蓝绿藻对白化小鼠曼氏血吸虫感染的免疫组化活性及抗蠕虫作用

摘要

采用寄生虫学标记物评价BGA的抗血吸虫活性。另外，用100 mg/kg BW BGA单独或联合250 mg/kg BW PZQ处理曼氏链球菌感染小鼠后，扫描电镜检查了曼氏链球菌成虫的形态变化。结果表明，BGA、PZQ或联合治疗曼氏链球菌感染小鼠后，小鼠体重显著下降肝与曼氏链球菌感染小鼠的脾脏相比。与此同时，BGA、PZQ或联合使用均显著降低了线虫总负担，显著降低了肝脏虫卵数/g肠．BGA和/或PZQ对肝脏和肠道的卵图模式均有显著影响。血管生成的下降在BGA和PZQ联合治疗组最为明显，其中血管内皮生长因子(VEGF)在窦状窦中的表达差异显著降低。的电子显微镜经BGA治疗后，曼氏绦虫成虫肿胀、空泡化、被盖脊融合，结节棘消失或缩短，糜烂、开裂、脱皮。本研究显示BGA通过抑制血吸虫病所需的血管生成和对成虫的恶化作用显示出显著的抗血吸虫活性。

关键字

血管生成，蓝绿藻，寄生虫学参数，扫描电镜

介绍

在血吸虫病流行的国家，血吸虫病仍然是一个主要的公共卫生问题感染三种主要血吸虫中的任何一种[1]。在慢性血吸虫病中，疾病的病因与卵子在宿主组织中的累积沉积过程有关，其中对曼氏血吸虫卵的免疫反应是细胞介导的，并受到细胞因子、细胞和体液反应的正负调节，导致以卵周围肉芽肿形式组织的细胞成分重新聚集[2，3.]。肉芽肿反应之后，开始发生纤维化，导致更持久的疾病后遗症[4]。

控制血吸虫病是世界各地许多研究项目的平均目标[4]。吡喹酮(PZQ)对血吸虫的作用已在许多国家进行了研究。大多数研究都是关于其治疗曼氏链球菌的疗效，并报道了不同的治愈率和减少卵子排泄率[5]。Ismail等报道PZQ不能预防再感染，对幼血吸虫无效，仅对已经发育的肝脏和脾脏病变有有限的作用[6]。这种耐药性的发展引起了许多研究人员对替代药物的注意。

蓝绿藻(BGA)作为有益健康的食物和药物开发的原料已引起人们的关注[7]。Aphanizomenon Flos-Aquae (AFA)是一种淡水单细胞蓝绿色藻类，自发生长在上克拉马斯湖(德国)，是一种营养丰富的食物来源，因其增强健康的特性而被食用[8]。AFA是蓝色光合色素藻蓝蛋白(PC)的重要来源，PC被认为具有强抗氧化和抗炎作用[9，10]。此外，Vadiraja等人、Romay和Gonzalez报道，c -藻蓝蛋白，BGA的组成部分，被证明具有保护肝脏、关节炎和最重要的抗炎作用[11，12]。BGA还通过清除与血吸虫病相关的ROS来提高PZQ的抗血吸虫疗效。此外，它还表现出保护肝脏的活性[13]。补充BGA可以改善抗氧化能力，而不会对肝肾功能产生有害的副作用。BGA对小鼠肝脏和肾脏的保护作用可能与其清除ROS的特性有关。此外，BGA还表现出诱导造血祖细胞产生血细胞的能力，这些血细胞在增强免疫反应和维持个体健康状况方面发挥作用[14]。

mansoni的被膜是药物作用的重要靶点，因为它与化合物直接接触。雷竞技网页版被皮是一个屏障，将其与外部环境隔离，并确保重要功能的维持。它负责吸收营养物质，代谢脂质和胆固醇，组织增殖和修复以及药物的选择性吸收，因此被认为是抗血吸虫药物的重要靶点[15]。通过这层特殊的被膜，成虫进行基本的生存活动:从宿主体内吸收血液中的营养物质，并能够从宿主体内逃脱免疫主人对他们到场的反应[16]。

