研究和评论:植物科学杂雷竞技苹果下载志》上
菜单ISSN: 2320 - 0189
ISSN: 2320 - 0189
+ 1-845-458-6882Zgraja G*,克莱默年代,Jonitz和Wagner W
微生物学和分子生物学、农业技术Augustenberg中心Nesslerstr。25日,76227年卡尔斯鲁厄,德国
收到日期:29/02/2016;接受日期:17/04/2016;发表日期:19/04/2016
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臭气熏天的或共同的短打,Tilletia龋齿造成的,和小麦矮短打,t·库恩进行造成的,是主要的谷物和草地物种的种子生疾病(Graminaceae)。污染水平通常由认证机构或官方控制控制实验室。我们报告几个PCR检测开发的识别和量化Tilletia种虫害污染小麦和拼写样本。该地区的140个基点段放大与定性PCR筛选目的或实时PCR进行量化。该方法验证成功的内部和水平测试与其他相比建立方法。除了一个PCR-RFLP开发对于物种歧视。使用HinfI限制性内切核酸酶t .龋齿的PRB2序列被消化成三个片段而只有两个t进行。在常规分析和监测种子很多或饲料原料这PCR方法是一个合适的替代传统微观方法费时又费力。
常见的短打,小麦矮短打,Tilletia龋齿,Tilletia进行实时PCR、PCR、PCR-RFLP
最重要的谷物和草地物种seedborn疾病(Graminaceae)臭或常见的短打,所致Tilletia龋齿小麦矮短打,所致t进行在中欧,发挥了相当大的作用在过去的几年里。自2011年以来有几个季节的天气状况导致强烈的出现在种子,谷物,和饲料原料。特别是在有机农业这种侵扰的意思同化工厂保护代理不允许应用程序。实验室检测是必不可少的活动,以确保孢子不通过种子传播和真菌毒素三甲胺不危及消费者的健康和动物。有建立在官方控制方法,如微过滤方法量化的种子,但它们费力而耗时的。除此之外的物种分化有时是有争议的1]。
几种PCR方法描述的两种Tilletia发表,但他们橡皮普遍不够或不够具体为我们的应用程序(2- - - - - -4]。在先前的研究与Tc-F / Tc-R实时PCR引物提出了适用于小麦样品,但是没有校准的拼写展览一个完全不同的相关性(2]。此外我们此报告一些非特异性扩增其他真菌DNA。相比之下这TILf / TILr引物在常规PCR非常具体,但amplificate的大小太大,是一个很好的实时PCR效率(3]。
本研究的目的是开发和验证一个高效的实时定量PCR方法的t .龋齿t进行在小麦(小麦在拼写)和(小麦属植物spelta),以便有一个可靠的选择种子和饲料原料的微观分析。为了这个目的的方法是内部验证与自然感染的样品和他们受到一个水平测试。此外,我们提出一个新的特定RFLP-PCR是两者之间的歧视Tilletia物种。
抽样
从2011年到2015年的种子被官方种子取样器取样根据ISTA规则的框架(国际种子检验协会)认证。
DNA提取
使用了四个初始权重的5 g(这与4×50小穗)拼写;小麦、黑小麦或大麦4复制10 g的使用(这与4×250种子)。
样品材料填充到50毫升管,暂停了与15毫升CTAB提取缓冲和孵化全能料理机60°C 1 h。1毫升的提取随后孵化20μl蛋白酶K(25毫克/毫升)和5μl核糖核酸酶(10毫克/毫升)60°C 1 h。提取纯化和氯仿,孤立与向导清理系统(Promega),和80%异丙醇清理,溶解在洗脱缓冲(pH值9)。
PCR和实时PCR条件
定性PCR引物Til122-F和Till262-R设计放大的140个基点PCR产物内部转录间隔区(ITS)地区Tilletia spp。(表1)。放大控制与一个统一的植物进行了PCR先前描述的生成一个amplificate trnL叶绿体DNA的基因内区(5]。Tilletia——和植物进行PCR反应的最后一卷25μl包含12.5μl HotStar Taq Mastermix(试剂盒),每个正向/反向引物2μl, 6.5μl无菌水,2μl提取DNA。与PeqStar 2 x放大进行了热循环(Peqlab)使用以下PCR条件:95°C-15 min(94°正在年代,60°C-40年代,72°颈- 1 min)×35周期,72°C-10分钟,12°C ~。
| 底漆 | 5´- 3´序列 | 参考 |
|---|---|---|
| Til122-F | ACC猫TGT CTT CGG TG行动 | 这项工作 |
| Till262-R | TCG GGT GCG TTC AAA手枪 | |
| Til175-P | FAM-CTT GGT TCT CCC ATC手枪棉酚GA-TAMRA | |
| Tc-F | TTG GGA TTG GCG答TTG C | 麦克尼尔公司M,等。[2] |
| Tc-R | ATG CCA猫TTC苑TAC答答CCA | |
