研究与评论:食品和乳制雷竞技苹果下载品技术杂志
菜单ISSN: 2321 - 6204
ISSN: 2321 - 6204
+ 1-845-458-6882收到的日期: 06/04/2017;接受日期:19/04/2017;发布日期: 25/04/2017
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乳制品加工设施需要控制液体奶中的腐败微生物，以进入市场并增加利润。液态奶早期变质的主要原因是能够在冷藏温度下生长的孢子形成细菌和巴氏消毒后污染(PPC)微生物。由于这两类生物具有不同的生存特征，控制它们的策略可能需要不同的方法。因此，鉴定导致变质的细菌变得至关重要。本研究的目的是确定内布拉斯加州整个生产链中与实验室热处理牛奶(80°C 12分钟)和商业巴氏消毒液体牛奶有关的腐败细菌，主要是孢子菌。使用rpoB基因和/或部分16S rDNA序列进行鉴定。在三个时期(2012年春季、2012年秋季和2013年春季)从不同地点(农场、卡车、加工厂和包装产品)收集了生奶和巴氏灭菌奶样本。所有生牛奶和一些巴氏消毒牛奶样品(2013年春季)在实验室中热处理(80°C, 12分钟)，以消除营养细胞，允许孢子唯一存活。所有牛奶样品在(5±1°C)冷藏条件下储存21天。在不同的货架期时间点收集细菌分离株，并使用rpoB和/或16S rRNA测序进行鉴定。 A total number of 207 bacterial isolates were identified. The isolates obtained from laboratory heat-treated raw milk samples included Bacillus spp. (84%), Paenibacillus spp. (11%) and other sporeforming bacteria (5%); while the ones from commercially pasteurized milk samples were identified as Bacillus spp. (54%), PPC (29%), Paenibacillus spp. (12%), and other sporeforming bacteria (5%). Although most of the isolates were identified as sporeforming bacteria, PPC is still a concern in commercially pasteurized milk, especially during the filling stage. Psychrotrophic sporeformers were detected in samples from different locations throughout the production chain, thus strategies to control them would need to encompass the entire production chain.
芽孢菌,芽孢杆菌spp。Paeni芽孢杆菌sp .，巴氏消毒后污染(PPC)，腐败，微生物，巴氏消毒牛奶
在美国，预计约31%的液态奶供应在整个牛奶供应链(农场、零售和消费者)中损失。1]，由于损坏微生物．巴氏消毒液牛奶主要是由sporeforming细菌或由革兰氏阴性菌所致后巴氏灭菌法污染[2］．如果两组生物最初都存在，PPC将完成孢子形成细菌，它们将成为主要的微生物区系[3.，4］．实施改进的巴氏消毒、卫生和维护程序，大大降低了液态奶中的PPC，从而有助于延长牛奶的保质期[5］．然而，在这些改进的加工系统中，孢子形成细菌成为进一步延长液态奶保质期的微生物限制因素[2，5，6］．形成孢子的细菌可以在巴氏灭菌中存活，并通过可能形成生物膜在植物环境中存活，这种生物膜可以转移到巴氏灭菌牛奶中，从而缩短其保质期[2，6］．
