关键字 |
同源性,chorismate合成酶,布鲁氏菌melitensis |
介绍 |
人间布鲁氏菌病 |
布鲁氏菌病马耳他(地中海/ /布鲁氏菌病)是最重要和最常见的人畜共患病之一在世界上影响牲畜和人类的特征波折磨受害者的体温的变化。其现代名称熊向大卫·布鲁斯,军队医生发现病原体[1 - 3]。直接与经济地位的一个标志疾病[4]。 |
病原体和传播方式 |
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属的细菌引起的。这些都是兼性胞内革兰氏阴性细菌。布鲁氏菌melitensis存在和传播的山羊和绵羊和相关动物和对人来说是最致命。b .流产牛和占主导地位的物种b是主要局限于猪[5]。这些是归类为生物制剂,被指定为选择的代理人类别B在亚特兰大疾病控制中心,美国[1,2]。布鲁氏菌感染的传播和流行的地区取决于几个因素,比如饮食习惯,方法,加工牛奶及奶制品、社会习俗、管理实践、气候条件、社会经济地位和环境卫生。布鲁氏菌病是几乎总是从感染家畜传染给人。人类的布鲁氏菌病是发现在农村/游牧社区人们住在与动物密切联系[2]。 |
印度的情况 |
在世界范围内,报告人间布鲁氏菌病流行疾病发病率地区差别很大,从< 0.01 > 200年每100000人口。然而,真正的人间布鲁氏菌病发病率是未知的对大多数国家包括印度。在印度80%的人口生活在村庄和密切接触动物由于他们的职业,因此获得布鲁氏菌病的风险更大。雷竞技网页版这种疾病有一个额外的重要性在印度这样的国家,那里条件有助于人类感染广泛的不卫生的条件和贫困。几个发表包括最近的报告表明,人类的布鲁氏菌病是安静的在印度常见的疾病[2]。布鲁氏菌病在人类出现在所有年龄组和雄性和雌性都是同样的影响。布鲁氏菌病的儿童可以在特定地区很常见b . melitensis。感染也可能通过削减和擦伤皮肤,通过结膜和吸入[5]。 |
临床表现 |
动物布鲁氏菌病造成巨大的经济损失由于流产,早产,降低牛奶生产和繁殖率下降[1]。人间布鲁氏菌病千变万化的表现而闻名。然而,最常见的症状是发烧。最常见的症状和体征是表1中列出。Epididymoorchitis是最常见的男性生殖泌尿系并发症。布鲁氏菌病在怀孕期间构成实质性的风险自然流产或宫内传播感染的婴儿[2]。因此,布鲁氏菌病是一种multi-systemic疾病显示广泛的临床多态性(表2)[6、7]。Osteoarticular、肠胃、肝胆的呼吸道、泌尿生殖器的并发症。骨和关节并发症最常见的并发症。脑膜炎和meningo-encephalitis neurobrucellosis是最常见的并发症。 Complications of the cardiovascular system are rare but important as they have a high degree of mortality. Other examples of rare complications are those of skin and eyes [5]. |
可用的治疗 |
目前,抗生素治疗的动物是系统地气馁和高度管制。有限数量的有效抗生素和潜在的意外或恶意的抗生素抗性引入生物强调需要替代方案[4]。虽然疫苗接种可能是最经济控制措施,管理现有的布鲁氏菌病疫苗本身并不足以消除任何主机物种[8]。有限数量的抗生素,在人类中,对这些生物是有效的。的副作用药物组合方案和复发的高发病率和治疗失败,导致新药物来治疗疾病的调查[6]。最有效,至少对人类有毒化疗布鲁氏菌病还没有决定[9]。没有疫苗可用于布鲁氏菌病的预防人类[5]。 |
因此,我们目前的工作包括发现这部小说特定的目标分子b . melitensis可有效治疗人类布鲁氏菌病在人类。 |
材料和方法 |
比较代谢组学研究 |
Rahnuma是预测和分析的工具的代谢途径和代谢网络的比较[10]。比较分析类型的生物模式的标准比较完整的网络比较运行对人类(智人、hsa)和brucellae (b . melitensis,bmi)。输出表格文本文件包含许多反应可分为人类独有的反应,反应目前仅在brucellae和反应常见的生物。作为我们的主要目标是找到brucellae目标具体,反应brucellae独有的选择深造。 |
目标识别 |
