主机系统和饮食结构其细菌社区:一个案例研究各种无花果黄蜂在榕树hispida共存

文摘

微生物群落的组成可能由于地理隔离,饮食和宿主生物体的发展史。一个零假设是,微生物群落的进化历史反映了各自的膜翅目昆虫的发展史。本研究的目的是测试这个假设使用四个无花果黄蜂物种(Ceratosolen solmsi娃,Apocrypta bakeri约瑟夫,Philotrypesis pilosa娃,和Philotrypesis sp。福斯特),共存的空间隔离无花果榕树hispida林奈的蛀牙。四个无花果黄蜂的细菌群落调查使用文化无关的方法。结果表明,这些黄蜂拥有共有53个操作分类单元(3%距离截止16 s rDNA序列),由变形菌门。食草动物c solmsi主要存在γ-proteobacteria(65.3%)和Actinobacteridae (23.9%)。潜在的杂食者p . pilosa是由α-和γ-proteobacteria(80.5%和4.9%)。β-proteobacteria和Acidobacteria代表大多数食肉动物的细菌社区Philotrypesis sp。(51.2%和16.8%)和a . bakeri(52.7%和12.5%)。与我们的假设相反,细菌社区的四个无花果黄蜂集群分成三组,这可能是结构化的宿主物种的饮食和发展史。fig-fig黄蜂系统提供了一个孤立模型的广泛探索生态昆虫和微生物之间的关联。

关键字

细菌社区,无花果黄蜂、无花果、发展史、饮食

介绍

几乎所有macro-organisms共生微生物。昆虫、细菌共生体受益匪浅,是陆地macro-organisms的最大最成功的组织。Insect-associated细菌共生体的macro-symbionts参与许多生命过程,如营养(1,2),免疫防御3,4],和繁殖[5,6]。有些细菌还在共同进化中发挥的作用和它们的寄主昆虫的物种形成7,8]。

相比之下,昆虫宿主可能限制或驾驶变异的细菌群落。主机系统和饮食可能影响细菌群落的结构与昆虫有关,与主机系统出现在膜翅类(尤其重要9,10]。例如,在一些膜翅目昆虫谱系,包括蜜蜂和大黄蜂,细菌社区之间的连接与主机相关的展览模式类似于宿主的发展史(11,12]。除了社会的蜜蜂,细菌群落组成在幼虫,蛹的,和成人阶段密切相关的三个种类的宝石的黄蜂(Nasonia)也平行于主机的系统发育历史显著(13,14]。因此,一个零假设是一个微生物群落的历史反映了膜翅目的主机的发展史。然而,到目前为止,上述假设没有被测试在不同种类的膜翅类与生态的关系,现有的空间内孤立的栖息地。

fig-fig黄蜂共生系统联系在一起热带榕属植物hispida林奈他(桑科)可能会提供一个有价值的模式探索昆虫和微生物之间的关系在空间上隔离micro-syconium。无花果的卵巢f . hispida居住着一个无花果黄蜂授粉物种(PFW,Ceratosolen solmsi娃)和三个non-pollinating无花果黄蜂物种(NPFWs,Apocrypta bakeri约瑟,Philotrypesissp。福斯特,Philotrypesis pilosa娃)。四大黄蜂物种系统发育关系和不同的饮食。过去,PFW solmsi属于家庭Agaonidae,虽然NPFWs属于家庭金小蜂科亚科Sycoryctinae。在NPFWs,妹妹的物种p . pilosa和Philotrypesissp.属于部落Sycoryctini,而答:bakeri是一个部落的成员Apocryptini。关于饮食,c . solmsi是一个gall-maker无花果syconia的在女性排卵阶段。p . pilosa似乎是一个寄居动物c . solmsi(15)(表1),排卵后不久c . solmsi。答:bakeri和Philotrypesis sp.寄生于幼虫c . solmsi在男性阶段和排卵的无花果16- - - - - -18]。