奶包装上的巴氏消毒液奶编码日期(即“保质期”、“编码”或“过期”日期)取决于国家法规和加工者政策[7］．在美国，巴氏消毒奶的保质期通常在14至21天之间。[2，3.］．《巴氏奶条例》规管巴氏奶及其他奶类的生产、加工和商业化乳制品用A级牛奶生产。在农场层面，PMO规定，来自单一生产商的生奶的标准板计数(SPC)应低于100,000 CFU/mL (5 log) [8］．生牛奶必须经过巴氏消毒，以杀死通常与生牛奶有关的所有非孢子形成的人类病原体。这一目标是通过将牛奶加热到至少72°C至少15秒(高温短时间- HTST巴氏杀菌)或任何等效的温度和时间组合来实现的。A级巴氏奶在产品保质期内的SPC值应<20,000 CFU/mL，大肠菌群计数应≤10 CFU/mL [8］．
为了更好地控制巴氏奶的微生物腐败，需要评估破坏该产品的主要微生物及其在流体奶链中的来源。因此，本研究的目的是通过rpoB和/或部分16S rDNA测序，识别内布拉斯加州牛奶生产链上收集的牛奶样品(实验室热处理和商业巴氏杀菌)中存在的腐败细菌。
样品收集
了解牛奶供应链中导致腐败的细菌;2012年春季[S12]、2012年秋季[F12]和2013年春季[S13]，从内布拉斯加州的一个奶牛场和一个中型流体牛奶加工设施中收集了16份生奶和15份商业巴氏灭菌奶样本，该奶牛场独家供应。
牛奶样本从7个地点收集:[A]农场的采样口，[B]到达加工厂时的卡车罐(出口阀门)，[C]原料奶仓顶部，[D和E] HTST处理前后的在线采样口，[F]巴氏奶罐顶部，[G]填充后的最终包装牛奶样本。中给出了收集点的简化图图1．收集了生牛奶和商业巴氏消毒牛奶(包括脱脂牛奶、1%牛奶、2%牛奶、全脂牛奶或巧克力牛奶)样本。无菌采样器(QMI, St. Paul, MN)安装在采样点D和E，并在无菌袋中收集牛奶样品。所有样本都被放置在装有冰袋的冷却器中，并被运送到实验室。加工厂采用高温短时间(HTST)巴氏杀菌工艺，因此牛奶在79°C以上的温度下巴氏杀菌至少27秒(与工厂经理的个人沟通)。
图1:农场和加工厂流体奶样品采集点的简化图。采样点包括[A]农场的采样口，[B]卡车的罐出口阀，[C]生奶罐，[D和E] HTST巴氏杀菌前后的即时，[F]巴氏杀菌牛奶罐，[G]灌装后从生产线上取下的包装产品。
样品制备
生奶和商业巴氏灭菌奶样品完全混合，150毫升分流到无菌的250毫升螺旋盖瓶中。从2013年春季收集的样品中[S13]， 150 mL商业巴氏消毒牛奶的子样品也被转移到250 mL无菌螺旋盖瓶中。生牛奶和商业巴氏消毒牛奶的子样品[S13]在实验室80°C下热处理12分钟，以杀死营养细胞并选择孢子形成细菌。使用水浴，并对样品进行五组处理(基于其一致性相似性)，同时进行温度控制。经过热处理的样品立即在冰上冷却。在2012年春季和2012年秋季期间，商业巴氏杀菌牛奶样品或其等分没有提交到实验室进行热处理，假设加工厂进行的巴氏杀菌将在产品中留下与实验室热处理的相似的细菌群[9，10］．然而，从2013年春季收集的样品中，商业巴氏消毒牛奶的子样品在实验室中进行了热处理，以评估巴氏消毒样品的后处理污染的可能性。实验室热处理和商业巴氏消毒的牛奶样品在冷藏(5±1°C)下保存21天，以培养冷养孢子菌。
微生物分析与细菌分离
原料奶和商业巴氏灭菌奶样品的初始微生物质量是根据《乳制品检验标准方法》中规定的标准平板计数(SPC)和大肠菌群计数(CC)的程序进行评估的[11］．
经实验室热处理及商业巴氏消毒的奶类样本均保存于冷藏及经点算嗜中温孢子分别在热处理后第1天、第7天、第14天和第21天或收集后的计数(MSC)或SPC。样品在标准方法琼脂(SMA)上连续稀释，必要时，每个牛奶样品1毫升被镀在4个盘子上细菌在细菌计数低的样本中进行计数。细菌计数(MSC或SPC)在32°C孵育48小时后测定[11］．目测所有实验室热处理和商业巴氏消毒牛奶样品的SMA板上的菌落，每个时间点在SMA上分离出1 - 5个不同形态的菌落并进行纯度划痕。纯化的分离株在-80°C冷冻在15%甘油中进行进一步鉴定分析。
通过使用rpoB或部分16S rDNA测序，从代表牛奶加工供应链不同环节的牛奶样品中分离出的分离株根据其基因型进行了特征分析。DNA使用QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen Inc.， Ca)提取207株细菌分离株的DNA。
分离鉴定