| rpb2 - 740 f | 手枪GGA公司治理文化GGT TTG TAA TG | 生产LM, et al。[6] |
| rpb2 - 1365 r | TCG亚美大陆煤层气有限公司AGC YAA CAC TGA广汽G | |
| Plant1 (c) | 注册会计师AAT CGG标记ACG CTA CG | Taberlet P,等。[5] |
| Plant2 (d) | GGG手枪AGA GGG TGA AC |
表1:在这项研究中使用的引物序列。
与实时PCR阳性样本量化使用TaqMan化学。化验进行最后的20μl LightCycler 480大师(罗氏,10μl), 20 pmol底漆Til122-F(0.5μl), 20 pmol底漆Till262-R(0.5μl), 10 pmol TaqMan探针(Til175-P, 0.3μl),无菌水(3.7μl)和DNA(5μl)。放大了LightCycler 480(罗氏)按照下列程序:95°C-10 min (94°c - 5 s, 60°C-15 s)×55周期,30°正在~。
用于校准强烈感染小麦样本的DNA提取和稀释在7步骤每个1:5的比例(表2)。每个稀释步骤与孢子的数量。小麦和拼写样本分开,因为他们的不同的形态。两个样本校准器(表3),不同的污染水平被用来验证校准系统。
| 没有 | DNA稀释 | 每个内核的孢子数量(小麦) | 每个小穗的孢子数量(拼写) |
|---|---|---|---|
| 1 | 未搀水的 | 5000年 | 50000年 |
| 2 | 1:5 | 1000年 | 10000年 |
| 3 | 1:25 | 200年 | 2000年 |
| 4 | 1:125 | 400年 | 400年 |
| 5 | 1:625 | 80年 | 80年 |
| 6 | 1:3,125 | 1.6 | 16 |
| 7 | 1:15,625 | 0.32 | 3.2 |
| 8 | 1:78,125 | - - - - - - | 0.64 |
表2:相关的DNA稀释和孢子的数量。
| 实时聚合酶链反应 | 显微方法 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 校准器样本 | Ct值 | 孢子 | 的意思是 | SD | VR % | 孢子 | 的意思是 |
| ValP2 | 29.07 | 88.4 | 88年 | 7 | 8 | 91年 | |
| 28.99 | 94.1 | 97.0 | |||||
| 29.31 | 74.8 | ||||||
| 29.07 | 88.8 | 95.0 | |||||
| 29.15 | 83.8 | ||||||
| 29.08 | 87.8 | 90.1 | |||||
| 29.06 | 89.1 | ||||||
| 28.93 | 98.3 | 83.2 | |||||
| ValP3 | 31.90 | 11.7 | 12 | 2 | 20. | 15 | |
| 31.72 | 13.3 | 18.4 | |||||
| 32.03 | 10.6 | ||||||
| 32.64 | 6.9 | 13.2 | |||||
| 31.65 | 13.9 | ||||||
| 31.65 | 13.9 | 12.1 | |||||
| 31.64 | 14.0 | ||||||
| 31.72 | 13.3 | 15.8 | |||||
表3:法两种方法的性能数据。Ct,阈值周期;SD,标准偏差;VR %,再现性的变异系数。
每个分析执行另一个标准浓度和积极控制校准器样本以及一个空白和消极的控制。孢子的数量计算的帮助下校准系统。复制的结果被用来确定平均值,标准差和变异系数。
在种子中给出的结果分别孢子/内核和孢子/小穗。饲料原料的比例孢子被宣布在%;0.1%孢子对应10000孢子/内核。
PCR-RFLP物种歧视的
这两个物种被聚合酶链歧视reaction-restriction片段长度多态性(PCR-RFLP)。PCR反应进行了25μl包含每个引物的5 pmol rpb2 - 740 f / rpb2 - 1365 r (6),2μl提取DNA, 12.5μHotStar Taq Mastermix(试剂盒),6.5μl无菌水。放大了着陆(Td) PCR在PeqStar 2 x热循环(Peqlab)使用以下PCR条件:95°C 15分钟,(94°正在年代,56°50°C (Td - 0.5°C /周期)-40年代,72°颈- 1 min)×12个周期,(94°正在年代,50°C-40年代,72°颈- 1 min)×28周期,72°C-10分钟,12°C ~。
RFLP片段中20μl反应混合物2μl HinfI限制性内切核酸酶(新英格兰生物学实验室),2μl缓冲区(新英格兰生物学实验室),6μl无菌水,和10μl RPB2 PCR产品孵化在37°C 3 h。