血管生成是指由原有的毛细血管后小静脉形成新的内皮血管，是炎症性疾病、伤口修复和癌症的一个特征[17]。此外，血管生成和纤维化的关系最近被证明在包括肝血吸虫病在内的一些病理条件下的纤维化发病机制中发挥作用[18]。血管生成在血吸虫病中起着复杂而非凡的作用，这可以从几个与血管内皮生长因子(VEGF)阳性染色相关的血管增殖的焦点区域来说明[19]。

本研究旨在通过扫描电镜观察BGA单独或联合PZQ对曼氏链球菌感染小鼠的一些寄生虫学和免疫组化参数以及成虫地形的影响。

材料与方法

材料

吡喹酮(PZQ)片(600 mg/片)是从SEDICO中获得的制药连队(10月6日城市-埃及)。蓝绿藻(BGA)片(250mg) (Aphanizomenon flos aquae)从德国制药工业公司(Life Blau-Green Alge, Hergestellt, Deutschland)获得。将BGA或PZQ片剂研磨后悬浮在蒸馏水中，用来自哈佛生物科学公司的不锈钢弯曲喂针(长度50.8毫米，规格18)口服。

动物与实验设计

70只成年雄性瑞士白化小鼠(25±2 g)购自埃及吉萨Theodor Bilharz研究所(TBRI)的血吸虫生物供应计划(SBSP)单位。实验前，在Menufiya大学理学院动物学系的动物室，动物被隔离并让它们适应环境一周。动物在标准实验室条件下处理，光照/暗循环12小时，温度为25±2°C。他们可以免费获得标准的食物和水;所有实验都是按照实验动物的护理和使用指南进行的。曼氏血吸虫埃及株的尾蚴是从购得的受感染的亚历山德拉生趾螺中获得的生物埃及吉萨Theodor Bilharz研究所(TBRI)供应中心。感染组40只小鼠皮下感染尾蚴(70±5条/只)[20.]。

动物随机分为7组，每组10只，如下所示:I组(N):未感染的对照小鼠。第二组(BGA):未感染的小鼠每天给予BGA治疗，连续15天。第三组(PZQ组):未感染的小鼠每天用PZQ治疗，连续3天。第四组(曼氏链球菌感染):感染对照小鼠。V组(感染+BGA):感染小鼠在感染后第7周给予BGA治疗，连续15天。VI组(感染+PZQ):感染小鼠在感染后第7周给予PZQ治疗，连续3天。第七组(感染+PZQ + BGA):感染小鼠感染后第7周，BGA连续治疗15天，PZQ连续治疗3天。治疗结束后(感染后第9周)处死所有动物。

根据Utzinger等人的研究，对于接受PZQ的组，小鼠口服PZQ，每次剂量为250mg /kg/只，连续三天。[21]。BGA组按照Kuriakose和Kurup的方法，以100mg /kg/只的剂量口服小鼠，连续给药15天[22]。

寄生虫学的参数

曼氏线虫的负担

处死动物，按Duvall和Dewitt报道的方法灌注肝血管[23]。

卵子数

卵细胞数/g组织按Cheever和Anderson计算[24]。

Oogram方法

根据Pellegrino等的研究，描述了检测血吸虫卵不同发育阶段的百分比的方法。25]。

免疫组化法测定肝血管内皮生长因子(VEGF)

小鼠肝组织立即固定在10%中性缓冲福尔马林溶液中，并包于石蜡中。采用标记链霉亲和素生物素法(Hus和Raine)进行免疫组化染色。简单地说，脱蜡后再水化的切片(5 μm厚)用0.3%过氧化氢在甲醇中处理30分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.2)洗涤3次。切片用乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲溶液(pH 8.0)微波煮沸20分钟，然后室温冷却20分钟。在室温下用2%正常山羊血清阻断非特异性结合15分钟。然后在37℃下用一抗处理(VEGF:一种单克隆小鼠抗体(Labvision目录No. 8)。MS-146-R7)作为1毫升现成抗体在室温下1小时供应。PBS冲洗后，切片用生物素标记的二抗孵育10 min, PBS冲洗。加入过氧化物酶偶联链霉亲和素20分钟后用PBS冲洗。最后，用3,3 -二氨基联苯胺和过氧化氢作染色剂，用苏木精反染。阴性对照用PBS代替一抗。切片使用Carl-Zeiss光学显微镜检查(Oberkochen，德国)[26]。

