免疫组织化学扩散活动的调查在欧洲狍(Capreolus Capreolus)在胚胎滞育后通过使用ki - 67

文摘

欧洲狍Capreolus Capreolus)是最常见的游戏在德国高繁殖率。此外,狍有着特殊的繁殖策略,包括胚胎滞育,它的特点是一个可逆逮捕胚胎囊胚阶段发展。狍胚胎滞育大约五个月。然而,没有完整的胚胎逮捕增长,但有丝分裂活动是减少到最低水平。滞育发生不会引起胚胎死亡和复活后滞育,囊胚胚胎增长迅速伸长,在其他哺乳动物一样快。这导致了结论,滞育后胚胎细胞表现出较高的扩散率。ki - 67蛋白被广泛用作增殖细胞的标志,因为它存在于所有细胞分裂的活跃阶段,但它在静息细胞缺席。在这里,我们描述ki - 67表达的分布在欧洲狍在不同的发展阶段,利用免疫组织化学胚胎。一般来说,ki - 67蛋白表达在胚胎发生狍子。16 Bouinfixed和石蜡包埋胚胎的免疫组织化学染色显示,ki - 67蛋白检测在早期post-implantation胚胎发育阶段。 The distribution pattern and staining intensity of Ki-67 expressing cells varied in different organs of the embryo ranging from clear nuclear signals to no nuclear expression of Ki-67 antigen in active stages of cell division. The Ki-67 antigen was almost ubiquitously expressed in the larger embryos with high abundance in the liver. In contrast there were only weak or no staining signals in different organs of smaller embryos.

关键字

胚胎发生、胚胎发育、胚胎滞育,ki - 67,狍子

介绍

欧洲狍Capreolus Capreolus)受益于一个特定的繁殖策略,因为它是唯一的偶蹄动物胚胎滞育(偶蹄类)和义务(也称为延迟着床)[1]。胚胎发育能力逮捕发生在许多其他的订单哺乳动物,包括有袋动物(有袋目),食虫动物(食虫类),蝙蝠翼手目,贫齿类动物(贫齿目),食肉(食肉类)和啮齿动物(啮齿目)2]。到目前为止,胚胎滞育已被确定在130多种哺乳动物物种3]。胚胎滞育的特点是一个临时逮捕或缺陷的胚胎发育2)和延迟胚胎囊胚阶段的发展(3- - - - - -6导致妊娠期的延伸。

狍mono-oestrus和交配发生在7月或8月(7]。后来胚胎滞育发生在8月初之间,直到12月底或1月初8]。囊胚到达子宫后失去透明带,约五个月期间在囊胚细胞增殖减少但不是绝对逮捕(4,8,9]。在12月底或1月初的时候,下面是一个胚胎时期的快速增长导致胎盘附件(8,9]。最后,鹿出生在4月和6月的成长得益于温和的环境因素的春季10]。

因此欧洲狍在欧洲是最普遍的游戏非常高人口密度(11,12]。最幼鹿是双胞胎,偶尔三幼鹿出生(8,13]。

许多物种,进行胚胎滞育(包括欧洲狍),胚胎滞育的确切时间和再吸收的确切点仍然未知。几乎没有什么了解的机制维护狍的滞育组织(4]。据报道,狍胚胎滞育是基因的长度固定,胚胎继续发展在一定的发展阶段14]。尽管广泛研究,胚胎滞育是一个进化现象的澄清会受到牵连一般专业知识。

囊胚细胞有丝分裂的减少可能发生在G0 / G1和G2期细胞周期取决于物种(15]。这种anti-proliferative机制运作几个月没有可持续的胚胎损伤(16]。因此,胚泡细胞凋亡是预防维护的一个基础代谢15),这样一个缓慢的扩散活动发生在狍子囊胚的滋养层17]。此外,滞育期间,某些细胞必须保持他们的能力pluri——/ multipotency确保复活的发展(18]。在1月初恢复胚胎生长导致快速伸长的胚泡8]。

