人中性粒细胞脂脂素(HNL)在细菌和病毒感染之间的区别

摘要

早期和准确地区分急性感染的细菌或病毒原因是更好地使用抗生素的关键，并将有助于减缓快速增长的抗生素耐药性。这种鉴别可以通过测定生物标志物人中性粒细胞脂质(HNL)来实现。通过测定血>的血清敏感性和特异性，成人和儿童均达到90%。为了消除产生血清的需要，开发了一种测定时间<10分钟的全血试验，其中血液中性粒细胞被激活以释放其HNL。该方法的诊断准确性也显示出>90%的敏感性和特异性，明显优于当代的检测方法，如中性粒细胞计数、CRP、降钙素原和CD64在中性粒细胞上的表达。这种形式有利于即时HNL检测的开发，将是实现在急诊室或医生办公室10分钟内准确诊断急性感染症状患者目标的重要一步。

关键字

降钙素原，抗生素，微生物学

简介

由病毒或细菌引起的急性感染，几乎每个人每年至少会感染一次。这些感染大多是无害的，几天后就会自行治愈，无需进一步治疗。然而，在许多情况下，感染会持续或引起症状，使患者需要医疗建议，并希望得到治疗。绝大多数这样的病人会去看初级保健医生，医生问的适当和常见的问题应该是“我的病人应该开抗生素吗?”这个问题也是医疗保健中最重要的问题之一，因为不必要的抗生素处方增加了抗生素耐药性进一步发展的可能性，这一现象已经成为对人类的严重威胁[1，2］．因此，对于受普通病毒感染影响且不被视为危险患者或特别脆弱的受试者，抗生素是无效的，应避免使用。因此，这个问题的答案应该是“不”。

医生如何知道什么时候用抗生素治疗，什么时候不用抗生素?第一次判断是基于患者的病史和体检。然而，许多由病毒或细菌引起的急性感染的体征和症状非常不具体，无法作出准确的区分。研究表明，仅根据这些标准，经验丰富的医生准确区分呼吸道感染的病毒和细菌原因的敏感性和特异性不超过55- 60% [3.，4］．因此，需要额外的手段来提高诊断的准确性是显而易见的，传统上白细胞计数或差异被使用，并显示非常有用。在许多国家，这些测量方法已被血浆蛋白测量如CRP (c -反应蛋白)所取代。随着这些添加物的增加，敏感性和特异性提高，接近70-80%。这些数字表明，仍然有很大比例的患者被误诊为虐待的后果。用于排除可能的细菌感染的测试的阴性预测值(PVneg)理想情况下应该是100%，但实际上PVneg超过90%应该是可以接受的。这篇综述将总结我们的知识测量HNL(人中性粒细胞脂脂素)作为一种手段，以区分细菌和病毒感染。我将不讨论引起病原体的具体检测，即所有重要的微生物试验。这类检测对于指导使用哪种抗生素很重要，但不能满足向医生快速答复以立即决定是否开抗生素的需要。

人中性粒细胞脂脂素(HNL)也被称为NGAL(中性粒细胞明胶酶相关脂脂素)或脂脂素2 (LCN2) (表1)．

表1。中性粒细胞脂脂素(HNL)。

这些名称指的是HNL最初是在人类中性粒细胞中发现并纯化的事实[5-7］．它以预成型分子的形式储存在中性粒细胞的次级(特定)颗粒中，并且在细胞激活时很容易从这个储存室中释放出来。HNL也可在上皮细胞中诱导产生，肾上皮细胞产生HNL最近引起了相当大的兴趣，因为这种产生是由影响肾功能的过程诱导的[8，9］．因此，在急性肾损伤患者中，HNL水平的升高在疾病过程的早期可见。HNL的真正生物学功能仍然不清楚，尽管已经证明HNL结合铁载体并具有抑菌特性。HNL也与凋亡活性有关。在缺血肾内灌注HNL/NGAL可保护肾脏免受损伤[10］．

