广谱抗真菌几丁质酶的识别从枯草芽孢杆菌菌株BC121

文摘

Chi25,几丁质酶酶是上层清液的纯化培养枯草芽孢杆菌菌株BC121硫酸铵沉淀和甲壳素亲和色谱法。酶的纯度证实了sds - page和产物分析和酶的分子量大约估计。25 kDa。酶稳定的pH值范围6 - 7.5,而酶活性的最佳pH值为6.5。Chi25稳定的温度范围内批准°C和35°C作为活动的最佳温度。生物测定的Chi25孢子萌发的抑制作用和重要的植物病原真菌菌丝的扩展。温室试验结果表明,野生型菌株(BC121)枯萎病发病率降低了80%。比较分析的野生型菌株(BC121)的突变株细菌(BC121M)透露,BC121株对植物病原真菌拮抗作用在体外和体内都是由于Chi25酶。

关键字

几丁质酶、枯萎病、枯草芽孢杆菌、净化、对抗、生物控制

介绍

甲壳素,N-acetyl-D-glucosamine的线性均聚物,是一种真菌的细胞壁的主要成分,昆虫的外骨骼和甲壳类动物。几丁质酶(e . c . 3.2.1.14)水解酶能够水解几丁质聚合物的低聚物。细菌、真菌、昆虫、甲壳类动物和高等植物产生几丁质酶营养或防御性目的[1,2,3]。这些chitinolytic微生物作为一个整体,他们产生的几丁质(甲壳素)消化酶,潜在的应用在生物防治植物病原真菌和昆虫(4、5),以及其他一些生物技术领域[2]。真菌,如木霉属和Gliocladium显示控制土传真菌病原体[6、7]。同样,根际细菌,包括芽孢杆菌、假单胞菌、沙雷氏菌属、节细菌属和肠杆菌属也可以控制真菌疾病(8、9、10)。

非致病性的土壤芽孢杆菌比其他细菌物种提供了几个优势,因为他们可以形成内孢子能够耐受极端的pH值,温度,渗透条件。这些生物在植物根表面,增加植物的生长,导致真菌菌丝溶解(11、12)。以前,几株杆菌被认为是有效的抗真菌剂,实现了在许多植物的生物防治真菌病原体(11、13)。实际上,这些生物防治剂大多是有针对性的,因此,只有有效的针对特定的病原体。chitinolytic细菌在根际区域抑制多种真菌病原体通过降解真菌的细胞壁,因此,更有效控制真菌疾病[14]。

以前,我们报道,chitinolytic杆菌sp, BC121土壤细菌,显示敌对活动向Curvularia lunata [15]。在目前的工作,我们发现BC121的广谱抗真菌活性菌株对多种植物病原真菌是由于细胞外几丁质酶酶。此外,几丁质酶酶的纯化和表征。

材料和方法

细菌培养和发展媒体

杆菌BC121 sp.压力,从根际土壤样品,分离及其突变株BC121M由亚硝基胍治疗解决方案(1毫克/毫升NTG)悬浮在10毫米三顺丁烯二酸(pH值6.0),据报道,失去其抗真菌活性被用于这项研究[15]。识别系统发育分析,16 s rDNA使用通用引物PCR扩增序列集和与核糖体核糖核酸数据库项目并从基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [16]。几丁质酶诱导,细菌生长在甲壳素媒体[17]补充0.5% (wt /卷)胶体几丁质,0.3% (wt /卷)酵母提取物,0.2% (wt /卷)Na₂HPO₄.2H₂啊,0.03%不₂阿宝₄.2H₂(wt /卷)MgSO O, 0.07%₄,0.05% (wt /卷)氯化钠,氯化钾(wt /卷),0.05%和0.13% (wt /卷)CaCl₂。

抗真菌活性

的抗真菌活性BC121被双板块分析测试和dual-liquid文化分析如前所述[15]。测试真菌BC121的文化和细菌细胞悬液接种到营养琼脂板4厘米的距离。板块在37°C和孵化了每天一个抑菌圈的形成。dual-liquid文化分析,mid-log阶段细菌培养(6小时)包含107 CFU /毫升与真菌co-inoculated文化(107 /毫升)孢子生长6、12、24 h。培养真菌孢子(107 /毫升)培养无细菌培养作为控制。经过48小时的潜伏期在30°C,文化是通过预先称量好的绘画纸1号滤纸,晾干24 h在70°C,和干重量差异菌株菌丝生长都有或没有测量。实验进行了一式三份,重复两次。细菌细胞的生长在双重文化中被电镀的连续稀释样品化验LB-agar盘子。