扫描电子显微镜检查

从感染的治疗小鼠和相应的对照组中制备曼氏链球菌成虫进行电子显微镜检查。将蠕虫固定在2.5%戊二醛和2%多聚甲醛0.1 M甲酸酯缓冲液(pH 7.4)中。然后用去离子水清洗样品;在50%、80%和无水乙醇中逐级脱水。样品在二氧化碳临界点干燥器中干燥。用胶体银胶粘剂涂料将样品安装在铝样品存根上。安装好的样品被涂上一层薄薄的金蒸汽[27]。扫描电镜图像使用埃及坦塔大学科学学院的Jeol JSM 5300扫描电子显微镜和Jeol TFC-1100离子溅射设备拍摄。

统计分析

数据以均数±标准差表示。采用学生t检验比较均数之间差异的显著性[28]。当p<0.05时接受显著性水平。

结果

BGA和PZQ对体重和相对器官重量百分比的影响

为了研究BGA和PZQ对正常小鼠和感染S. mansoni小鼠体重增加的影响，在实验前和实验后分别对体重进行投资(表1）.在实验开始时，小鼠的体重在25到27克之间。感染后9周，正常对照组小鼠平均体重为30.8±1.5，正常治疗组间无显著性差异。与正常对照组相比，曼氏链球菌感染后小鼠体重显著降低(P< 0.05)。与此同时，BGA和PZQ联合治疗后，曼氏葡萄球菌感染小鼠的体重较曼氏葡萄球菌感染小鼠显著增加(P< 0.05)。结果:与未感染曼氏链球菌的对照组相比，感染曼氏链球菌后小鼠肝脏和脾脏重量均显著增加(P< 0.05)。另一方面，BGA或PZQ以及BGA和PZQ联合治疗后，曼氏葡萄球菌感染小鼠的肝脏和脾脏重量较曼氏葡萄球菌感染小鼠明显下降。

表1:BGA和PZQ对曼氏链球菌感染小鼠肝脾重量的影响

BGA和PZQ对曼氏链球菌感染小鼠部分寄生虫学参数的影响

蠕虫的负担

表2说明了BGA和PZQ对不同研究组动物曼氏线虫负担的影响。结果表明，与曼氏链球菌感染小鼠相比，BGA或PZQ治疗曼氏链球菌感染小鼠以及BGA和PZQ联合治疗可显著降低曼氏链球菌感染小鼠的总虫量(P< 0.05)以及平均雄性、雌性和偶数(P< 0.05)。此外，BGA和PZQ以及BGA和PZQ联合治疗后，曼氏葡萄球菌感染小鼠的总虫量较曼氏葡萄球菌感染小鼠显著降低(P< 0.05)。

表2:PZQ、BGA及联合用药对小鼠曼氏虫体负担及虫卵数的影响

卵子数

结果载于表2经BGA、PZQ及BGA、PZQ联合治疗后，曼氏葡萄球菌感染小鼠肝脏和肠道组织卵细胞数/g明显低于对照组(P< 0.05)。结果表明，与单用BGA和PZQ相比，BGA和PZQ联合治疗曼氏葡萄球菌感染小鼠，能显著降低肝和肠组织的卵泡数(P< 0.05)。

Oogram模式

如表3与曼氏葡萄球菌感染组相比，BGA、PZQ及BGA、PZQ联合治疗的曼氏葡萄球菌感染小鼠肝脏和肠道组织的卵谱图均显著降低(P< 0.05)。结果还表明，肝脏和肠道的未成熟和成熟卵子数均显著减少;而死卵显著增加。结果表明，与单用BGA和PZQ治疗曼氏链球菌感染小鼠相比，BGA和PZQ联合治疗曼氏链球菌感染小鼠肝脏和肠道组织中成熟和未成熟卵子数量显著减少(P< 0.05)。与单纯BGA和PZQ治疗组相比，BGA和PZQ联合治疗组死卵显著增加(P< 0.05)。