HNL最初是在人类中性粒细胞中发现并纯化的。我们将该蛋白质命名为人中性粒细胞脂脂素，因为其氨基酸序列显示与脂脂素蛋白质家族的其他蛋白质同源。中性粒细胞纯化的主要形式是分子质量为45 kD的同型二聚体，但中性粒细胞中也存在单体(24 kD)和异二聚体(> - 90 kD)分子形式[6，11］．该异二聚体蛋白是HNL和明胶酶(MMP9)之间的复合物，因此丹麦的一个研究小组将该蛋白命名为中性粒细胞明胶酶相关脂脂素(NGAL) [7］．同型二聚体分子形式似乎是中性粒细胞独有的，相比之下，上皮细胞只产生单体形式。我们的小组已经利用了这种差异，因为针对两种分子形式产生的抗体可用于免疫分析，以区分起源于中性粒细胞或上皮细胞的HNL [11，12］．研究表明，在使用各种体液中的HNL测量作为细菌感染和肾脏疾病等中性粒细胞受累性的生物标志物或作为急性肾损伤等上皮受累性的生物标志物时，这一区别具有根本重要性。

在我们发现HNL的早期，我们产生了针对二聚体的特异性抗体，中性粒细胞起源于分子形式。这使我们能够建立一种灵敏的放射免疫测定方法，用于测量各种体液中的HNL。在血清/血浆中，HNL水平的主要贡献者是活化中性粒细胞的数量。但可能发生肾上皮细胞贡献的急性肾损伤患者和各种晚期癌症患者除外[13，14］．因此，在这些疾病中，如果排除细菌感染，在血清/血浆中测定HNL可能是临床有用的。在其他方面健康的人以及可以排除上述疾病的人，血中HNL浓度升高表明存在细菌挑战。

成人急性感染的血清HNL

第一项针对急性感染患者的研究纳入了我院感染科收治的140名患者[15］．39名患者被排除在外，因为无法明确确定患者是纯粹的细菌感染还是纯粹的病毒感染。因此，本研究的目的是检查确诊为急性细菌感染的患者入院时和抗生素治疗前的HNL浓度，并将其与确诊为急性病毒感染的队列中的HNL水平进行比较。所有临床和实验室手段均用于患者的分类。细菌感染患者的HNL浓度高于正常浓度，与急性病毒性疾病患者的浓度不同。roc曲线分析显示有很高的敏感性和特异性。PVpos和PVneg在区分两种急性感染病因方面分别为93%和96%，诊断准确率为95%。因此，浓度低于155 μg/L时发生急性细菌感染的可能性非常低。HNL作为一种可接受的排除细菌感染的检测方法的可能性因此非常高。同一患者的CRP结果显示ROC曲线下面积较低，诊断准确率为81% (p=0.008)。

在第二项研究中，测量了甲型流感感染患者血清中的HNL浓度，并与健康受试者和没有任何甲型流感迹象的细菌感染患者的浓度进行了比较[16］．甲型流感患者血清中HNL浓度高于健康人，但有部分重叠。然而，其浓度明显低于急性细菌感染患者(p<0.001)。还证实，与健康受试者相比，细菌感染患者的浓度有所增加，只有一个例外。因此，HNL的血清浓度是排除急性感染的细菌原因的有力手段。一些流感患者可能有继发性细菌感染，这是一种常见但可能未被诊断的流感感染后果，这可能解释了这些患者中HNL浓度升高的一些原因。下面将进一步讨论的另一种解释是，肺上皮细胞可能被诱导产生HNL。因此，我们早期的放射免疫分析无法区分二聚HNL和单体HNL，即HNL起源于中性粒细胞或上皮细胞。

