研究和评论:食品和乳品雷竞技苹果下载技术杂志》上
菜单ISSN: 2321 - 6204
ISSN: 2321 - 6204
+ 1-845-458-6882收到的日期:06/04/2017;接受日期:19/04/2017;发布日期:25/04/2017
访问更多的相关文章研究和评论:食品和乳品雷竞技苹果下载技术杂志》上
乳制品加工设施需要控制腐败微生物液体牛奶中以达到市场和增加他们的利润。早期损坏的主要贡献者液体牛奶在冷藏状态下sporeforming细菌生长的温度和巴氏灭菌后污染(PPC)有机体。因为这两组的生物有不同的生存特点,战略控制它们可能需要不同的方法。因此,识别细菌导致腐败就变得非常重要了。本研究的目的是确定有害细菌,主要是芽孢菌,与实验室相关热处理牛奶(80°C 12分钟)和commercially-pasteurized液体奶,整个生产链内布拉斯加州。识别使用rpoB基因和/或部分完成16 s rDNA序列。生和巴氏杀菌奶样本收集来自不同位置(农场、卡车、加工厂和包装产品)三个时期(春天- 2012年秋天春天- 2012和- 2013)。所有原料和一些巴氏杀菌奶样品(春天- 2013)在实验室热处理(80°C, 12分钟)来消除营养细胞允许独家孢子的生存。牛奶样品都储存在冷藏条件下(5±1°C)在21天。收集细菌分离株在不同保质期时间点和确定使用rpoB和/或16 s rRNA测序。 A total number of 207 bacterial isolates were identified. The isolates obtained from laboratory heat-treated raw milk samples included Bacillus spp. (84%), Paenibacillus spp. (11%) and other sporeforming bacteria (5%); while the ones from commercially pasteurized milk samples were identified as Bacillus spp. (54%), PPC (29%), Paenibacillus spp. (12%), and other sporeforming bacteria (5%). Although most of the isolates were identified as sporeforming bacteria, PPC is still a concern in commercially pasteurized milk, especially during the filling stage. Psychrotrophic sporeformers were detected in samples from different locations throughout the production chain, thus strategies to control them would need to encompass the entire production chain.
芽孢菌,芽孢杆菌spp。Paeni芽孢杆菌spp, Post-pasteurization污染(PPC),腐败,有机体,巴氏杀菌牛奶
在美国,大约31%的牛奶供应注定液体牛奶总估计损失在整个牛奶供应链[农场、零售和消费者][1),由于腐败微生物。牛奶巴氏杀菌液主要是被宠坏的sporeforming细菌或由于后由psychrotrophic革兰氏阴性细菌巴氏灭菌法污染(PPC) [2]。如果两组生物最初存在,PPC完成sporeforming细菌和他们将成为占主导地位的微生物区系3,4]。实施改进的巴氏灭菌、卫生和维护过程已经大大减少了PPC液体奶,因此,有助于延长牛奶的保质期5]。然而在这些改进的处理系统,sporeforming细菌成为微生物限制因素进一步扩展液体牛奶的保质期2,5,6]。Sporeforming细菌可以存活巴氏灭菌和持续在工厂环境中可能形成生物膜,可以转移到巴氏杀菌奶从而减少其保质期(2,6]。
