上清液通过sds - page分析。确保相同加载的样本,32μL文化上层清液培养后每个应变加载1% (w / v)淀粉培养基。

所示图5,而应变A11淀粉酶Amy15A沉默的转化株显示削弱了乐队,乐队在70 kDa,符合Amy15蛋白由636个氨基酸(22]。结果表明,发夹RNA-induced沉默收益率沉默菌株显示明显的效应蛋白分泌。

原始菌株A11 amy15A沉默Amy15Ai在琼脂平板培养研究生长特性和碳源利用率。结果,转化株Amy15Ai显示菌落直径没有显著差异,分生孢子生产能力相比,A11葡萄糖或纤维素(图6)。

为了证明淀粉酶的表达是衰减,我们发现淀粉酶活性的菌株。淀粉酶活性显著降低观察突变体Amy15Ai培养时淀粉或纤维素(图7)。

确认沉默amy15A在p . oxalicumA11的表达水平amy15A被RT-qPCR进一步发现在不同的时间点(12 h, 24小时,36小时)在不同碳源(淀粉或纤维素)。为了说明干扰基因的稳定性amy15A重组菌株,Amy15Ai-1、Amy15Ai-2 Amy15Ai-3, Amy15Ai-4亚文化的五轮(一轮持续了5天)在固体培养基中含有潮霉素B和转化株进一步培养摇动烧瓶以淀粉或纤维素为唯一碳源的RNA提取。所示图8重组菌株显示更低表达水平相比,淀粉或纤维素诱导条件下的应变A11。我们设计了两个检测站点附近的一个片段5的终端或3终端amy15A基因mRNA (amy15A1和amy15A2),关于这两个检测站点的类似RT-qPCR分析结果表明,RNAi摧毁整个基因的信使rnaamy15A。这些结果表明,沉默amy15A很容易诱导和rna介导吗基因沉默是稳定的、持久的和高效的。

讨论

RNAi已经被证明是一个有效的工具在各种真菌基因沉默。一些RNAi向量dsRNA代报道,pSilent-1等被应用于曲霉菌。然而,pSilent-1不稳定时应用青霉菌sp.可能由于其多拷贝质粒导致self-recombination功能元素。pHX-RNAi作为RNAi向量构造在这项研究中,显示一个高效和稳定效果时使用的目标amy15A。特别是pHX-RNAi沉默基因p . oxalicum表现出较高的转换效率,支持的初步观察amy15A表达式显示显著下调所有选中的转化株,这个功能会在转化株的选择提供更多的便利。

RNA沉默系统成立于一些丝状真菌,如t . koningi、t . reesei和葡萄孢菌(27- - - - - -29日]。在这些研究中,不同的荧光蛋白作为记者。相比之下,内生淀粉酶是记者在工作中,开发和转化株可以用来调查障碍的淀粉酶的影响纤维素酶的合成。王等人提高了纤维素酶生产沉默监管者Cre1或傻乎乎。和秦等人增强脂肪酶的沉默的表达主要内生的基因(11]。所有上述报告表明这是可能通过抑制淀粉酶基因,提高纤维素酶的合成或其他高表达基因在纤维素分解真菌p . oxalicum。

同源重组发生在较低的频率在丝状真菌和多个基因操作困难的限制筛选标记。因此,使用RNAi来调节基因表达的研究提供了一种方式有趣但致命的基因,更重要的是,它提供了一个可能的方法,多种基因修改(30.]。此外,我们可以控制基因沉默的程度通过改变促进剂具有不同的强度。极的表达可以诱导启动子引发的,比如本构强/弱启动子,condition-dependent启动子,可以切换目标通过添加诱导的基因沉默。因此,目标基因可以在适当的时候保持沉默和分析它们的功能在特定时期的增长31日]。

RNAi也有不可替代的优势在丝状真菌蛋白表达系统的建设。最近,蛋白质的合成和分泌过程中广泛研究了丝状真菌。然而,是否分泌途径影响其分泌的蛋白质相互作用是不清楚32,33]。能力强的菌株蛋白质分泌通常选择作为外源蛋白表达的宿主。但目标蛋白的高水平总是不能实现即使有更强的启动子,因为压力在细胞内蛋白质折叠和修改宿主菌株,如CBHIt . reesei纤维素酶和淀粉酶答:oryzae(11,34]。考虑主机高度表达的基因可能导致饱和的机械参与蛋白质折叠和组装的分泌蛋白,通过RNAi调节宿主基因表达的高度可以提高靶蛋白的分泌。此外,它可以避免残疾人利用底物造成的基因缺失,如CBHI t reesei [35]。

结论

在这项研究中,淀粉酶的基因amy15A被证明是成功的干扰通过构建质粒pHX-RNAi和RNAi标记在mRNA水平和稳定的影响。基因的沉默amy15A在这个实验中显示,pHXRNAi可能发挥重要作用的基因修饰和基因功能分析青霉菌oxalicum。考虑在真菌,RNAi机械的保守主义pHX-RNAi可以应用到其他丝状真菌。

确认

本研究在经济上支持中国国家基础研究计划(2011 cb707403),国家自然科学基金(31030001、30970052、30970052),国家关键技术研发项目(2011 bac02b04),中国和国家高技术研究发展计划(2012 aa022203b)。

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