为了使我们的免疫分析更具特异性，我们开发了一些基于几种具有不同表位特异性的不同单克隆抗体组合的elisa [8］．在一些分析中，我们仍然利用了我们针对二聚物HNL生产的多克隆抗体。在一项对大约350名急性感染患者和未感染对照组的研究中，用这些不同的elisa方法测量了血清浓度[17］．这项研究清楚地表明，一些抗体组合在区分细菌和病毒感染方面优于其他组合。因此，我们的多克隆抗体与针对二聚体HNL的单克隆抗体的组合在这一区别上具有优势，而另一种ELISA中针对所有形式的HNL(即单体和二聚体)的抗体组合显示，与未感染的健康对照相比，病毒感染中的HNL浓度升高，因此在两种感染原因之间的区别不太明显。最优的ELISA，即ELISA 2，阴性预测值为98.8%，阳性预测值为93.1% (图1一个)．如图1 bELISA 2的诊断性能明显优于CRP和中性粒细胞计数。这些发现支持了我们上面的观点，当使用放射免疫分析法测量HNL时，在某些病毒感染的情况下，单体HNL释放得更大，最有可能来自病毒感染的上皮细胞。

急性感染患儿血清HNL的研究

由于与年龄较大的儿童和成人相比，幼儿和新生儿急性感染的体征和症状不太明显，因此很难准确诊断其原因。一项对87名怀疑有细菌感染的新生儿进行的研究表明，在那些已证实或怀疑患有败血症的儿童中，细菌浓度高度升高[18］．浓度在具有相似诊断的成年人中所见的范围内。健康新生儿和3-5日龄儿童的l浓度与健康成人的l浓度相似。困难的一组是那些表现出细菌感染症状，但无法证明感染的儿童。这些儿童最常见的临床问题是呼吸窘迫症状。这组儿童的浓度在正常水平和脓毒症儿童之间。与在成人身上的发现相类比，这些儿童中的大多数似乎很可能实际上受到了感染。这些儿童HNL的动力学在第0天表现出最高水平，而CRP则在一天后达到峰值。患儿临床恢复后HNL恢复正常。

对年龄较大的儿童进行了一项研究，以研究血清HNL动力学，并与其他生物标志物(如CRP)进行比较[19］．正如预期的那样，与那些被认为是病毒感染的儿童相比，那些被认为是细菌感染的患者的HNL浓度显著增加。抗生素治疗开始后，HNL的血清浓度动力学显示，在一天后显著降低，在治疗两天后恢复正常，与儿童的恢复和细菌挑战的假定根除一致。与此形成鲜明对比的是，即使在第2天和第3天，大多数儿童的CRP仍保持升高。这是一个重要的观察结果，因为使用CRP作为诊断细菌感染的工具可能会在感染过程的后期产生严重的误导。c -反应蛋白的滞后是一个众所周知的现象，在使用c -反应蛋白诊断急性感染时必须牢记，以防止在已经根除细菌挑战的受试者中进行不必要的抗生素治疗。因此，两项针对儿童的研究表明，HNL和CRP的上升和下降动力学有很大差异，与CRP相比，HNL因细菌挑战而较早上升，而抗生素治疗后较早下降。除了更准确地区分细菌感染和病毒感染之外，这种动力学也应该有助于更好地使用抗生素。

其他炎症性疾病的血清HNL

当涉及到急性感染诊断时，一个重要的问题是HNL的特异性。如上所述，血清/血浆中的HNL可能来自两个主要来源。一种是由体内中性粒细胞的周转和激活决定的，另一种是由肾脏上皮细胞和各种形式的癌细胞从头合成HNL决定的。体内中性粒细胞的激活可发生在其他炎症性疾病和这些疾病中;在没有任何感染的情况下，HNL的血液浓度会升高。然而，在患有类风湿关节炎的患者中，尽管有活跃的临床疾病，HNL浓度却正常，但情况并非如此[20.］．在囊性纤维化患者中，HNL准确地识别出急性肺加重的患者[21］．同样在慢性阻塞性肺病患者中，HNL伴随病情加重而升高，这可能是细菌感染是这些患者病情恶化的主要原因的一个迹象[22］．HNL水平因重大手术创伤而略有升高，但与中性粒细胞计数和CRP相比，相对升高幅度较小。然而，在证实有细菌感染的术后患者中，与中性粒细胞计数和CRP相比，HNL进一步升高[23］．因此，HNL识别术后细菌感染的能力似乎更强。在另一项针对开胸手术患者的研究中，HNL [24]未显示出这种差异，这可能与新认识有关，即术后急性肾损伤患者血液中HNL升高。急性肾损伤的发展在开胸手术中很常见，在这种情况下，监测血液和/或尿液中的HNL被认为是肾损伤的早期迹象。

血清和血浆中HNL的测定?