牛奶巴氏杀菌液代码日期标注(例如,“sell-by”, “code” or “expiration” dates) on milk packages depends on state regulations and processors policies [7]。在美国,巴氏杀菌奶的保质期通常不同14至21天(2,3]。巴氏杀菌奶条例(PMO)调节生产、加工和巴氏杀菌奶和其他的商业化乳制品生产的“A”级的牛奶。在农场一级,PMO指定原料奶从单个生产者应该有一个标准平板计数(SPC)小于100000 CFU /毫升日志(5)[8]。原料奶必须巴氏消毒杀死所有non-sporeforming人类病原体通常与原料奶有关。这一目标是通过加热牛奶最少72°C至少15秒(高温短时间-杀菌巴氏灭菌)或任何温度和时间的组合。年级”“巴氏杀菌奶应该有一个程控< 20000 CFU /毫升和大肠杆菌数≤10 CFU /毫升在产品保质期(8]。
策略来更好地控制微生物腐败的巴氏杀菌奶需要评估的主要微生物破坏本产品整个液体牛奶链及其来源。因此,本研究的目的是确定变质牛奶样品中细菌(实验室热处理和商业巴氏杀菌)收集在牛奶产业链内布拉斯加州使用rpoB和/或部分16 s rDNA测序。
样品收集
了解细菌在这牛奶供应链造成损坏;总共16生和15商业巴氏杀菌奶样本收集2012年春天(S12), 2012年秋季(F12)和2013年春季(向)从奶牛场和中型流体内布拉斯加州的牛奶加工厂,提供专门的奶牛场。
牛奶样品收集从七个网站:[A]抽样港农场,[B]卡车坦克(出口阀门)抵达加工厂,[C]原料奶仓,(D和E)在线取样港口之前和之后对瞬时杀菌治疗,[F]的巴氏杀菌奶坦克,和[G]最后包装牛奶样品后填料。收集点的简化图提出了图1。原始和commercially-pasteurized牛奶(包括脱脂、1%、2%,整个或巧克力)样本收集。无菌取样器(QMI、圣保罗、锰)安装在采样点D和E,和牛奶在无菌袋收集的样本。所有样本被放置在冷却器包含冰袋和被运到实验室。加工厂使用高温短时间(HTST)加热杀菌过程,因此牛奶巴氏杀菌温度高于79°C至少27秒(个人通信与工厂经理)。
图1:简化图的液体牛奶样本收集点在农场和加工厂。采样点在农场,包括(一)采样端口[B]卡车坦克出口阀,[C]原料奶坦克,前后(D和E)杀菌巴氏灭菌,[F]巴氏杀菌奶坦克,和[G]打包产品取自填料后的直线。
样品制备
生和商业巴氏杀菌奶样本完全混合,和150毫升整除转移到无菌瓶250毫升螺旋帽。从收集到的样本2013年春天(向),使商业巴氏杀菌奶150毫升的也转移到无菌瓶250毫升螺旋帽。原料奶,使商业巴氏杀菌奶(向)是热处理实验室80°C的12分钟杀死营养细胞和选择sporeforming细菌。使用水浴和样本处理五组(基于其稠度相似之处),以及温度控制。热处理样品立即在冰上冷却。商业巴氏杀菌奶样品或整除的,没有提交的热处理实验室在2012年2012年春季和秋季,假设执行的巴氏灭菌加工厂将类似的细菌数量产品的热处理在实验室(9,10]。然而,从样品收集在2013年的春天,使商业巴氏杀菌奶的热处理在实验室评估潜在的后处理巴氏杀菌样品污染。实验室热处理和商业巴氏杀菌奶样本维护下制冷(5±1°C)为21天丰富psychrotrophic芽孢菌。
微生物分析和细菌隔离
原始的最初的微生物质量和商业巴氏杀菌奶样品评估根据程序定义了标准板计数(SPC)和大肠杆菌计数(CC)的标准方法检查奶制品(11]。
实验室热处理和商业巴氏杀菌奶样本保持在制冷和枚举嗜中温孢子计数(MSC)或程控天(d) 1、7、14和21 post-heat-treatment或主要负责,分别。样品被连续镀琼脂稀释标准方法(SMA)和在必要的时候,1毫升的牛奶样本spread-plated / 4板允许细菌枚举较低的样本中细菌计数。细菌计数(MSC或程控)测定在32°C孵化后48 h (11]。所有实验室的细菌菌落出现在SMA板热处理和商业巴氏杀菌奶样本视觉检查,和1到5殖民地不同形态分离和纯度的SMA在每个时间点。纯化分离冻结在-80°C的15%甘油为进一步识别分析。
隔离来自牛奶样品代表不同的点的牛奶处理供应链是基于他们的基因型特征,利用rpoB或部分16 s rDNA测序。DNA207细菌分离与QIAmp提取DNA迷你包(试剂盒Inc . Ca)。
分离鉴定