综上所述,这些差异的四个无花果黄蜂物种促进测试零假设,细菌群落的组成与无花果黄蜂共同与宿主的发展史。因此,本研究的目的是测试使用的四个无花果黄蜂物种零假设热带榕属植物hispida。细菌社区的四个无花果黄蜂物种调查使用文化无关的方法。

材料和方法

样品:无花果黄蜂,用于筛选细菌社区收集的f . hispida在海南和云南两省,中国在2012 - 2013年(表1)。健康、成熟syconia黄蜂出现之前被送往实验室。黄蜂被同步收集从隐头花序出现后,立刻发现物种水平根据他们的形态。个人黄蜂分别存储在95%乙醇在-80°C。

DNA提取:减少潜在的个人偏见,每个样本包含20个人黄蜂。从13个样本,提取的DNA分别包括三位女性c . solmsi一只公c . solmsi,三位女性的每个样本三种NPFWs (表1)。每个样本与消毒清洗三次磷酸缓冲溶液(PBS)使用超声波(30 Hz)清洁,然后在液态氮冷冻,用消毒杵碎。总基因组DNA被孤立使用DNeasy组织工具包(英国试剂盒)根据制造商的指示。一个样本提取使用相同的工具作为消极的控制。

无花果黄蜂的DNA条码技术:鉴于困难之间的差别小黄蜂由于其形态相似,分子识别技术被用来确定四个黄蜂物种的形态分类。我们所知,我公司及其序列是常用调查昆虫物种的进化。的ITS2序列c . solmsi未能被放大,我公司被选为分子识别的四个无花果黄蜂物种。

无花果黄蜂被放大的部分COI片段通过PCR和测序DNA提取,使用保守引物1490 f - 2198 r (19]。序列是沉积在基因库加入KF778382-KF778394数量。

克隆库的建设:16 s rDNA基因片段的13个无花果黄蜂提取DNA通过PCR扩增,使用引物27 f和1492 r,如前所述[20.]。PCR产品清理使用EasyPure快速凝胶萃取设备(TransGen,北京)根据制造商的协议。平行-控制同步运行包含PCR混合物但没有DNA模板;这些都是负面的。相同的扩增与空白的进行拔牙;这些也一直消极。随后,完整的16 s rDNA基因的克隆库碎片被构造为描述马丁森et al。12]。

放大核糖体DNA限制分析(ARDRA)和测序:对于每一个图书馆,100多克隆被用来检测16 s rDNA的目标片段。少量的每个菌落在300磅μL肉汤稀释,增长12 h。目标片段被放大直接从细菌培养基通过50μL PCR混合物。每个样品PCR产品运行在1%琼脂糖凝胶使用EB染色。

成功的PCR产品(5μL)目标片段与限制性内切酶消化分别1 U有三世和1 U铁道(豆类,大连,中国)1 h。消化产品运行在2.5%琼脂糖凝胶使用EB染色。每个使用生物凝胶进行了分析与基因快速成像系统(Syngene基因有限公司)。带尺寸合格的通过比较他们以100 - bp plusII DNA梯(TransGen,北京)。接下来,一个代表流体文化细菌克隆选择使用每种类型的ARDRA概要文件从每个克隆库。文化被纯化并使用引物测序在两个方向上M13F M13R。测序进行如上所述。潜在的嵌合序列被确定使用柏勒罗丰[21)绿色煤电网站(http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-bel3_interface.cgi);这些被排除在进一步分析。其余序列存入基因库下加入数字HQ639416——HQ639583和KC708242-KC708336。

覆盖和丰富:报道,辣子鸡的比例代表观察到的估计采样辣子鸡的人口总数,计算每个库使用公式(1 - (n / n)),其中n是phylotypes由只有一个克隆的数量,和n是克隆的总数22,23]。Shannon-Wiener多样性指数是用来代表社区的多样性16 s rDNA克隆库,Chao1王牌,这两个代表社区丰富的16 s rDNA克隆库。