KEGG通路数据库中的代谢途径分析[11]是有两个原因,首先是确保chorismate生物合成显著不同的或没有在人类和第二是确认没有备用chorismate生物合成的途径melitensis。在研究中,我们观察到的反应由酶催化chorismate合酶导致形成分支酸(ID R01714 KEGG反应)。这个反应是brucellae独特的礼物,不是人类,成为一个有吸引力的治疗目标分子。进一步的瓶颈进行了分析通过使用MetExplore数据库[12]。 |
建模的Chorismate合酶 |
chorismate合酶的氨基酸序列b . melitensis从UniProtKB检索/ Swiss-Prot与加入数字P63607 [13]。这是受到BLAST-P(14、15)使用PDB NCBI数据库[16]利用爆炸服务器。进一步措施协议进行建模使用分析员9 v3是一个计算机程序,模型满足蛋白质的三维结构及其组件的空间限制。3 d模型得到优化的分子的概率密度函数(pdf) [17]。 |
模型评价 |
模型由分析员9 v3首先评估使用结构叠加[18]其次是像QMEAN运行标准评估测试分数[19],ProCheck [20], ProSA[21]和Verify3D [22]。由此产生的模型可视化在PyMol v0.99 (w·l·德拉诺等)和蛋白质模型中提交数据基础[23]党ID PM0078183)。 |
结果与讨论 |
在基因组学和蛋白质组学最新进展已经导致一代的巨大的蛋白质组学以及生化数据。生物体的代谢信息具体是现在KEGG数据库中可用。整个metaboloms现在可能比较像Rahnuma使用工具。比较代谢组学方法[24]可以用来识别新的药物靶点。必须有三个主要的属性,任何的治疗目标。首先,它必须是唯一的病原体,使其失活只会阻碍病原体的生理机能,而不是主人。其次,它必须在病原体代谢中发挥重要作用,使其失活会导致病原体的有害影响。第三,密切同族体靶蛋白不能出现在主机中,同源染色体的趋势是分享共同的结构建筑。化学剂用于调节目标的活动可能会妨碍其同源目标分子的功能主机有时产生严重的负面影响。 |
比较代谢组学分析 |
输出文件从Rahnuma从我们的分析显示,共有1932反应出其中1114(58%)反应是人类特有的,387(20%)的反应出现在brucellae只剩余431(22%)反应是常见的人类和brucellae(图1)。 |
目标分子 |
Shikimate通路被发现的生物合成途径的芳香族氨基酸苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸。这个途径已被证明是只存在于微生物和植物。Shikimate通路的第七段,即最后一步是磷酸的共同lP-Trans消除5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP)收益率chorismate。Chorismate合酶与减少黄素催化这个反应(图2)[25]。这样,我们的研究表明,这个反应是唯一出现在病原体。此外,chorismate池所需的细胞等芳香族化合物的合成维生素K,泛醌或p-aminobenzoate [26]。这些事实表明,chorismate病原体生理学合成酶有至关重要的作用。 |
人类爆炸结果显示没有明显的身份/序列相似性对目标分子。拥有获得的点击率非常贫穷的查询范围和有很高的价值。这清楚地验证,没有亲密的相同器官chorismate合酶存在于人类。的瓶颈分析证实,chorismate合酶催化反应瓶颈b . melitensis。瓶颈反应被定义为一个反应,独特的特定底物消耗或独特的产生一个特定的产品。这种反应的失活导致毒性由于积累或饥饿由于消耗特定病原体的代谢物,从而增加它的重要性在药物设计。 |
模板识别和序列分析 |
BLAST-P搜索执行旨在确定合适的模板chorismate合成酶b . melitensis和取得了7支安打可比价值和一些分数。最重要的是chorismate合成酶的FMN复合体的结构幽门螺杆菌(PDB ID 1 um0)拥有96%的查询覆盖率和分享41%的序列的身份与查询序列。模板识别也证实了Geno3D服务器(27、28)。chorismate合酶的序列比对b . melitensis和幽门螺旋杆菌表明存在两个插入75 edgbtm80和273 dgkpi277归纳chorismate收购新主题的演化路径,从b . melitensis合成酶。关注FMN结合位点,这似乎是在两个高度保守的序列(图3)。三个签名主题本质上是存在于所有家族成员chorismate合酶[29]还发现相当保守在b . melitensis chorismate合成酶,然而这些图案的结构和功能意义尚未被发现。这些主题被发现存在守恒的所有六个chorismate合酶序列幽门螺旋杆菌(图4)。这三个主题的形式存在于16 geshglalgcvvdgcp31 129 grssaretaarvaagai145和329 rhdpcvgiravpigeam345 chorismate合成酶b . melitensis |