PCR产品和RFLP碎片的可视化使用溴化乙锭染色法和2.5%琼脂糖凝胶电泳。
水平测试
2015年水平测试的检测和量化Tilletia种虫害进行七个欧洲实验室免费使用的分析方法(s)的选择包括微观方法(7次),PCR方法(两次)和一个不同的方法(一次)。五个自然感染小麦样品和拼+消极的控制进行了分析和评估与统计软件根据DIN38402-A45 ProLab(现状数据GmbH)。简而言之:这个应用程序自动计算加权平均值,标准差,再现性,极限公差,离群值,Zu-scores标准化。Zu-scores >±2人被认为是离群值。参与实验室与代码数字匿名。执行水平测试有两个目标:首先验证实时PCR,其次验证所谓的“微观法”(数据尚未发表)基于ISTA的方法(1]。
两个不同的PCR方法分析实现Tilletia龋齿和t进行在小麦和拼写样本。的放大的部分地区是适合识别和量化Tilletia种虫害而PCRRFLP方法产生的碎片RPB2基因足以辨别这两个物种。
PCR-RFLP的歧视t .龋齿和t进行
之间的区别t .龋齿和t进行与PCR-RFLP获得。使用rpb2 - 740 f和rpb2 - 1365 r (6)引物(表1)630个基点amplificate RPB2基因生成的两个物种的DNA (图1)。t . barclayana和t . sumatiiDNA没有放大。
图1:电泳不同Tilletia RPB2 PCR产物的物种。分子量标志:100基点,至1000个基点的间隔100个基点。
在硅片的序列分析几个数据库条目(EU257596.1、EU257597.1 EU257598.1)表明,限制性内切核酸酶HinfI是适合利用序列的两个物种之间的差异:有两个HinfI限制网站的PCR产物t .龋齿而只有一个t进行。事实上我们可以显示三个片段的170个基点,210个基点和250个基点的情况下形成的t .龋齿而t进行只显示两个片段的210个基点和420个基点(图2)。
图2:PCR-RFLP的t .龋齿(t .车),t进行G100-G103 (t . con),种子样本。
为了避免假阴性结果,确保特异性PCR反应的几个真菌出现在谷物和草地物种进行了测试。除了t .龋齿和t进行有一些其他物种显示放大产品后PCR rpb2 - 740 f / rpb2 - 1365 r。但是这些信号都很弱f . langsethiae)或非特异性,即异常大小(表4)。在常规分析这样的结果将被判断为负。其他Tilletia物种没有测试,因为他们没有共同的欧洲中部的农业。
| 不。 | 真菌的物种 | 源 | Til122-F / Till262-R amplificate |
rpb2 - 740 f / rpb2 - 1365 r amplificate |
Tc-F / Tc-R amplificate |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | Fusariumgraminearum | JKI1 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 2 | Fusariumculmorum | JKI | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 3 | Fusariumlangsethiae | JKI | - - - - - - | (+) | - - - - - - |
| 4 | Fusariumoxysporum | JKI | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 5 | Fusariumproliferatum | JKI | - - - - - - | (*) | - - - - - - |
| 6 | Fusariumsubglutinans | JKI | - - - - - - | - - - - - - | + |
| 7 | Fusariumtricinctum | JKI | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 8 | Fusariumverticillioides | JKI | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 9 | Fusariumsporotrichioides | 哥伦比亚广播公司2115701年 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 10 | Fusariumpoae | 哥伦比亚广播公司(CBS) 186.96 | - - - - - - | (*) | - - - - - - |
| 11 | Fusariumavenaceum | 哥伦比亚广播公司(CBS) 408.86 | - - - - - - | (*) | (*) |