分类作业和表征图:分类作业的16 s rDNA基因序列被证实使用RDPCLASSIFIER [24RDP网站(上)http://rdp.cme.msu.edu/)[25]。我们设置了置信水平为80%,停止在最后明确的分类水平和指定作业连续水平非保密(加州大学)。所有可用的序列对齐使用ClustalW [26在BIOEDIT 7.0.0 [27),其默认设置。我们是细菌的系统发育关系不感兴趣,本身,而是他们的分类基于相似性的身份。因此,neighbor-joining表征图建立了使用大型6.0 (28]1000引导程序复制,想象相似。

Phylotype定义:序列分享97%相似聚集成一个单一的操作分类单位(OTU0.97)使用FASTGROUP二世(http://biome.sdsu.edu/fastgroup/)[29日]。这些phylotypes用于研究“了解”的细菌组成。从每个OTU代表序列用于通过爆炸搜索分类评估。检查所有克隆被分配给分类组根据他们ARDRA概要文件。

统计分析:样品中细菌群落的相似性进行了分析使用主成分分析(PCA)的一个不同的矩阵。矩阵由分配Bray-Curtis系数产生的16 s rDNA数据。PCA是运行在过去的2.03 (http://folk.uio.no/ohammer/past/)。我们测试了两两之间的差异不同黄蜂的细菌群落组成相似物种使用单向分析(ANOSIM)在过去10000排列Bray-Curtis不同矩阵(30.]。ANOSIM相比平均等级样本之间的相似性在一个黄蜂物种与其他物种,和计算的R值从1到130.]。先验,R > 0.75是假定为指示物种之间强烈的分离,R > 0.5分离重叠,和R < 0.25几乎可分(31日]。特定细菌的丰度的不同类群之间的样品测试用单向方差分析在SPSS 16.0进行。意义被定义为P < 0.05。

结果

四个图的形态分类法黄蜂物种通过DNA条码技术被证实。

评价克隆库:基于13个克隆库从四个无花果黄蜂物种,223年16 s rDNA序列得到从1244年克隆,包括200个细菌序列,17个潜在嵌合序列,和六个叶绿体序列(表1)。

两条线的证据支持我们的ARDRA抽样策略的可行性。首先,多个16 s rDNA序列测序中的随机ARDRA概要文件(共15个序列),所有这些都是相同的或几乎如此,同样属于OTU距离截止(3%)。第二,如下所述(部分的“细菌社区无花果黄蜂”),30的53个辣子鸡包含至少两个ARDRA概要文件类型,表明我们的抽样策略是充分代表揭示常见的细菌多样性。

覆盖每个克隆库平均为97.5%,超过了94%。Chao1值相关的细菌社区四个黄蜂物种平均大约27.3。c . solmsi显示的最低Chao1价值16;答:bakeri和p . pilosa互相类似于25和29日和Philotrypesissp.最高价值,39号。这些值Chao1,王牌,香农指数也不同在intra-species样本(表1)。

菌落的无花果黄蜂:200年限定的16 s rDNA序列分为53辣子鸡。辣子鸡的数量平均每无花果黄蜂图书馆7.8辣子鸡,然而不同库在同一物种之间是有差别的。答:bakeri大多数变量在每个库丰富,拥有4至24辣子鸡。细菌在无花果黄蜂物种(OTU丰富性也不相同表1和图1)。平均每个物种的辣子鸡数量为21。c . solmsi主持只有14个辣子鸡,a . bakeri pilosa页,Philotrypesis sp. 22, 22日和26个辣子鸡。妹妹的物种p . pilosa和Philotrypesis sp.共享6 39辣子鸡(15.4%),然而无花果黄蜂从不同家庭共享。例如,c . solmsi和p . pilosa分享7 26辣子鸡(26.9%)。总共18 53辣子鸡(34%)是由至少两种共享无花果树的黄蜂。所有无花果黄蜂拥有OTU 9日和三NPFWs共享OTU 17。共享辣子鸡的比率并没有与无花果黄蜂的发展史。