提取和纯化的几丁质酶酶

胶体几丁质是由治疗纯化几丁质粉(印度)精细化学品,时任冷盐酸(10 N)和50%乙醇水溶液如前所报道[18]。包含0.5%的细菌培养是生长在甲壳素媒体胶体几丁质72 h在30°C的轨道振动器。细胞自由上层清液由硫酸铵沉淀(80%)和集中收集到10毫米钠磷酸盐缓冲剂(SP缓冲区,pH值6.0)。蛋白质沉淀是通过甲壳素列(1.5×15厘米),相同的预平衡缓冲。列与10毫米洗SP缓冲区(pH值6.0)和10毫米醋酸钠缓冲(pH值5.5)。蛋白质绑定到甲壳素矩阵筛选了有10毫米醋酸(pH值5.0)和pH值调整到7.0,1 M氢氧化钠。交联葡聚糖的酶应用于集中G-50列(1.5×20厘米),筛选了与10毫米SP缓冲区(pH值7.0)1.0毫升/分钟的流量。20微克的纯化蛋白质进行了分析使用hypo-reverse阶段列(rp - 318: 250毫米×4.6毫米,Bio-Rad,赫拉克勒斯、钙、美国)平衡de-ionized 0.1三氟醋酸盐的水。一个梯度的蛋白质筛选了两种脱气缓冲70分钟1毫升/分钟的流量在280 nm和监控,检查12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)方法的Laemmli [19]。

酶测定

几丁质酶活性是评价使用生色N-acetyl-β-D-glucosamine寡聚物:p-NP——(GlcNAc) p-NP——(GlcNAc) 2、p-NP——(GlcNAc) 3、和p-NP——(GlcNAc) 4、根据罗伯茨的方法和Selitrennikoff (19)。10μg纯化酶的反应混合物25μl SP缓冲区(10毫米,pH值7.0)和25μl原液(5毫米)的三个上述基板在37孵化ºC 1 h。p-nitrophenol的数量(pNP)发布的吸光度的测定410海里(摩尔消光系数,17700)。几丁质酶活性也降低浊度测量的反应混合物含有胶体几丁质和纯化酶,根据Tronsmo和哈曼[20]。

培养条件的影响

衬底对几丁质酶生产的影响进行了研究使用纯化甲壳素0.5%,0.5%乙二醇几丁质,肿胀的甲壳素0.5%,或0.5%胶体几丁质作为衬底的几丁质合成媒体和几丁质酶活动决心在标准试验条件下[20]。确定温度和pH值宽容,这种酶在10毫米SP缓冲区(pH值7.0),治疗1 h 20到65°C的温度范围,在pH值从3.0到12.0。

体外抗真菌活性气25

纯化酶的抗真菌活性估计使用双板块分析和microtitre板试验如前所述[15]。测试真菌培养和纯化蛋白悬挂在无菌绘画纸滤纸光盘放置在营养琼脂板、孵化35ºC和观察抑菌圈的形成。microtitre板试验,真菌孢子悬浮液(500孢子/ 80μl 10毫米SP的缓冲区,特里同x - 100 0.1%, pH值6.5)和纯化的几丁质酶酶Chi25(10μg / 20μl 10毫米SP缓冲pH值6.5)在35ºC和真菌生长孵化24小时后记录在405海里。

生物防除BC121应变的活动

f .病菌sp. ciceris被选为一个模型病原体导致枯萎病小鸡豌豆植物(c . arietinum)。种子表面的鹰嘴豆品种JG62(高度易感基因型)与0.5% HgCl2 2分钟消毒,用无菌蒸馏水彻底清洗。细菌细胞(10⁸CFU /毫升)和0.5%羧甲基纤维素(CMC)在1:3的比例和用于混合10 g的种子。陶罐(15厘米直径)与一个热压处理过的土壤混合物(粘壤土/泥炭,2:1(卷/期)]与真菌菌丝出没(1克/公斤的土壤)。在每个壶十种子处理枯草芽孢杆菌BC121或枯草芽孢杆菌BC121M播种。non-bacterized(单独涂以CMC)播种在单独的锅被控制。出现后,幼苗被减少到5每锅和维护植株在温室25 - 30°C,定期浇水。40天后,健康和枯萎的植物被数和汇集数据使用费舍尔至少显著差异进行了分析测试。