表3。曼氏葡萄球菌感染与PZQ、BGA或其联合治疗对曼氏葡萄球菌感染小鼠卵图模式的影响

肝血管内皮生长因子(VEGF)表达检测

血吸虫病骨膜肉芽肿中血管内皮生长因子(VEGF)阳性。结果显示于图1 b，显示曼氏链球菌感染对照组肉芽肿周围增生血管高表达。另一方面，在曼氏葡萄球菌感染小鼠中，BGA和PZQ以及BGA和PZQ联合治疗的VEGF免疫组化染色显示，VEGF在肉芽肿周围(血管领)的少数血管内皮细胞中有中度表达(图1c, 1d和1e）.

BGA对成虫地形的影响

图2显示未处理的感染小鼠感染9周后，经扫描电镜观察曼氏链球菌被膜表面恢复情况。它有许多带有刺的大结节，结节之间的区域(结节间基质)没有刺图2A及2C．

感染组小鼠在感染7周后给予100 mg/kg蓝绿藻，连续给药15天。治疗组蚯蚓被膜表面出现多种变化。背表面结节可见广泛棘缺失，乳头状孔异常增宽，多泡，部分炎症(图2B、2D)。腹侧吸盘出现异常结构改变，包括分叶、收缩、部分棘脱落和宿主炎症细胞聚集(图2F)。

感染后第9周采集成虫，扫描电镜观察形态。在结节间(结节间基质)没有棘(图2A和2C)。在感染后49天给予BGA (100 mg/kg)的小鼠感染后9周，扫描电镜观察到蠕虫形态损伤。背表面结节可见大量棘缺失，乳头状孔异常变宽，大量泡(b)和部分炎症(b, D)。腹侧吸盘可见结构异常改变，包括分叶、收缩、部分棘缺失和宿主炎症细胞聚集(图2E和2F)。

讨论

本研究结果显示，与正常对照组相比，曼氏链球菌感染小鼠的肝脏和脾脏重量显著增加。而用BGA或PZQ以及蓝绿藻和PZQ联合治疗曼氏链球菌感染小鼠，与曼氏链球菌感染组相比，肝脏和脾脏的重量显著减轻。

本研究结果显示，用BGA或PZQ治疗曼氏链球菌感染小鼠，以及BGA和PZQ联合治疗15 d后，蠕虫负担明显减轻。结果表明，PZQ及其与BGA联合使用对虫体负担的抑制作用最强，而BGA单独使用对虫体负担的抑制作用最强。此外，BGA和PZQ以及BGA和PZQ联合治疗感染S. mansoni的小鼠后，卵量显著下降。上述结果表明，PZQ和BGA及其联合使用均对线虫总负担有抑制作用，导致虫卵数显著减少。因此，这种抑制作用导致肝脏和脾脏重量下降。

这些数据与Massoud等人使用没药提取物治疗血吸虫病的结果一致，并将肝脏和肠道卵子负荷的显著降低归因于蠕虫负荷的减少，或可能是雌性蠕虫产卵能力的降低[29]。马哈茂德等人也报道了同样的观察结果，他们报告说，用黑草油治疗曼氏链球菌感染的小鼠后，蠕虫的负担和虫卵负荷均有所降低[30.]。此外，目前的研究结果与Coutinho等人的报道一致，即感染曼氏链球菌的小鼠肝脏重量增加，这种肝肿大可能是由于与血吸虫病相关的胶原蛋白的形成[31]。此外，Nessim和Mohamed记录了抗炎药双氯芬酸，与未处理的对照组[32]相比，显示出蠕虫和组织虫卵负荷的显著减少。此外，我们的结果与Jatsa等报道的PZQ或/和绿枝霉(Clerodendrum umbellatum)治疗曼氏链球菌感染小鼠引起肝脾重量减轻的结果一致[33]。此外，Allam也报道了姜黄素可有效减少曼氏链球菌感染小鼠的蠕虫和组织-卵负担[34]。他还指出，由曼氏链球菌感染引起的肝脾肿大和嗜酸性粒细胞增多在姜黄素治疗后得到很大改善。与此同时，Mohamed等人发现口服白面狼疮(100 mg/kg)可减少曼氏链球菌感染小鼠的蠕虫负担和产卵量[35]。