整个细菌社区的四个无花果黄蜂物种包括六门,13类,25科43属(图1)。72%的细菌类群代表如下:变形菌门(α-proteobacteria 24%,β- 28%,和γ- 20%),厚壁菌门为11%,放线菌11%,Acidobacteria 8%,拟杆菌5%,Deinococcus-Thermus 2%。细菌群落组成每个黄蜂物种的详细图2。在变形菌门被分配到最丰富的细菌沃尔巴克氏体属(α- 12.9%),Tepidimonas(β- 27.6.0%)和家庭肠杆菌科(γ- 9.2%)。

只有三个(ppi1 aba1 - 73 - 108,和psp2 - 78) 200年的序列从无花果黄蜂展出< 97%相似的序列在基因库。此外,37序列高度匹配相似(> 97%)分类学的鼻窦细菌属RDP II和基因库。其余序列非常类似于那些从其他昆虫,或无教养的环境样品在基因库。

Neighbor-joining使用16 s rDNA序列构造的树从无花果黄蜂细菌描绘好奇模式对三种细菌的属。一些不动杆菌序列图黄蜂物种进化成一个特定的集群中,没有任何基因库97%以上相似序列(图3)。序列从树上NPFWs表现出单独的集群Acidobacteria Tepidimonas。Acidobacteria黄蜂集中在细分如图4,没有观察到在其他昆虫共生体。Tepidimonas在无花果黄蜂集群和一个未受教育的环境细菌分为一个未定的物种(99%相似)。

比较图黄蜂的细菌群体中:细菌社区的四个黄蜂物种解决分成三组主成分分析(PCA)在属级执行。一个群体拥有的四个样品c . solmsi,第二三个样品p . pilosa,第三包括六个样本答:bakeri和Philotrypesis sp。无花果黄蜂在同一个集团拥有共享细菌社区(图3一)。ANOSIM透露两两之间的差异不同黄蜂的细菌群落的物种。细菌的社区c . solmsi,唯一的食草动物,实质上不同于NPFWsp . pilosaPhilotrypesis sp。,答:bakeri,高R值(分别为0.8519、0.9259和0.8519)。最小的R值(0.0830),社区之间的a . bakeri Philotrypesis sp。表示没有任何重大差异。妹妹的物种p . pilosa和Philotrypesissp。32)有一个极高的R值为1.0000,这远远超过细菌社区之间的答:bakeri和Philotrypesis sp。寄居动物p . pilosa与其他三个黄蜂R值> 0.75,表明其细菌的构成社区的独特性。\

的细菌组成的最大区别PFWs和NPFWs家庭肠杆菌科,主要属肠杆菌属和Pantoea。家庭肠杆菌科构成了51.4%的164年克隆的筛选克隆四个库c . solmsi。相比之下,只有从NPFWs a . bakeri和三个克隆p . pilosa观察到。序列从图书馆c . solmsi取样分别在夏季和冬季都被分配到属Pantoea和肠杆菌属,分别。

沃尔巴克氏体属唯一已知的遗传内共生细菌在无花果黄蜂,黄蜂也明显在四个不同的物种。沃尔巴克氏体属感染所有p . pilosa和一些c . solmsi样品,但从来没有感染答:bakeri或Philotrypesissp。沃尔巴克氏体属的平均丰度p . pilosa(77.1%)远远高于c . solmsi。

此外,PCA进行过滤后,沃尔巴克氏体属(OTU 14)数据的库c . solmsi和p . pilosa。没有沃尔巴克氏体属,其他细菌p . pilosa被均匀地分散在所有门(图2)。考虑到剩余的细菌从每个数据p . pilosa图书馆相对最小,每个黄蜂物种的数据组合在一起作为一个单元的主成分分析,以减少造成的偏差小的数据集的大小。正如所料,Wolbachia-free细菌的社区p . pilosa仍然偏离的其他三个黄蜂物种,这是符合前面的模式(图3 b)。