根据rpoB基因632个核苷酸片段的DNA序列(9)，使用dranccourt等人先前描述的rpoB PCR引物进行了分型[12]和Durak等优化的PCR条件[6］．所有未扩增rpoB片段的分离株均通过16S rDNA部分测序鉴定。为此，引物PEU7 [13]及DG74 [14]用于扩增16S rDNA序列的一个片段(~700bp)，遵循Fromm和Boor描述的PCR循环条件[2］．使用T100TM Thermal Cycler (Biorad, USA)扩增rpoB和16S rDNA基因。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳(1%琼脂糖，60 V, 2 h)进行评价，将只产生一个PCR产物(碱基对大小合适)的产物用于进一步分析。PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen Inc.， Ca)按照试剂盒的方案进行纯化。纯化的PCR产物用NanoDrop ND-1000分光光度计定量。纯化的PCR产物被送往Eurofins MWG Operon进行大染料终止剂化学双向测序。所述PCR引物用于测序。
DNA序列组装和修剪为632 nt rpoB片段(对应于3534 nt rpoB开放阅读框中的1455 - 3086 ntb的仙人掌写明ATCC 10987;GenBank登录号AE017194，基因座标签BCE_0102) [6]在DNA碱基序列汇编v3。x (15］．通过检查色谱图来解决歧义，仅使用高质量的双链序列数据进行进一步分析。
以类似的方式，部分16S rDNA序列被组装和修剪，以对应于一个616-nt片段(1508 -nt 16S rDNA基因的823 - 1438)b的仙人掌写明ATCC 10987;GenBank登录号AE017194，基因座标签BCE_5738) [10使用DNA碱基序列汇编v3。x (15］．一些分离物的正向和反向序列显示，由于在给定分离物中存在多个具有不同序列的rDNA操纵子副本，在特定位置存在两个不同的核苷酸[16］．因此，部分16S rDNA序列是按照国际生物化学和分子生物学联盟命名委员会所描述的核苷酸模糊编码组装的。
最后的双链部分rpoB和16S rDNA序列用于国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸序列数据库- GenBank的相似性搜索[17]，使用Blast局部对齐搜索工具-BLAST [18］．属或种分配是基于BLAST搜索返回的顶部匹配，并与先前发表的rpoB和16S rDNA序列进行比较[3.，9，10，19，20.］
所有分析均使用对数转换细菌计数数据。所有季节的样品分为三组:实验室热处理原料奶包括直列商业巴氏奶和包装商业巴氏奶。进行方差分析，以评估这些样本组对细菌计数(SPC或MSC)的影响保质期．使用GraphPad Prism 6.04版for Windows (GraphPad Software, La Jolla, Ca)进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey多重比较检验。
微生物分析
在收到样品后，所有16个原料奶样品(农场、卡车和加工厂)的SPC均在PMO规定的监管范围内(一个农场的原料奶< 5 log CFU/mL) [8]，平均SPC为3.15 log CFU/mL(范围为2.78 - 3.79 log CFU/mL)。此外，这些样品的平均CC为1.44 log CFU/mL，范围为0.85 ~ 1.97 log CFU/mL。在所有季节，从在线位置(经过巴氏灭菌器和在罐中)收集的9个商业巴氏灭菌牛奶样品的SPC平均值为1.29 log CFU/mL，范围为0.30至1.89 log CFU/mL。6份包装巴氏奶样品的SPC均值为1.74 log CFU/mL，范围为1.11 ~ 2.31 log CFU/mL。这些结果与美国其他地区(即东北部、东南部、南部、中西部和西部)的其他研究结果相似[3.］．此外，大多数巴氏消毒牛奶样本没有显示出大肠菌群的存在。2013年春季收集的包装巴氏奶样品中，只有两份大肠菌群数量(分别为1.29和1.45 log CFU/mL)高于PMO规定的监管限制(<1 log CFU/mL)(8)。这些结果清楚地表明，加工后污染是美国行业仍然面临的问题，可以通过坚持适当的卫生处理和加工实践来减少或消除[2，3.，21］．