此外，本研究结果与Kamel等人的报道相一致，他们报道了在感染小鼠体内恢复的曼氏线虫数量和感染治疗小鼠肝脏和肠道中卵/g组织的数量在使用Chenopodium ambrosioides、Conyza dioscorides和Sesbania的甲醇提取物后的减少率[36]。此外，Reda等人报道了同样的观察结果，认为吡喹酮或/和辐射减毒疫苗是抗血吸虫药物有效的有力证据，可显著降低蠕虫负担百分比、卵图和卵子数[37]。此外，El-Lakkany等人;Kasinathan等人和Costa-Silva等人记录了用PZQ治疗血吸虫病可显著降低肝脏和肠道的卵子负荷以及雌性蠕虫的生产能力[38-40]。Liu等人也发现了同样的结果，证明了PZQ对小鼠体内S. mansoni成虫的杀灭作用。据报道，PZQ加速了寄生虫的钙摄取，导致成年血吸虫被皮损伤，暴露在蠕虫表面的抗原而触发细胞体液免疫反应[41，42]。然而，这会导致蠕虫脱离血管壁的内皮[43]。BGA表现出抗血吸虫活性，用BGA治疗可显著降低蠕虫负担和肝脏或肠道卵细胞数/gm。

本研究采用血管内皮生长因子(VEGF)免疫组化方法，对不同组小鼠肝脏进行了血吸虫病期间血管生成的研究。结果显示，曼氏葡萄球菌感染小鼠肝脏VEGF高表达，这一发现与Lenzi等和Botros等报道的曼氏葡萄球菌感染小鼠肝脏部分VEGF免疫表达表现为增殖血管的高表达相一致[44，45]。

BGA或PZQ以及BGA和PZQ联合治疗后，曼氏链球菌感染小鼠血管生成减少。血管生成的减少在BGA和PZQ联合治疗的感染动物中最为明显，与BGA或PZQ治疗的小鼠相比，VEGF在窦状窦中的表达差异显著减少。这些数据与Botros等人的研究结果一致，PZQ联合蒿甲醚治疗曼氏链球菌感染小鼠可导致少量血管新生和较轻的组织病理学表达。在吡喹酮治疗后的血吸虫病小鼠中也报道了类似的观察结果[46]。另外，Tawfeek等报道了高感染强度血吸虫病患者血清中VEGF水平显著升高。此外，Nagle等研究表明BGA通过降低VEGF的表达来诱导肝脏保护[47-49]。此外，Kim等人记录了海蓝藻作为肝保护剂，减少胃肠道诱导的血管生成和细胞凋亡癌症．此外，Dobolyi等人发现β-胡萝卜素被描述为一种潜在的抗炎和血管生成作用，因为增殖血管的表达较少。此外，目前的研究结果与Mondul等人的报告一致，表明用β-胡萝卜素和维生素E治疗吸烟者可降低血清VEGF水平，从而防止淋巴管生成[50-52]。

本研究首次记录了蓝绿藻对曼氏链球菌感染小鼠的治疗引起的曼氏链球菌被膜改变。在本研究中，仅100 mg/kg蓝绿藻的剂量可引起被盖表面的大量变化，包括肿胀、空泡或泡疱、被盖脊的融合。观察到的形态变化可能是蓝绿藻杀死蠕虫的机制。腹侧吸盘的交替必然会导致失去与血管的粘附能力，从而使血液中的营养物质更难摄取。这一结果与Xiao等报道的用蒿甲醚治疗感染曼氏链球菌的小鼠引起被皮表面广泛改变，血吸虫肿胀、空泡化的结果一致。

作者对血吸虫表面超微结构的改变进行了研究，以评价其抗血吸虫作用药物(53，54]。

结论

总之，本研究可能为提高BGA可能最终在治疗或预防涉及曼氏链球菌感染的疾病方面具有治疗潜力提供信息。BGA联合PZQ可能是该领域未来工作的目标，以评估这种联合治疗的可能性。

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