第三个黄蜂的细菌群落物种之间的差异Tepidimonas(β-proteobacteria: Burkholderiales)Acidobacterium(Acidobacteria),两者都表现出相似的模式分布的黄蜂。的相对丰度Tepidimonas在两个高答:bakeri(51.3%)和Philotrypesissp。(50.7%)。相比之下,p . pilosa表现出很低的感染水平Tepidimonas自由(2.6%)和感染c . solmsi。Acidobacterium同样是丰富答:bakeri(12.2%)和Philotrypesissp。(16.7%),但明显低p . pilosa(1.5%)。

最后,Deinococcus-Thermus细菌只有在发生答:bakeri和p . pilosa在夏天取样。相似,门拟杆菌门,厚壁菌门和放线菌构成了一个共同的和稳定的社区在所有四种黄蜂。

讨论

之间的复杂关系不同的无花果黄蜂物种共存同一无花果卵巢提供了有价值的模型来测试零假设的成分与图相关的细菌社区黄蜂共变了宿主的发展史。此外,更好的理解系统的细菌群落的结构将提供洞察他们的共同进化机制。因此,本研究首先调查了细菌群落结构与相关的四个无花果黄蜂物种有关f . hispida。

细菌群落与无花果黄蜂:一些作者提出,无花果卵巢提供相对干净的环境是无花果黄蜂,而独立生存的昆虫的栖息地33,34]。这项研究的结果部分支持这个猜想。四大黄蜂物种有关f . hispida拥有相对简单的细菌群落。一般来说,所有种类的昆虫,蜜蜂和黄蜂港口相对较小的细菌群落物种(约11.0 /辣子鸡/样本)(9]。成人珠宝黄蜂,Nasonia vitripennis,平均20辣子鸡,n longicornis平均17,n giraulti只有9 (13]。相比之下,成人无花果黄蜂平均只有7.8辣子鸡。因此,无花果黄蜂似乎港少细菌多样性比大多数膜翅类生活无花果果实外,尽管很难规范取样深度和方法论。这个结果可能是由以下因素引起的。空间隔离的无花果隐头花序腔相对无菌;因此,无花果黄蜂的细菌社区居住的空腔很少有机会被环境微生物感染。另外,一些罕见的或非常lowabundance辣子鸡与无花果ARDRA黄蜂可能未被发现的方法用于这项研究。

细菌群体中发现无花果黄蜂通常被发现在其他昆虫。例如,订单Burkholderiales,最广泛的群体中发现的微生物食草独居蜜蜂(12),也高度丰富的食肉的寄生虫答:bakeri(51.5%)和Philotrypesissp。(50.6%)。序列肠杆菌属从无花果黄蜂收集散落在neighbor-joining表征图,和一些相关的植物或昆虫生活在开放的环境中。肠杆菌科是最丰富的共生有机体c . solmsi(51.4%),但它也占据了微生物群落的其他主机,如红色的火蚁,火红蚁(> 80%)和Nasonia (> 70%)13,35]。这些主机的不同的饮食和分布可能反映了广泛的生物功能肠杆菌科,包括必需氨基酸的合成,碳代谢、发育,繁殖,和免疫致病细菌(36- - - - - -39]。

此外,一些特殊的细菌集团可能由无花果黄蜂。一个特殊的群不动杆菌从四个无花果黄蜂物种被观察到。最大的相似性BLASTN搜索找到的仅仅是97%,这是一个水平,细菌物种之间的歧视。不动杆菌发生在许多昆虫,包括人体虱子(40[],formicid蚂蚁41),蜜蜂42],Nasonia [13]。最丰富的细菌、不动杆菌、假定的帮助n vitripennis在其消化道吸收营养,但确切机制仍难以捉摸(13]。Tepidimonas的序列答:bakeri和Philotrypesis单个集群sp.独立进化,99%的最大相似性基因库序列。尽管Tepidimonas常见温泉(43),较少报道发生在昆虫。因此,知识的作用Tepidimonas在昆虫宿主很贫穷。此外,Acidobacterium从无花果黄蜂聚集在子群4,有别于其他昆虫,主要集中在组1 (20.]。不同的进化历史和无花果黄蜂和其他昆虫的栖息地是这些现象的潜在原因。