我们也观察到的顺序保存酶循环,其中四个是出现在所有的子单元,而剩下的两个是局限于B和C子单元chorismate合酶[29]。这些区域对应于15WGESHGLAL23,50RKPGQSKYTTQRREPDQVR68年,91年IENTDQRSKDYGEIAR106年,122年GIRDYRGGGRSSARE136年262年EENADEMRMGNDGKPI277年和308年ILTPRRSIDKDGNEVDVMTRGRHD331年进一步将称为循环L1-L6。除了L5循环,其他五个循环FMN周围存在结合位点(图5)。所有这些循环包含高度保守的氨基酸残基的活性部位。 |
同源模型总是依赖的可靠性结构模型的质量。因此,它是非常重要的,以确保这项研究中使用的模板的质量很好。b因子(原子位移/温度因素)使信息流动中每个原子的结构。这种b因子反映了原子的热运动和静态障碍程度的蛋白质晶体结构[30]。好的模型应该意味着b因子值低于60 A2。模板中,链平均B-factors A和D大大降低,分别为36.9和36.8 A2,比其他两个链B和C,分别为49.3和53.6 A2 [29]。晶体r因子是最广泛使用的参数测量实验测量的振幅反射之间的分歧和蛋白质模型。它平均坐标误差的估计蛋白质晶体结构。对蛋白质结构解决了高雅的分辨率比2,平均坐标误差范围在0.2 - -0.3 [31]。1 um0,无论是晶体的价值,意味着b因子(44.70)和热阻(0.24),落在阈值。 |
考虑到上述事实,我们决定选择chorismate合成酶幽门螺旋杆菌在我们的研究模板。 |
同源模型生成 |
分析员9 v3被允许从四种单体生成五个循环模型模板链,B, C和D(表3)。我们选择的5个循环模型从每个单体生成模板根据其分子的概率密度函数(pdf)值。一般来说,模型有最低分子pdf值优先。因此,Model_2、Model_5 Model_3 Model_4被选为apo形式从模板链,B, C和D,分别。 |
后来等杂原子单核苷酸FMN和水分子被合并到单个的单体模型通过使用DeepView / SPdbV 3.7[32]产生整体的各个单体形式。四级结构(四聚物)又进一步产生的合并这四个整体形式的个别单体用上述同样的方法(图6)。 |
结构叠加 |
同样的序列比较,可以提供巨大的洞察的起源、功能、位置、交互和给定的蛋白质的活动,也可以结构比较。事实上,因为结构实际上是守恒的多序列,结构比较让我们看得更远一些回生物史前史。最常见的方法,被称为三维(3 d)结构比较结构叠加。叠加或叠加的过程就是旋转定位对象,直到它可以直接覆盖在一个类似的对象。均方根偏差(RMSD)值表示程度的叠加。通常较低的价值更多的是叠加的程度和更紧密的结构。生成的模型显示了骨干RMSD值0.5 3.7原子比模板使用DeepView / Swiss-PDB查看器应用程序。这些数字说明该模型生成的在这个研究是非常接近实验验证模板结构。 |
QMEAN得分 |
QMEAN(定性模型能量分析)是一个综合得分函数,估计全球的质量模型的基础上的线性组合6结构描述符,其中四个是统计潜力意味着力量。分数反映了全球模型预测可靠性从0到1。QMEAN评分模型的预测为0.691,与模板的得分为0.762。 |
ProCheck |
ProCheck评估stereo-chemical给定的蛋白质结构的质量。模型的分析显示98.8%的残留物的存在有利地区和总质量G-factors发现-0.2指示其良好stereo-chemical质量(表4)(可接受的g因子值介于0和-0.5)。 |
验证三维 |
Verify3D结构评估服务器的兼容性分析原子模型(3 d)的氨基酸序列(1 d)。分数范围从1(糟糕的分数)+ 1(好成绩)。在分析验证的3 d数据,348(95.6%)的364模型中残留有分数高于0.2(图7)。活性位点残基的分数范围从0.3到0.6,表明活性位点残基是协调与模型三维结构。残留有分数低于0.2259年GFEAARLTGEENADEM274年这甚至不属于活性部位附近。 |
ProSA |