所有来自各个季节的生牛奶样品都在实验室中进行了热处理，以评估它们可能受到孢子形成细菌的污染。获得了所有经过热处理的原奶样品(农场、卡车和工厂)的MSC和所有商业巴氏消毒牛奶样品在冷藏期间(5±1°C)的SPC，并绘制了图来评估21天保质期内细菌数量的变化(图2)．样品组(实验室热处理、商业巴氏灭菌和包装商业巴氏灭菌)间的MSC或SPC无显著差异(P>0.05;方差分析)(分别为1.40,1.29和1.74平均对数CFU/mL)。但在第7、14和21天，包装商业巴氏奶的SPC(分别为2.48、4.95和7.60 mean log CFU/mL)显著高于对照组(P<0.05;ANOVA)高于在线商业巴氏奶的SPC(分别为1.21、2.46、4.25平均对数CFU/mL)和实验室热处理生奶的MSC(分别为1.37、1.58、2.20平均对数CFU/mL)。实验室热处理生乳样品间充质干细胞差异不显著(P>0.05;ANOVA)在整个货架寿命;显著增加(P<0.05;分别于第14天和第21天观察包装奶和在线商业巴氏奶样品的SPC的方差分析。这些结果表明，在这三组样品中存在不同的微生物种群和不同的腐败潜力。
图2:细菌计数，报告为2012年春季、2012年秋季和2013年春季在A农场和A工厂收集的热处理生奶(n=16)、在线商业巴氏杀菌奶(n=9)和包装商业巴氏杀菌奶(n=6)的中温孢子计数(MSC)或标准板计数(SPC)。原料奶样品在80°C下热处理12分钟。实验室热处理和商业巴氏消毒的牛奶样品在5±1°C下保存，并在保质期内电镀。柱状表示标准差，不同字母表示存储期间差异有统计学意义(p<0.05)。
在后处理或热处理后的第1天和第7天，本研究评估的实验室热处理生奶和商业巴氏灭菌奶样品中，100%的计数低于PMO监管限值4.3 log CFU/mL [8］．虽然为生产HTST巴氏灭菌奶提供了高质量的原料奶，但根据PMO的规格，包装好的商业巴氏灭菌奶样品的保质期没有超过21天。保存14天后，94%的实验室热处理样品、100%的巴氏灭菌后样品、67%的罐中巴氏灭菌乳和17%的包装巴氏灭菌乳样品的细菌计数<4.3 log CFU/mL。事实上，牛奶样品计数低于PMO规范的百分比[<4.3 log CFU/mL]8]]在保质期研究结束时(21天)，随着产品在整个加工过程中的移动而减少。到第21天，94%的实验室热处理生奶、67%的巴氏灭菌奶、33%的罐式巴氏灭菌奶和0%的商业包装巴氏灭菌奶达到了PMO为巴氏灭菌奶制定的监管限制。因此，正如其他研究表明的那样，植物因素(如PPC和加工条件)对巴氏灭菌奶保质期的影响可能比生奶质量更大[2，21］．特别是，几项研究指出，PPC是美国HTST巴氏消毒液牛奶腐败的反复原因[2，3.，21]，而由PPC引起的巴氏奶的细菌腐败主要与灌装过程有关[5］．总的来说，这项研究的结果反映了美国许多加工厂在控制PPC方面面临的持续挑战。实施改进的巴氏消毒、消毒和维护规程以及适当培训员工有助于在整个加工厂消除商业巴氏奶中的PPC [2，3.，21］．特别是，定期对填料的每个喷嘴的胶杯部分进行例行维护和更换，已被证明是减少灌装过程中PPC的好策略[5］．
细菌分离物的鉴定
从保质期[d)第1、7、14和21天]牛奶样品的细菌计数板(MSC或SPC)中筛选出207株分离株。根据rpoB或16S rDNA序列进行鉴定，其中2012年春季分离株64株(d1=20, d7=16, d14=12和d21=16)， 2012年秋季分离株60株(d1=19, d7=9, d14=9和d21=23)， 2013年春季分离株83株(d1=26, d7=15, d14=15和d21=27)。在这些分离株中，只有132株产生了rpob基因的PCR扩增物。其余75个分离株使用16S rDNA的部分片段进行鉴定。
基于rpoB和部分16S序列的微生物多样性在所有季节和时间点的实验室热处理生奶(LHR)，商业巴氏杀菌(CP)和实验室热处理商业巴氏杀菌牛奶(LHCP)中被展示图3．每个物种的流行率以从每个样本组的样本中获得的分离株数量(n)的百分比表示。由于分离株是从样本中获得的，以代表其多样性而不是其真实流行率，因此应谨慎解释这些饼图所代表的数据。图表所报告的流行率与生奶样品的细菌种群中分离菌的流行率不直接相关;而是在分离过程中寻求更广泛的多样性时，分离物的分布。尽管如此，所有牛奶样本中有很高比例的分离菌被鉴定为芽孢杆菌分别从实验室热处理的生牛奶、商业巴氏杀菌牛奶和实验室热处理的商业巴氏杀菌牛奶样品中分离出84%、54%和61%。