HNL可在任何体液中测量，在血液中可在血清或edta血浆中测量。急性感染的临床研究表明，血清测量优于血浆测量[15］．然而，血清测量需要严格标准化的血液取样程序，以避免错误的低或高水平。这是因为试管中的中性粒细胞在体外持续释放HNL，这一过程取决于时间和温度。

为什么基于血清的HNL测量在区分细菌感染和病毒感染方面优于血浆测量?这个问题的答案在漫画中有说明图2．当在EDTA血浆中测量时，HNL的浓度准确地反映了循环水平。这些水平是由体内各种来源的HNL增加产生和释放的结果。然而，流通的HNL也需要消除。因此，目前的HNL浓度是生产和消除的结果。如果生产占主导地位，我们将看到浓度的增加，而在消除增加的过程中，这些增加的浓度将被抵消，并导致看起来正常或甚至更低的HNL浓度。即使对人类HNL翻转所涉及的过程知之甚少，我们也可以假设在炎症状态下HNL的翻转会增加[25］．当在血清中测量时，HNL的消除明显停止，而血细胞(即中性粒细胞)的产生和释放可能继续。在细菌感染和病毒感染的区别中，循环中性粒细胞的活性似乎决定了诊断能力。26］．因此，完成这一区分的测定应以确定这种活性为目标，如上面给出的例子所示，如果血液被准确地按照说明处理，这种区分是强大的。

脓毒症中的血浆HNL

我们用放射免疫分析法测定了138例疑为败血症的重症监护室患者EDTA血浆中的HNL [27］．在SIRS和败血症患者中，HNL与记录的细菌感染密切相关。在SIRS患者中，将HNL检测细菌感染的能力与CRP和PCT进行比较，CRP和PCT均未显示出任何能力，而HNL显示roc曲线下的面积为0.82，敏感性和特异性接近80%。因此，在这方面，血浆HNL似乎优于其他两种生物标志物。在logistic回归分析中，高浓度HNL的败血症比值比为23.1，高浓度PCT和CRP的败血症比值比分别为17.3和12.0。无论模型是否根据肾功能进行了调整，均发现了这些比值比的差异。本研究认为，血浆HNL可以有效区分SIRS的感染原因和非感染原因，是危重患者败血症的一个很有前景的标志物。观察结果进一步表明，HNL升高与败血症之间的关系与肾功能水平无关[28］．虽然HNL作为败血症标记物优于PCT，但其在协助抗生素管理方面的作用仍有待确定。在未来的脓毒症研究中，还应评估特异性检测血浆或血清中中性粒细胞特异性HNL的检测方法。

HNL的血浆/血清测定

几项研究表明，血清中HNL的测定优于任何其他方法来区分两种主要感染原因，即细菌或病毒。这种区别对于判断是否应该给病人开抗生素是非常重要的。在这一决定中，HNL检测应该是对临床发现的补充和对医生的支持，因为其目的应该是避免给那些没有从这种干预中获益的患者开抗生素。因此，一种极有可能排除可能的细菌感染的检测方法应该对医疗保健产生重大影响，并在与快速增长的抗生素耐药性流行病的斗争中发挥重要作用[1，2］．目前，市面上只有ELISA格式的HNL实验室分析方法。这种化验的典型反应时间为2-3小时，因此可用于评估住院患者或在有现代化实验室的医院急诊病房就诊的患者的感染情况。在初级护理和大多数急诊护理单位，快速的即时检测是可取的。