| 12 | Fusariumequiseti | 哥伦比亚广播公司(CBS) 119663 | - - - - - - | - - - - - - | (*) |
| 13 | Alternariadauci | 需求侧管理362017年 | - - - - - - | - - - - - - | + |
| 14 | Alternarialinicola | LTZ4 | - - - - - - | - - - - - - | 留言。 |
| 15 | Alternariaradicina | DSM 62029 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - |
| 16 | Colletotrichumlini | 哥伦比亚广播公司(CBS) 172.51 | - - - - - - | - - - - - - | (*) |
| 17 | Colletotrichumgraminicola | DSM 63127 | - - - - - - | (*) | (*) |
| 18 | Microdochiumnivale | DSM 62281 | - - - - - - | - - - - - - | + |
| 19 | 葡萄孢菌 | 哥伦比亚广播公司(CBS) 131.28 | - - - - - - | - - - - - - | 留言。 |
| 20. | Phoma exigua | DSM 63389 | - - - - - - | - - - - - - | (*) |
| 21 | Drechsleragraminea | DSM 63589 | - - - - - - | (*) | (*) |
| 22 | Tilletia龋齿 | DSM 4526 | + | + | + |
| 23 | Tilletiacontroversa | 哥伦比亚广播公司(CBS) 121952 | + | + | + |
| 24 | Tilletiasumatii | JKI | + | - - - - - - | 留言。 |
| 25 | Tilletiabarclayana | JKI | + | - - - - - - | 留言。 |
| 1朱利叶斯KuhnInstitut, Messeweg 11/12, 38104布伦瑞克,德国。2Centraalbureau voorSchimmelcultures, Uppsalalaan 8, 3584 CT,荷兰乌得勒支。3莱布尼兹研究所德意志Sammlung冯·Mikroorganismen和Zellkulturen Inhoffenstr。7 b, 38124布伦瑞克,德国4农业技术中心Augustenberg Nesslerstr。25日,76227年卡尔斯鲁厄的德国。 | |||||
表4:三个定性Tilletia PCR反应的特异性。放大产品——缺席;+,现在;(+)、弱;(*),非特异性;留言。,而不是决定。
检测的局限性(LOD)是由连续稀释的DNA提取由凝胶电泳检测(图3)。验证低感染样本也与微观分析方法进行了测试。这样的LOD rpb2 - 740 f / rpb2 40 - 1365 r PCR是固定在孢子/种子或小穗。
图3:电泳的稀释系列Til122-F / Till262-R PCR产物。50000个孢子;10000个孢子;2000个孢子;4,400孢子;80个孢子;6、16孢子;7日,3.2孢子;8,0.64孢子;0,无菌水。
量化的Tilletia孢子
实时PCR试验开发的量化Tilletia孢子(见材料和方法)。该方法内部验证与种子样本也与微观测试方法。2012年约80样品的冬小麦春季小麦、斯佩耳特小麦和黑小麦比较方法开发[7]。在接下来的几年里大约10%的常规样品同时用两种方法进行了分析。2015年的回顾显示了良好的相关性两个化验的结果(图4)。在这段时期的10个样本拼写和13个小麦样品进行了分析。
图4:2015年23例程样品内部验证。
表3显示结果的再现性的两个拼写和样品不同的污染水平。再现性的标准偏差和变异八复制都是令人满意的。两个样品也被用作校准器样本。
放大与Til122-F / Till262-R具体四个测试Tilletia物种而其他真菌DNA不是放大(表4)。定量的极限(定量限)Til122-F / Till262-R PCR被发现1孢子/内核或小穗。
高度污染的饲料矩阵(> 10000孢子/内核)也成功了,但有太少的数据未出版。
最后我们要报告使用Tc-F / Tc-R时一些非特异性扩增引物(表4)。
水平测试
2015年农业技术Augustenberg中心组织了一次水平测试是为了验证这个刊物的实时PCR方法。自然感染小麦种子样本和拼写与微观分析方法,与某些房子的方法和/或实时PCR。样品代表污染水平相关的最有趣的范围内官方种子测试20孢子/种子。