类似地，这种孢子形成细菌属已被其他研究人员在整个农场到餐桌连续体中确定，如先前报道[9，10，20.，22］．所有样本类型均存在Paeni芽孢杆菌占总分离株的11 ~ 29%不等。这是相当相关的Paeni芽孢杆菌sp .以其在冷藏条件下生长的能力而闻名，并负责酶的产生，导致液体牛奶在储存期间变质[20.，22］．尽管先前已经报道了几种孢子生菌在低温条件下生长的能力(即Paeni芽孢杆菌spp, Viridi芽孢杆菌spp.，以及B. weihenstephanesis等)[3.，20.］．Paeni芽孢杆菌sp .是本研究分析样品中发现的最常见的冷养孢子形成类群。
图3:的分布芽孢杆菌spp。Paeni芽孢杆菌从2012年春季、2012年秋季和2013年春季从A农场和A工厂收集的实验室热处理生奶(n=101)、商业巴氏杀菌奶(n=75)和实验室热处理巴氏杀菌奶(n=31)中分离得到的其他孢子菌和PPC分离物。
在商业巴氏奶样品中，由于PPC, 15个样品中有9个被冷养性非孢子形成细菌污染，占从该组样品中收集的分离株的29%。与这些样品相关的细菌菌株被鉴定为地衣芽。(27%),假单胞菌spp。(11%),Paeni芽孢杆菌spp。(9%),b . safensisExiguobacterium spp.(7%)。存在假单胞菌属是PPC的指示，因为这些生物在巴氏杀菌过程中被杀死是众所周知的。当商业巴氏消毒牛奶样品被热处理时得到的结果证实了这一评估。当从LHR和LHCP样品中分离出的菌株被选择来代表它们的微生物多样性时，所获得的菌株完全是孢子形成物，如芽孢杆菌地衣芽(45%),b . safensis(14%)和Paeni芽孢杆菌odorifer(6%)。
在冷藏货架期研究中，25%的LHR、66%的CP和20%的LHCP样品在冷藏期间SPC或MSC的增加大于2对数。这些结果表明，约有20-25%的原始和加工样品被嗜冷孢子形成细菌污染。商业巴氏消毒的样品除了被其他非孢子形成细菌(即革兰氏阴性菌)污染外，还被孢子形成细菌污染。一般来说，被非孢子形成细菌污染的牛奶样品在第21天的细菌计数(SPC或MSC)高于被孢子形成细菌污染的牛奶样品。特别是被污染的牛奶样品假单胞菌第21天最高SPC (7.23 ~ 8.6 log CFU/mL);相比之下，仅被孢子形成细菌污染的牛奶样品在第21天显示出较低的细菌计数(3.26 - 6.30 log CFU/mL)。这些结果证实，革兰氏阴性菌在冷藏巴氏消毒牛奶中比孢子形成菌生长得更快，从而在保质期结束时掩盖了孢子形成菌的存在[3.，5］．
从整个冷藏库的实验室热处理样品中收集的分离株的微生物多样性描述在图4．先前的研究报告了孢子形成细菌的主要种群从芽孢杆菌种虫害,Paeni芽孢杆菌特别是在冷藏储存经热处理的生奶及巴氏消毒奶期间[3.，19］．这种变化与植物的营养特性有关Paeni芽孢杆菌然而，在目前的研究中，从2012年收集的生奶样品中分离出的分离株在储存期间没有观察到这种转移。这可能表明这些样本最初被极低水平的嗜冷菌株污染。事实上，人们相信生牛奶中耐冷孢子形成细菌的存在可能低至0.003 - 3.5 CFU/ml [23］．然而在2013年，细菌数量从芽孢杆菌sp .和其他孢子Paeni芽孢杆菌在生奶和巴氏奶样品中观察到孢子虫(图4)［24］．
图4:基于实验室热处理生奶(LHR)和实验室热处理巴氏杀菌奶(LHCP)样品中rpoB和部分16S序列的微生物多样性，按时间点(第1、7、14和21天)对S12、F12和S13进行分析。n表示每个时间点检测到的分离株数量。
对牛奶样品的保质期分析表明，在这个特殊的设施中，牛奶在经过加工链的过程中会降低质量。这表明加工和消毒程序与原料奶质量同样重要。结果表明，20 ~ 25%的牛奶样品被孢孢子菌污染。由于它们能够像其他孢子菌一样在巴氏灭菌中存活，乳制品生产商和加工商需要制定策略，在整个加工供应链中全面减少这些微生物。将巴氏消毒液牛奶的保质期延长到21天以上取决于这一领域的进展。可以采取的一些干预措施包括使用沙子作为垫料，清洁乳房及其乳头，以及改善挤奶室和加工设施的卫生。
这项工作得到了中西部乳业协会和内布拉斯加州美国乳业协会的支持。作者还感谢质量管理公司(QMI)为在线牛奶样品的收集提供无菌采样器。来自内布拉斯加州奶牛场和工厂的所有者、经理和员工的贡献得到了认可。