HNL全血快速即时检测

血清HNL结果变化的主要障碍和原因之一是分析前对血液的处理。如上所述，在这方面的标准化程序是强制性的，在繁忙的临床环境中往往难以实现。因此，我们已寻求其他可能消除这些问题的解决办法。对替代程序的一个要求是，这种新的独立于用户的程序的结果应该反映与凝血依赖的中性粒细胞激活所实现的结果。以下描述的程序满足这一要求，尽管结果是在抽血后5-10分钟内获得的[26］．本发明背后的想法是，通过合适的中性粒细胞激活剂激活全血中的中性粒细胞应诱导HNL的细胞外释放，释放的程度将反映中性粒细胞的激活状态，并模拟凝血2小时后HNL释放的情况。所选活化剂为三肽fMLP。从100多名感染患者和未感染对照组中分离的血液中性粒细胞进行的初步实验表明，暴露于fMLP后，从纯化的中性粒细胞中释放HNL的程度与相同受试者的血清浓度密切相关。这是一个非常重要的观察结果，因为它清楚地表明，凝血后达到的血清浓度主要取决于中性粒细胞的活性，而不是取决于细胞的数量。基于这些结果，我们对约750名感染和未感染受试者进行了一项大型临床研究(Bio-X) [29］．取全血，用fMLP孵育20分钟，之后用横向流动定点检测法测定HNL。将结果与CRP、PCT和中性粒细胞表面CD64的表达进行比较，结果显示在活化全血中测量HNL明显优于其他三种生物标志物。对于整组患者，HNL的ROC曲线下面积为0.91,CD64和PCT的ROC曲线下面积分别为0.70和0.63。HNL在大多数感染性疾病中优于这些生物标志物(图3而且表2）

表2。病毒感染与各种细菌和支原体感染的诊断区别。

CRP不包括在这些计算中，因为这个生物标志物已经为裁判所知。然而，当我们分别研究呼吸道感染患者时，我们将CRP与CD64和PCT一起纳入计算，出现了一个非常有趣的模式[30.］．当仅根据临床观察进行区分时，CRP和HNL具有相似的诊断能力。然而，当通过客观的微生物检测确认诊断时，HNL的诊断能力从AuROC 0.82增加到0.92，而CRP的AuROC从0.82下降到0.74。无论上呼吸道感染或下呼吸道感染是单独计算的，还是根据咳嗽、鼻塞或喉咙痛等呼吸道感染症状计算的，都重复了相同的模式。这些结果告诉我们两件事。一是c反应蛋白的使用高估了细菌作为感染的原因，第二，更重要的是，激活后全血中HNL的测量具体反映了身体对细菌感染的反应。

在最近的研究中，我们发现HNL的全血激活和释放可能在3-5分钟后达到最佳状态，即大大短于Bio-X研究中使用的20分钟[30.］．基于这些实验，正在开发在小型手持仪器中同时进行全血激活和HNL测量的即时检测方法。可行性实验表明，这是可能的，并将允许在抽血后5-10分钟内获得结果。因此，充分开发的分析方法将允许对急性感染进行快速的即时评估，具有高度的诊断准确性，并将支持医生决定是否使用抗生素，即更好地使用抗生素。我们的项目在2017年获得了欧盟100万欧元的奖金，以表彰最有希望实现上呼吸道感染中更好地使用抗生素的目标。