宿主细菌群落结构的演化历史和饮食结构:值得注意的是,相比两个Wolbachia-free寄生虫,沃尔巴克氏体属(77.1%)p . pilosa可能沼泽其他细菌的克隆采样和从其他组织影响细菌的检测,如肠道和血腔。然而,使用ARDRA方法,观察到的沃尔巴克氏体属序列都是分配给OTU14。Wolbachia-free细菌的多样性p . pilosa(21辣子鸡)在本研究中发现的答:bakeri(22个辣子鸡)和更高的比c . solmsi(14个辣子鸡),只有一个小人口被感染的沃尔巴克氏体属。这么高的细菌多样性表明clone-sampling大小是大到足以克服沃尔巴克氏体属主导地位的影响调查的其他著名的细菌p . pilosa社区。此外,PCA进行过滤后从黄蜂沃尔巴克氏体属数据库。正如所料,Wolbachia-free细菌的社区p . pilosa继续偏离的其他三个黄蜂物种的方式与之前一致模式(图3 b)。

虽然这是表明,膜翅类和白蚁代表的模式微生物群落和昆虫的发展史是平行的另一个(9,13,23),否则我们的发现提示。细菌的组成社区的四个黄蜂物种似乎同时由无花果黄蜂的饮食和系统发育的历史(图4)。

在无花果蜂亚科级别,Agaoninae的细菌群落结构(c . solmsi)明显不同于Sycoryctinae (a . bakeri Philotrypesissp。p . pilosa)。这两个亚科的细菌集群模式与无花果黄蜂的系统发育关系。这表明,细菌群落结构的显著差异的两个亚科可能是由于两个亚科系统发育之间的距离。

Sycoryctinae三无花果黄蜂物种,细菌社区似乎受到饮食的影响,而不是无花果黄蜂的演化历史。首先,细菌的群落结构Philotrypesissp.是相似的Apocrypta bakeri(答:bakeri),但偏离它的姊妹物种,p . pilosa。这表明细菌社区的历史并不反映三个NPFWs的系统发育关系。这个结果让我们拒绝我们的假设。第二,两答:bakeri和Philotrypesissp.食肉,喂养c . solmsi。相比之下,p . pilosa可以被认为是杂食的,因为它是食草幼虫阶段2之前,但是以后呢p . pilosa可以同时吃无花果卵巢组织和吗c . solmsi在幼虫阶段,这是被p pilosa 2 (15]。

总体而言,细菌群落结构的四个无花果黄蜂物种可能是由食习惯和无花果黄蜂的系统发育历史(图4)。生态无花果黄蜂和外膜翅类之间的差异可以解释这种不一致。封闭图syconia无花果黄蜂施加巨大的进化压力,生活在黑暗中,资源有限,经验的激烈竞争,是孤立的身体以外的资源(44]。正因为如此,无花果黄蜂拥有许多独特的特性,如降解的化合物的眼睛,极端的两性异形,和男性多态性(45]。然而,不存在之前的数据描述这些压力如何影响细菌群落组成。

本研究调查的四个无花果黄蜂物种f . hispida打开门,进一步的研究途径。不同的细菌群落可能存在于其他fig-fig黄蜂系统。例如,沙雷氏菌属plymuthica,这是第一个微生物培养和鉴定从无花果黄蜂Blastophaga psenesl,which pollinatesCalimyrna无花果(46),没有发现的无花果黄蜂f . hispida。因此,这项研究获得的结论需要进一步验证在其他fig-fig黄蜂系统。

确认

我们感谢匿名审稿人的宝贵意见的手稿。这项工作是由中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委批准号31090253、31090253和31090253),部分由中国科学院重大创新项目(KSCX2-EW-Z-2)和格兰特(没有。O529YX5105)的重点实验室中国科学院动物分类学和进化的。

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