水平测试的结果进行了总结表5和图5。七个实验室执行与显微镜的分析。另外三个人进行实时PCR。其中一个实验室应用实时PCR根据麦克尼尔等人只有称职小麦样品(2]。因此他们无法量化Tilletia拼写。另外有一个实验室,想检查它的微观方法。有些甚至是一些实验室(# 2和# 3)报道的结果不同实验室助理(数据未显示)。在这种情况下的平均结果被评估。
图5:Zu-scores ProLab Tilletia水平测试生成的软件。
| 示例1 | 示例2 | 示例3 | 示例4 | 示例5 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 实验室的代码 | 拼写 | 拼写 | 拼写 | 拼写 | 小麦 |
| 1 | 8.6 | 7.5 | 14.4 | 4.9 | 16 |
| 1便士 | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | - - - - - - | 10 |
| 2 | 7.7 | 6.9 | 10.4 | 6.2 | 19.2 |
| 2 p | 12 | 14 | 24 | 10 | |
| 3 | 7.2 | 4 | 10.1 | 2.4 | 17.6 |
| 3 h | 7.2 | 4.1 | 10.3 | 1.6 | 22.8 |
| 4 | 18 | 13 | 39 | 16 | 20. |
| 5 | 22 | 14 | 21 | 8 | 26 |
| 7 | 41 (E) | 21 | 11 | 37 (E) | 26 |
| 8 | 14 | 10 | 28 | 5 | 28 |
| 8页 | 8 | 13 | 24 | 9 | 23 |
| 加权平均数 | 11.8 | 10.6 | 18.4 | 7.0 | 21.0 |
| 年代R1 | 6.8 | 5.9 | 8.4 | 6.6 | 6.5 |
| VR2 | 0.58 | 0.56 | 0.45 | 0.94 | 0.31 |
| 下限 | 2.3 | 2.1 | 5.5 | 1.0 | 9.5 |
| 上限 | 29.8 | 26.3 | 40.2 | 24.8 | 36.6 |
| n = | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 1标准差是再现性。2再现性的变异系数。 | |||||
表5:关键数据的Tilletia水平测试2015 ProLab软件生成的。参与实验室提出了以纯数字补充了P, real-time-PCR;H,房子方法;non-supplemented数字代表微观结果。这项研究的结果发表在孢子/内核和孢子/小穗。E,异常强烈偏离的共同意思是所有实验室。
考虑到巨大的测量不确定性微生物学科通常有这个水平测试提供愉快的结果。的分布结果表明,所有不同的方法产生了类似的结果。尤其是实时PCR建立微观方法符合很好。只有一个微观实验室产生的两个离群值类别E,即结果相关的所有实验室的共同意思是超出了公差范围。
除了有一个小麦样品作为消极的控制。这是正确地识别。只有一个实验室检测痕迹< 0.2孢子/种子。
在种子和饲料中其他问题Tilletia分析执行代表认证机构或官方控制实验室。这些的董事会控制一定会使用标准化的和可靠的方法,如建立微观方法,如ISTA工作表的方法识别和量化1)由洗涤过程、膜过滤、显微镜和孢子的枚举。多年来,这是一个良好的实践,但是有努力简化的部分过程(未发表的数据)。对于这个问题提出了水平测试还提供几个实验室使用一个高级版本的微观方法。
我们甚至认为,这种先进的方法太费力了。我们的验证数据(内部验证和水平测试)显示,实时PCR是一个不错的选择,有许多优点。首先没有清洗过程和过滤。隔离的DNA直接执行的样本。除了更多的样品可以同时分析和实验室的效率增加。水平测试显示其他实验室能够介绍实时PCR快速和成功。
实时的结果的方差方法非常类似于微观方法及其在生物系统级被接受。没有可能进一步提高精度,因为这不是方法的一个缺点,而是一个问题分析物的非均匀分散的矩阵。推球的出现加剧这个问题,有时候一个挑战获得合适的样本必须代表不同吨位的种子。
我们的研究表明,Til122-F / Till262-R实时PCR是更具体的比Tc-F / Tc-R PCR方法。此外,它不仅适用于对小麦样品也给拼写。
日常实验室Tilletia经验分析表明,以下策略适用于例行实验室:一开始的定性PCR可以用作筛选方法。因此负样本可以迅速报道没有任何进一步的努力。相比之下受污染的样品由实时PCR随后验证和量化。如果物种歧视RPB2 PCR可以添加的是必要的。不幸的是这个PCR-RFLP的LOD方法是非常高的。样本包含< 40孢子/种子应该使用集中洗涤过程。
这里介绍的方法适合升级如果有必要分析其他Tilletia物种或其他样本矩阵。特别是饲料原料应该验证扩展更大,因为这是非常重要的动物卫生和消费者保护。
由于Sabine格林(农业技术Augustenberg中心)的统计评价水平测试。