结果

抗真菌活性菌株

爆炸的搜索分析16 s rDNA基因的两个菌株表现出极大平面图的枯草芽孢杆菌群,因此他们被任命为枯草芽孢杆菌BC121和枯草芽孢杆菌BC121M。枯草芽孢杆菌BC121发现抑制所有真菌病原体的生长在双板块分析测试,包括a . alternata c . graminicola f . moniliforme f .病菌sp. ciceris, f .病菌sp. ricini, f . semitectum r .以上,美国rolfsii。清楚地观察抑菌圈之间的菌丝和细菌培养(图1)。10天的潜伏期后,细菌生长的真菌菌丝团,没有抑菌圈的观察菌丝的生长。应变BC121M显示绝对没有任何抑制真菌的测试。dual-liquid文化分析表明,枯草芽孢杆菌菌株BC121迟钝的真菌与控件相比增长60% (图2)。菌丝生长的微观观察与枯草芽孢杆菌BC121显示异常的存在与肿胀和扭曲菌丝(图3),与细菌细胞菌丝的表面是殖民。另一方面,菌丝生长与BC121M文化显示正常菌丝体的特性类似于控制菌丝。双重文化的连续稀释样本显示,同样数量的细菌细胞,表明类似的应变增长率BC121和BC121M双重文化(数据未显示)。

试验是由co-inoculating指数期增长细菌培养为6 h, 12 h和24 h-grown真菌文化中描述的材料和方法。真菌菌丝体的生长在Czapeck-Dox媒介48小时30°C没有细菌细胞(-■),与枯草芽孢杆菌BC121(-■),或与枯草芽孢杆菌BC121M (——)。三个实验的数据平均值代表运行在每次复制。

纯化的几丁质酶酶

的总细胞外蛋白质提取枯草芽孢杆菌BC121使用甲壳素柱层析法纯化和分数显示几丁质酶活性进一步纯化使用交联葡聚糖凝胶过滤柱G-50列。筛选了分数被收集并存储在4°C。反相高效液相色谱纯化蛋白的分析揭示了一个高峰在280 nm的洗脱时间15分钟。具体活动,净化和恢复酶的每个净化步骤进行了总结表1。具体活动有一个6.86倍增加的纯化的几丁质酶与原油提取。纯化蛋白分数12% sds - page分离出对应于大约一个乐队。25 kDa,它被任命为Chi25 (图4)。

酶活性和稳定性

几丁质酶活性降低浊度测量的反应混合物,胶体几丁质和纯化酶如前所述[21]。Chi25所表现的具体活动1.03 U /毫克。几丁质酶活性也证实使用生色p-NP寡聚物——(GlcNAc)。产生的Chi25 p-nitrophenol三聚物的和四聚物的形式而不是二聚chito-oligosaccharides (图5)。释放pNP型测量和Chi25被发现的具体活动类似于上述方法获得的值。pH值的影响以及温度对几丁质酶活性Chi25在材料和方法进行了描述,在一个连续的观察几丁质酶活性增加pH值4.5至6.5,减少活动,进一步提高博士观察最大的几丁质酶活动的最佳pH值在6.5和稳定pH值范围6 - 7.5 (图6)。同样,温度对酶活性的影响显示连续25至35°C的几丁质酶活性增加与减少活动在40°C的全损活动55°C。最大的活动是观察到35°C和其稳定性之间保持批准°C所示图6 b。

衬底Chi25生产的影响

几丁质酶的影响由枯草芽孢杆菌生产BC121不同与衬底甲壳素媒体中使用的类型。几丁质酶产量最高(0.29 U /毫克)媒体补充0.5%胶体几丁质,而几丁质酶活性为0.16 U /毫克,0.12 U /毫克,和0.06 U / mg与肿胀的甲壳素,乙二醇几丁质,分别和纯化几丁质基质。

抗真菌活性Chi25

纯化酶,Chi25显示抗真菌鉴定活动对真菌病原体,f . moniliforme f .病菌sp. ciceris, f .病菌sp. ricini,和r .以上。在圆板扩散试验,明确观察抑菌圈之间的真菌菌丝和论文光盘含有10μg Chi25 (图7)。抑菌圈的微观研究显示菌丝的存在异常特性,比如肿胀和受损细胞表面(图3 b)。Chi25的影响对真菌孢子萌发和菌丝的增长也在microtitre板块进行研究。孵化24小时后,f .病菌的孢子sp. ciceris处理10μg Chi25显示异常膨胀差的生殖管道的增长。当孢子SP缓冲增长(正常对待图3 c)。本研究揭示了强烈的Chi25抗真菌活性。