子类型化是根据632年的DNA序列的核苷酸片段rpoB基因(9)通过使用先前描述的rpoB PCR引物Drancourt et al。12)和PCR条件优化Durak et al。6]。所有的隔离rpoB部分没有放大,他们被部分16 s rDNA测序。为了达到这个目标,引物PEU7 [13]和DG74 [14)被用来放大一个片段(~ 700个基点)的16 s rDNA序列,PCR循环条件后所描述的弗洛姆和不懂礼貌的人2]。T100TM热循环仪(美国Biorad)被用来放大rpoB和16 s rDNA基因。PCR产物进行评估通过琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖1%,60 V 2 h)的收益率只有一个PCR产品与适当的碱基对(大小)被用于进一步分析。使用QIAquick PCR产品纯化PCR净化设备(试剂盒Inc . Ca)后设备的协议。纯化PCR产品量化使用NanoDrop nd - 1000分光光度计。纯化PCR产品被双向测序与大染料终结者化学欧陆坊MWG操纵子。和描述一样的PCR引物用于测序。
DNA序列组装,削减632 - nt rpoB片段(对应3534 - 1455 - 3086新台币nt rpoB开放阅读框b的仙人掌写明ATCC 10987;加入基因库AE017194数量,轨迹标记BCE_0102) (6在基极DNA序列汇编v3。x (15]。歧义是通过考试来解决只色谱和高质量的双链序列数据用于进一步分析。
以类似的方式,部分16 s rDNA序列组装,减少对应616 - nt片段(nt的823 - 1438 1508 - nt 16 s rDNA基因b的仙人掌写明ATCC 10987;加入基因库AE017194数量,轨迹标记BCE_5738) (10使用汇编v3下贱的DNA序列)。x (15]。一些孤立的正向和反向序列显示两种不同的核苷酸的存在在一个特定的位置由于存在多个副本rDNA操纵子序列在一个给定的不同分离(16]。因此,部分16 s rDNA核苷酸序列组装使用歧义代码所描述的命名法委员会国际联盟的生物化学和分子生物学。
最终的双链部分rpoB和16 s rDNA序列用于相似性搜索对国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸序列数据库——基因库17),使用爆炸局部比对搜索工具爆炸(18]。属或种作业是基于爆炸前返回的匹配搜索和rpoB发表的比较与先前的和16 s rDNA序列(3,9,10,19,20.]
对所有分析、对数转换细菌计数数据。样本所有季节都组织在三组:实验室热处理原料奶,在线商业巴氏杀菌奶和打包商业巴氏杀菌奶。方差分析是评估这些样本组对细菌数量的影响(SPC或MSC)保质期。单向方差分析之后,图基的多个对比测试了使用GraphPad Prism 6.04版本Windows (GraphPad软件,拉霍亚,Ca)。
微生物分析
收到的样品,所有16个原料奶的程控样本(农场,卡车和加工厂)监管限制(原料奶中从一个农场< 5日志CFU /毫升)成立于PMO (8),平均程控3.15日志CFU /毫升(从2.78到3.79日志CFU /毫升)。此外,这些样品是1.44的意思是CC日志CFU /毫升,和从0.85到1.97不等日志CFU /毫升。对于所有季节,对SPC意味着9商业巴氏杀菌奶从在线收集的样本位置(巴氏消毒器和坦克之后)是1.29日志CFU /毫升,和从0.30到1.89不等日志CFU /毫升。6对SPC意味着包装巴氏杀菌奶样品是1.74日志CFU /毫升,和从1.11到2.31不等日志CFU /毫升。这些结果类似于其他的研究已获得美国其他地区(即。、东北、东南、南、中西部和西部)[3]。此外,大多数的巴氏杀菌奶样品没有显示大肠杆菌群的存在。只有两个打包巴氏杀菌奶样品收集在2013年的春天,大肠杆菌群数(分别为1.29和1.45的日志CFU /毫升)高于监管限制(< 1日志CFU /毫升)成立于PMO(8)。这些结果清楚地表明,后处理污染是我们行业仍然面临着一个问题,可以减少或消除,坚持适当的卫生处理和加工实践(2,3,21]。