ProSA工具广泛用于检查3 d模型的蛋白质结构潜在的错误。ProSA能源情节的单体模型(图8)显示负值为所有残留表示模型中没有任何错误。 |
二级结构分析 |
二级结构分析和界面交互在单体通过使用Web服务器PDBsum [33]。每个单体模型由9α-helices(除了单体B和D,分别是8岁和10岁)和13β-strands(除了单体C和D,分别是15和12)。详细的二级结构信息和super-secondary元素从服务器获得表5所示。 |
每个单体的核心包括β-α-β三明治褶皱是发现在实验验证chorismate合成酶表明蛋白获得了所需的褶皱(图9)。β-α-β三明治褶皱是由四个α-helices夹在两个反向β-sheets包含四个β-strands两侧。 |
成对所有四个单体的结构对齐显示RMSD值在0.69至0.83的范围为骨干原子只表明这些不对称单位高度相似的结构。这些值比实验解决chorismate合成酶的结构幽门螺旋杆菌。 |
Inter-Chain单体的交互模型 |
单体相互作用在氢键等多种交互,盐桥和键作用力如表6所示。图10展示了氢键和盐桥链和D之间的模型。 |
FMN Chorismate合酶结合位点 |
chorismate合成酶的活性部位的准确性b . melitensis通过执行检查其结构与实验解决结构幽门螺旋杆菌。残留的RMSD值在活性位点被发现0.61骨架原子只显示很高chorismate合成酶的活性部位的准确性b . melitensis。黄素单核苷酸FMN结合位点是高度保守的模型和的模板[29]。chorismate合酶的结合位点模型由以下严格守恒的残留物112年他的131年参数,133年爵士,140年参数,243年Asn,246年赖氨酸,303年赖氨酸,305年刺,307年爵士,331年Asp和337年Arg链和288年从链g D(图11)。 |
FMN的结构由两部分组成:头由异咯嗪环和尾地区由ribityl链。这两个结构部件与残留的交互的活性部位(图12)。O4原子与氨基异咯嗪环形成氢键的原子337年参数。水分子的桥梁它们异咯嗪环和OD2原子的331年通过形成氢键网络Asp。ribityl羟基组这里*,OH4 *和OH5 *使氨基原子的氢键131年参数,噩原子133年爵士和新西兰的原子303年分别赖氨酸。ribityl磷酸基也参与氢键。O2P的氧原子和O3P OD1原子的氢键形式243年Asn和N原子的288年通用电气的,分别从链D。两个水分子形成氢键的氧原子O2P O3P ribiyl磷酸基。也有弱的形成盐N原子之间的桥梁246年赖氨酸和O1P ribityl的磷酸基的氧原子。 |
的氧化还原电位单核苷酸FMN强烈依赖于电荷的存在。是证明了正电荷的增加,而负电荷降低氧化还原电位的FMN [34]。在我们chorismate合酶模型,二甲苯的疏水环境存在一部分异咯嗪环的FMN和三个带正电的残留物131年参数,246年赖氨酸和303年赖氨酸直接与ribityl链和FMN ribityl磷酸基的。因此FMN结合位点的静电势chorismate合酶似乎在绑定中发挥非常重要的作用和激活的FMN(图13)。 |
附近一个正电荷N3-C4 = O4轨迹异咯嗪环稳定带负电由于N1黄素从而降低服务两个目的:喜欢黄素绑定和调节代数余子式的氧化还原性质[29]。因此,337年参数可能发挥重要作用在绑定和激活减少FMN chorismate合成酶。 |
结论 |
对我们知识我们是第一个提出chorismate合成酶的分子结构melitensis。我们已经成功地生成与FMN chorismate合酶的同源性模型melitensis。每个单体的364个氨基酸由新兴β-α-β三明治折叠在其核心。生成的模型分析了各种手段和在所有方面发现一个优秀的模型。的守恒的残留活性部位与单核苷酸FMN必然深深地在蛋白质的;此信息可以有效地用于生成假设关于chorismate合成酶的作用机理melitensis。本研究肯定会被证明是有用的在发展中具体治疗代理/ s为人类使用人类布鲁氏菌病的治疗。 |
确认 |
我们感谢Pravara医学科学研究所提供的设施进行研究。我们也感谢生物技术中心的工作人员,Pravara医学科学研究所的不断支持和鼓励。 |
表乍一看 |
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数据乍一看 |
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