在这项研究中,我们评估了核扩散活动在欧洲狍胚胎免疫组织化学检测的dna结合蛋白质ki - 67。一般来说,高的细胞增殖率预计会在胚胎组织,因为在胚胎期结束的大多数器官系统建立。在这种背景下,通过免疫组织化学方法调查ki - 67在胚胎组织中是特别有趣的。建立了ki - 67抗原作为上下文中的增殖细胞的重要标志诊断和预后研究肿瘤相关疾病(19- - - - - -26]。ki - 67抗原只存在在增殖细胞中,但不是在静息细胞G027,28]。最高的表达式是描述G2M-phase的细胞周期29日]。因此,单克隆抗体对ki - 67允许一个简单的增长分数的确定一个给定的细胞群(27]。有趣的是,ki - 67抗原的具体生理功能尚不完全了解到目前为止,许多研究的焦点30.,31日]。据我们所知,ki - 67蛋白表达在胚胎发育的不同阶段数据在欧洲狍子不存在。然而,欧洲狍很容易进行研究,因为它是普通的狩猎过程中杀死了合法和一个可以容纳它没有进一步的限制。在德国,抽样胚胎是可能的,直到1月狍雌性的常规拍摄季节结束。最重要的是,有利条件给出了抽样狍胚胎。

本研究的目的是为了证明ki - 67的表达模式在胚胎发育的不同阶段相当大的变化在不同器官的胚胎。

一般来说,ki - 67蛋白表达在早期post-implantation狍胚胎。为了调查的一般能力狍组织免疫组织化学(包含IHC),我们应用SOX9-antibody欧洲狍胚胎的组织部分。

材料和方法

组织样本

从2015年12月底到2016年1月43欧洲狍(Capreolus Capreolus)胚胎和胎儿从子宫的女性狍取样,这组照片是定期在萨克森-安哈尔特州狩猎季节期间,德国。因此,没有狍特别是在这项研究中被杀。

胚胎在Bouin immersion-fixed立即的解决方案完全保护组织的完整性。paraffinembedding之前在70%乙醇洗涤后(EtOH),胚胎被使用卡尺和蔡司双目测量获取crow-rump长度(CRL)。两个胚胎,没有弯曲的抽样时,最大长度(GL)确定。

组织处理和免疫组织化学(包含IHC)

胚胎是固定在Bouin 24-36小时(根据大小)的解决方案从子宫后立即删除。在70%的乙醇EtOH几个洗后至少2天,胚胎是嵌入在石蜡。在嵌入胚胎定位获得纵向部分。16个胚胎用于免疫组织化学分析并在3μm连续切割。

主要抗体用于这项研究包括anti-monoclonal鼠标反ki - 67抗原抗体(克隆MIB-1 DakoCytomation, 7240 M, 46个毫克/毫升)1:50和多克隆抗体的稀释SOX9(微孔,AB 5535, 1毫克/毫升)的稀释1:50 0。

免疫组织化学(包含IHC) ki - 67进行自动免疫染色系统(发现XT,罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)使用南非广播公司(Streptavidin-Biotin-Complex)方法和轻拍(diaminobenzidine tetrahydrochloride)为信号检测(民建联地图工具,罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)。

一个更先进的欧洲狍Bouin-fixed胎儿(Capreolus Capreolus)免疫组织化学染色分析。不同的器官(心、肝、肾、肠和睾丸)是嵌入在石蜡和切割μm三点。肠道部分从这个欧洲狍胎儿作为一个积极的控制ki - 67,以确保交叉反应性。负控制染色进行了省略主要抗体。

免疫组织化学(包含IHC) SOX9手动执行。组织部分是deparaffinised、水化和抗原检索步骤是由微波加热部分柠檬酸缓冲(10毫米Tri-natriumcitrat-dihydrate H2O) 10分钟。与过氧化物酶阻断内源性过氧化物酶被孵化抑制试剂(EnVisionTM FLEX迷你包,高pH值,代码K8024 Dako)。孵化所有步骤进行在一个潮湿的室和主要抗体是孵化一夜之间在4°C。EnVisionTM FLEX / HRP-kit用于信号检测。3 3´-diaminobenzidine (DAB)合色原体作为衬底,梅耶尔´s苏木精复染色。

组织病理学检查

包含IHC染色部分的16个代表胚胎扫描Aperio CS2 eSlide扫描仪从徕卡生物系统。照片拍摄在横向视图左边的胚胎在40倍放大使用Aperio eSlide经理徕卡(Aperio图像范围)和使用蔡司显微镜放大63倍(AxioPHOT)和NuanceTM多光谱相机。