原料奶样本所有季节中热处理实验室评估他们的潜力与sporeforming细菌污染。所有热处理的MSC原料奶样品(农场、卡车和植物)和SPC的所有商业巴氏杀菌奶样品在冷藏库(5±1°C)获得和策划评估细菌数量的变化超过21天的保质期(图2)。MSC或程控,样本人群(实验室热处理,商业巴氏杀菌和包装商业巴氏杀菌),没有显著差异(P > 0.05);方差分析)在第一天(1.40、1.29和1.74意味着日志CFU /毫升,分别)。不过,在7天、14和21日程控包装商业巴氏杀菌奶(2.48、4.95和7.60意味着日志CFU /毫升,分别)明显增加(P < 0.05;方差分析)程控的在线商业巴氏杀菌奶(1.21,2.46,4.25意味着日志CFU /毫升,分别)和MSC的实验室热处理原料奶(1.37,1.58,2.20意味着日志CFU /毫升,分别)。MSC实验室热处理原料奶样品没有显著差异(P > 0.05;方差分析)在保质期;而显著增加(P < 0.05;方差分析)程控包装和在线商业巴氏杀菌奶样本观察白天14和21天,分别。这些结果表明,不同的微生物种群的存在与各种腐败潜在其中三套样品。
图2:细菌计数,报告为嗜中温孢子计数(MSC)或标准平板计数(SPC)热处理原料奶(n = 16),在线商业巴氏杀菌奶(n = 9)和包装商业巴氏杀菌奶(n = 6)收集在2012年春季农场和工厂,2012年秋季和2013年春季。原料奶样本在80°C的热处理12分钟。实验室热处理和商业巴氏杀菌奶样本举行5±1°C和镀保质期。酒吧表示标准偏差和不同字母表示存储期间统计差异(p < 0.05)。
天1和7后处理或post-heat-treatment, 100%的实验室热处理生和商业巴氏杀菌奶样品评估在这项研究中有数量低于4.3的PMO监管限制日志CFU /毫升(8]。虽然提供了一个高质量的原料奶生产杀菌的巴氏杀菌奶,没有包装商业巴氏杀菌奶样品达到保质期基于PMO规格超出21天。经过14天的存储、实验室热处理样品的94%,100%的样本后巴氏消毒器,67%的坦克和巴氏杀菌奶17%的巴氏杀菌奶包装样品细菌计数< 4.3日志CFU /毫升。事实上,牛奶样品的百分比与下面的枚举PMO规范(< 4.3日志CFU /毫升(8]]的货架寿命研究(21天)减少产品整个处理。白天21日实验室热处理原料奶的94%,67%的巴氏杀菌奶后巴氏消毒器,坦克巴氏杀菌奶的33%和0%的商业包装满足建立的监管限制PMO巴氏杀菌奶。因此植物因素(PPC和加工条件等)可能会有更大的影响力在巴氏杀菌奶保质期比其他原料奶质量的研究表明(2,21]。特别是,一些研究也指出PPC杀菌消毒液体牛奶变质的反复出现的原因在美国(2,3,21],巴氏杀菌奶由于PPC的细菌侵蚀主要与充型过程(5]。总的来说,这项研究的结果反映了不断的挑战,许多加工厂在美国控制PPC的脸。实施改进的巴氏灭菌、卫生处理和维护协议以及适当的培训员工可以有助于消除PPC商业整个加工厂(巴氏杀菌奶2,3,21]。特别,一杯常规维护和更换的橡胶杯从每个喷嘴部分填料定期,已经被证明是一个好的策略在降低PPC在灌装过程中(5]。
识别细菌隔离
总细菌数的选择207隔离板(MSC或程控)从牛奶样本在其保质期(天(d) 1、7、14和21]。这些隔离被确定基于rpoB或16 s rDNA序列,包括64年从2012年春季(d1 = 20, d7 = 16, d14 = 12和d21 = 16),从2012年秋季60 (d1 = 19日d7 = 9, d14 = 9和d21 = 23)和83年从2013年春季(d1 = 26日d7 = 15, d14 = 15和d21 = 27)。在这些分离株中,只有132了rpoB-gene PCR扩增子。另外75隔离被确定使用16 s rDNA部分的部分。
基于rpoB微生物多样性和部分16 s序列在实验室热处理生(LHR),商业巴氏杀菌(CP)和实验室热处理商业巴氏杀菌奶(LHCP)提出了所有季节和时间点图3。每个物种的流行表达在一个百分比的基础隔离(n)的数量从每个样本组样品。因为隔离从样本代表获得多样性而不是他们真正的流行,这些饼图所代表的数据进行解释时应特别谨慎。普遍报道的图表并不直接与细菌的分离株的流行人口生奶样品;而是隔离的分布,当一个广泛的多样性中寻求孤立。尽管如此,高百分比的牛奶样品被确认为隔离芽孢杆菌spp。(占84%、54%和61%的隔离从实验室热处理生、商业巴氏杀菌和实验室热处理商业巴氏杀菌奶样本,分别。同样,这个sporeforming细菌属已被确定在整个状态连续被其他研究人员之前报道(9,10,20.,22]。所有样本类型显示的存在Paeni芽孢杆菌从11种虫害不同隔离总数的29%。这是非常相关的Paeni芽孢杆菌已知种虫害的能力在冷藏条件下生长和酶负责生产导致液体牛奶储存期间损坏(20.,22]。尽管之前报道了芽孢菌生长在低温条件下的能力(例如,Paeni芽孢杆菌spp, Viridi芽孢杆菌spp。b . weihenstephanesis,在其他一些)[3,20.]。Paeni芽孢杆菌种虫害是最常见的psychrotrophic sporeforming小组在分析样品在当前的研究中找到。