生物防除BC121应变的活动

为了研究枯草芽孢杆菌的生物防除活动BC121 f .病菌抑制sp. ciceris土壤,一锅测定实验进行了在玻璃房子里。40天后,控制植株的鹰嘴豆植物枯萎症状,如叶子下垂f .病菌引起的sp. ciceris。细菌悬液的应用枯草芽孢杆菌BC121与羧甲基纤维素作为种子混合覆盖层,抑制枯萎症状80%控制planlets相比。疾病水平明显低于未经处理的植物(p < 0.05)。枯草芽孢杆菌的BC121M应变不保护鹰嘴豆植物与真菌病原体和有类似枯萎症状控制植株(图8)。

讨论

好几种芽孢杆菌作为抗真菌药物已报告。枯草芽孢杆菌菌株GBO3被证明具有强大的抗真菌活性,产生一种特殊的成孔lipopeptides [22], b短减少生产几个鸽子豌豆的萎凋病病抗生素[23]。枯草芽孢杆菌AF1已被证明产生n -乙酰glucosaminidase酶抑制黑曲霉的生长[13]。然而,chitinolytic机制被证明是一个主要的控制机制真菌病原体[14]。土壤细菌枯草芽孢杆菌在此,我们报告一个chitinolytic BC121具有广谱抗真菌活性的各种真菌病原体检测。此外,几丁质酶酶的纯化和表征,从枯草芽孢杆菌Chi25 BC121。纯化酶,Chi25抑制真菌的生长测试。这可能是由于Chi25的水解作用于真菌细胞壁成分,甲壳素的单位,由N-acetyl-D-glucosamine加上糖,蛋白质,脂类和多糖[24]。甲壳素和其他组件的比值随文化的真菌[25]。先前的报告表明,甲壳素的几丁质酶活性不同基质[26]。 The variations in the chitinase activity against different fungal cell walls can be explained by its inability to hydrolyze the modified Glc-N-GlcN linkages in the cell walls.

两种类型的基质。,胶体几丁质和一组显色的寡聚物N-acetyl-β-D-glucosamine被用来识别Chi25 chitinolytic活动。它水解胶体几丁质,形成明确的光环地区chitin-agar盘子。根据当前的命名实践[1],几丁质(甲壳素)消化酶分为三种主要类型:endochitinases被定义为随机水解酶催化的1,4-β联系几丁质聚合物的内部网站的GlcNAc exochitinases催化diacetylchitobiose单位从甲壳素链的释放,和N-Ac-β-D-glucoaminidases法案在diacetylchitobiose exo-splitting模式。在目前的研究中,我们观察到Chi25形式p-nitrophenol N-acetyl-β-D-glucosamine三聚物的和四聚物的形式的,因此我们认为它作为endochitinase活动。据罗伯茨和Selitrennikoff[3]、植物和细菌几丁质酶功能endochitinases和抑制真菌菌丝的伸长。相比之下,exochitinases粘质沙雷氏菌,美国将和p . stutzeri没有影响菌丝的扩展。然而,endochitinases从美国marcescens导致溶解菌丝的技巧的菌核rolfsii和减少疾病发病率[9]。在这项研究中,我们观察到的真菌孢子孵化以及Chi25显示可怜的萌发,肿胀和扭曲。

此外,敌对的枯草芽孢杆菌的活性BC121温室试验也证实了。chitinolytic活动的大范围温度和pH值6.0 - -7.5之间批准°C可以便于使用的应变作为杀真菌剂。枯草芽胞杆菌BC121M突变株,未能抑制真菌生长的体外,无论是生产Chi25还是显示生物防除活动温室试验。整体研究证实了拮抗枯草芽孢杆菌BC121整个细菌与真菌病原体,原油中提取和纯化酶的水平。这种对立已经决定性地证明是由于25 kDa的几丁质酶酶的生产。此外,隔离和表征的结构和Chi25调节基因,将有助于更好地理解并最终改善枯草芽孢杆菌的生物防治BC121。

确认

我们感谢美国生物技术,印度政府和安得拉邦Pradesh-Netherlands生物技术项目,海得拉巴,印度的金融援助。

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