参考文献

1. Laxminarayan R，等。抗生素耐药性——全球解决方案的需要。《柳叶刀》传染病杂志2013;13:1057-1098。
2. Nathan C和Cars O.抗生素耐药性——问题、进展和前景。中华医学杂志(英文版);2014;
3. Hopstaken RM，等。症状、体征、红细胞沉降率和c反应蛋白在急性下呼吸道感染肺炎诊断中的作用中国生物医学工程学报。2003;53:358-64。
4. Hopstaken RM, Stobberingh EE, Knottnerus JA, Muris JW, Nelemans P, Rinkens PE，等。一般情况下，对区分病毒性和细菌性下呼吸道感染没有帮助的临床项目。中华临床流行病学杂志，2005;58:175-83。
5. 徐松，Venge P.脂脂素作为疾病的生化标志物。生物化学学报，2000;1482:298-307。
6. 许淑云，等。从中性粒细胞次级颗粒中纯化人中性粒细胞脂脂素(HNL)的研究。中国临床医学杂志。1994;54:365-76。
7. Kjeldsen L，等。人中性粒细胞明胶酶相关蛋白NGAL的分离及初步结构。中国生物化学杂志，1993;14:10425-32。
8. 蔡林，等。心脏手术患者尿HNL/NGAL水平测定及抗体配置对其临床表现的影响临床化学学报。2009;403:121-125。
9. Mishra J，等。中性粒细胞明胶酶相关脂脂素(NGAL)作为心脏手术后急性肾损伤的生物标志物。《柳叶刀》2005;365:1231-1238。
10. Abella V等。脂脂素-2/NGAL作为炎症和代谢性疾病生物标志物的潜力生物标志物。2015;20: 565 - 71。
11. 蔡林，等。尿中HNL/NGAL多种分子形态的起源。临床肾脏病杂志。2010。
12. Martensson J，等。区分肾上皮细胞和中性粒细胞尿液中释放的HNL/NGAL的免疫分析。中国生物医学工程学报(英文版)，2012;
13. Friedl A，等。中性粒细胞明胶酶相关脂脂素在正常和肿瘤人类组织中。细胞类型特异性表达模式。组织化学学报，1999;31:433- 441。
14. Roli L，等。NGAL能否作为人类癌症的预后和诊断生物标志物?对现有证据的系统回顾。国际生物学杂志。2017;32:e53-e61。
15. 许淑云，等。血清测量人中性粒细胞脂脂素(HNL)区分急性细菌感染和病毒感染。中华临床医学杂志，1995;29(5):531 - 531。
16. 波森斯K，等人。中性粒细胞和单核细胞受体在非复杂和复杂甲型流感感染合并肺炎中的表达中华传染病杂志2007;1-12。
17. 于智，等。通过血清测量人中性粒细胞脂脂素(HNL)和抗体选择的影响区分细菌和病毒感染。中华免疫杂志。2016;432:82-86。
18. Bjorkqvist M，等。人中性粒细胞脂脂素:正常水平，可作为新生儿侵入性感染的标志。儿科杂志2004;93:534-539。
19. Fjaertoft G，等。人中性粒细胞脂脂素(HNL)作为儿童急性感染的诊断工具:动力学的研究。儿科杂志2005;94:661-666。
20. Torsteinsdottir I等人。血清溶菌酶:类风湿性关节炎中单核/巨噬细胞活性的潜在标志物。风湿病学(牛津大学)。1999; 38:1249 - 1254。
21. Eichler I等人。人中性粒细胞脂脂素，囊性纤维化急性加重的高度特异性标记物。中国科学院学报，1999;29(2):344 - 344。
22. Ekberg-Jansson A等人。健康吸烟者中性粒细胞相关激活标记物与DL(CO)下降和高分辨率CT上的肺气肿变化有关。呼吸医学2001;95: 363 - 373。
23. Fjaertoft G，等。中性粒细胞CD64 (FcgammaRI)表达是细菌感染的特异性标志物:一项关于动力学和重大手术影响的研究。Scand J infection Dis, 2007;39: 525 - 535。
24. Lannergard A，等。心内直视手术患者感染检测的实验室标记物评价。《传染病杂志》2003;35:121 - 126。
25. Axelsson L，等。人中性粒细胞脂脂素释放和周转的研究。Scand J临床实验室投资1995;55岁:577 - 588。
26. 复仇P，等。人中性粒细胞脂脂素在fmlp激活的全血中作为区分急性细菌和病毒感染的诊断手段。中华免疫杂志2015;424: 85 - 90。
27. 马晓明，陈晓明，陈晓明，陈晓明。急性肾损伤患者中性粒细胞明胶酶相关脂脂素水平的变化。重症监护医学。2010;36:1333-40。
28. Martensson J，等。血浆中性粒细胞明胶酶相关脂脂素(NGAL)与败血症和急性肾功能障碍的关系。生物标志物。2013;18: 349 - 356。
29. 复仇P，等。人中性粒细胞脂脂素作为区分急性细菌和病毒感染的高级诊断手段。临床疫苗免疫。2015;22日:1025 - 1032。
30. 复仇P，等。激活全血中的HNL(人中性粒细胞脂脂素)是一种特异性和快速诊断呼吸道细菌感染的生物标志物。临床疫苗免疫。2017。