图3:的分布芽孢杆菌spp。Paeni芽孢杆菌spp。其它芽孢菌和PPC隔离从实验室获得热处理鲜奶(n = 101)、商业巴氏杀菌奶(n = 75)和实验室热处理巴氏杀菌奶(n = 31)收集从农场和工厂在2012年春季,2012年秋季和2013年春季。
在商业巴氏杀菌奶样品,9 psychrotrophic污染的15人non-sporeforming细菌由于PPC,占29%的隔离从这组收集样本。这些样品被确认为菌株地衣芽。(27%),假单胞菌spp。(11%),Paeni芽孢杆菌spp。(9%),b . safensis(8%)和Exiguobacterium spp。(7%)。的存在假单胞菌属PPC的迹象,因为这些生物是众所周知的在巴氏灭菌过程中被杀。这一评估结果证实的商业巴氏杀菌奶样品热处理时。当从LHR隔离和LHCP样本被选来代表他们的微生物多样性,获得的隔离是专门芽孢菌等芽孢杆菌地衣芽(45%),b . safensis(14%)和Paeni芽孢杆菌odorifer (6%)。
在冷藏保质期的研究,25%的LHR, CP的66%,和20%的LHCP样本显示大于2日志增加程控或冷藏期间MSC。这些发现表明约20 - 25%的原材料样本污染psychrotrophic sporeforming细菌。商业巴氏杀菌样本也含有芽孢菌除了其他non-sporeforming(即细菌。psychrotrophic革兰氏阴性细菌)。一般来说,细菌计数(SPC或MSC) 21天是高污染的牛奶样品non-sporeforming细菌比sporeforming细菌。特别是,牛奶样品污染假单胞菌种虫害和Pantoea种虫害显示最高的程控日志CFU /毫升(7.23 - -8.6)在21天。相比之下,牛奶样品污染只与sporeforming细菌细菌计数显示低(3.26 - 6.30日志CFU /毫升)白天21。这些结果证实,革兰氏阴性细菌的增长速度在冷冻巴氏杀菌奶比sporeforming细菌,因此伪装芽孢菌的存在保质期结束时(3,5]。
分离出的微生物多样性从实验室热处理样品收集整个冷藏库中描述图4。先前的研究已经报道转变的主要人口sporeforming细菌芽孢杆菌种虫害,Paeni芽孢杆菌种虫害在冷藏的热处理生和巴氏杀菌奶(3,19]。这种转变与psychrotrophic特点有关Paeni芽孢杆菌spp。然而,在当前的研究中没有发现这种转变在存储中从原料奶样品收集在2012年获得的隔离。这可能表明,这些样本最初psychrotrophic水平极低的菌株污染。事实上,相信在场的耐寒的sporeforming原料奶中的细菌可能低至0.003 - 3.5 CFU /毫升(23]。然而在2013年,人口转变的细菌芽孢杆菌种虫害和其它芽孢菌Paeni芽孢杆菌种虫害在原始和巴氏杀菌奶样本(图4)(24]。
图4:基于rpoB微生物多样性和部分16 s序列在实验室热处理原料奶(LHR)和实验室热处理巴氏杀菌奶(LHCP)牛奶样品的时间点(天1、7、14和21)S12, F12和向。n的值表明隔离标识在每个时间点的数量。
保质期的牛奶样品分析表明,在这个特殊的设施,牛奶降低它的质量在整个处理链。这表明,处理和卫生处理程序一样重要原料奶质量。关于芽孢菌的细菌,结果表明,20 - 25%的牛奶样本污染psychrotrophic芽孢菌。因为他们的生存能力巴氏灭菌,其它芽孢菌,牛奶乳制品生产商和加工商需要开发战略,将导致这些生物体的整体降低整个供应链处理。延长保质期的牛奶巴氏杀菌液超出21天取决于进步。一些干预措施,可以应用包括使用砂床上用品材料,乳房和乳头的清洁,改善卫生处理的挤奶厅和处理设施。
这项工作是支持的中西部奶业协会和美国内布拉斯加州奶业协会。作者还要感谢质量管理有限公司(QMI)提供无菌取样器收集的内联牛奶样品。的贡献所有者、管理者和员工的奶牛场和植物内布拉斯加州是承认的。