结果

所有胚胎都分配给post-implantation时期。43欧洲狍胚胎被测量评估morphometrically crown-rump长度(CRL)或最大长度(GL)。基于这些数据,16个胚胎用于免疫组织化学染色,代表不同的发展阶段。这些16个胚胎被分为三个主要组(表1组织病理学检查后)。16个胚胎的大小范围从crown-rump长度约4.2毫米(分别从最大长度约6.1毫米)crown-rump长度约27.2毫米(表1)。三个胚胎的照片(每组一个胚胎)作为模范地在这项研究中所示。免疫组织化学分析的细节将在接下来的段落。

表1。欧洲狍胚胎用于免疫组织化学染色。CRL:皇冠尾闾长度;* GL:最大长度

ki - 67表达的胚胎

几乎所有胚胎的这组(n = 10)仍弯曲(除了与序号1和2两个胚胎,没有弯曲时抽样),和原基的心脏,肝脏和肾脏是清晰可辨。他们有一个crown-rump长度在4.3和8.6毫米之间。只有少数细胞阳性ki - 67在最小的胚胎。图1显示了一个欧洲狍胚胎crown-rump长度约4.2毫米,代表集团即概述的标本在胚胎器官的位置了图2一个。ki - 67染色信号是肝脏中检测不到(图1 b)和心脏(图1 d)最小的胚胎。只有小ki - 67表达在肾脏和主要位于细胞的上皮tubuli (图1 c)。只有少数有丝分裂细胞被发现没有ki - 67染色信号。明确的和众多ki - 67染色信号在旁边的开发大脑系统局部心室腔(图1 e耳泡)和(图1 f)。ki - 67的另一个有丝分裂细胞染色观察信号在间质(图1 e)。在所有情况下,ki - 67阳性细胞被认定为有丝分裂细胞。

总结这些数据,只有很少或没有ki - 67表达在不同器官的胚胎。所有标本的组我表现出这个分布模式。事实上,半定量评估的基础上的幻灯片,ki - 67表达的增加的趋势与集团内部增加胚胎大小。三个最小的组我透露更多的有丝分裂细胞的胚胎以积极ki - 67信号比有丝分裂细胞没有染色信号。

ki - 67中型胚胎表达

这些胚胎(n = 7)已经弯曲,和最突出的器官原基是肝脏和心脏(选项卡。1)。有一个crown-rump长度在9.3和17.8毫米之间。图3显示了一个狍子胚胎crown-rump长度约9.3毫米,代表第二组的标本。与其他器官相比,肝脏表现出绝大多数广泛ki - 67染色信号(图2 b)。有趣的是,我们也发现有丝分裂细胞的数量,没有染色信号在肝脏。图2 c显示了更高的放大后的肝脏中期板和不同的主轴装置,缺乏ki - 67染色信号。没有ki - 67染色检测肾脏的中型胚胎(图2 d)。也有许多有丝分裂细胞缺乏染色信号。心中ki - 67抗原检测不到(图2 e)。ki - 67表达也观察到的眼睛原基(图2 f)有丝分裂细胞在发展中晶状体和视网膜内层。只有胚胎crown-rump-length约11.4毫米展出一系列中期板缺乏ki - 67染色信号。

总之,ki - 67表达适度表达所有中型胚胎。除了与ki - 67染色细胞,大量的有丝分裂细胞没有ki - 67染色观察信号在这一组。

ki - 67表达最大的胚胎

这个组的两个胚胎了crown-rump长度分别为27.2 27.2毫米(表1)。两个胚胎表现出几乎相同的ki - 67表达的分布格局。染色信号被广泛分布在整个胚胎(图3一)。最突出的发展中胚胎器官是肝脏,ki - 67表达非常丰富和位于细胞核的细胞(图3 b)。还有著名的肾脏(ki - 67信号图3 c)和肺(图3 d)。在肾脏,染色信号主要是位于管状上皮细胞。与其他器官相比,更少的信号检测心脏(图3 e)。大量染色信号观察胚胎的头部,大脑发育密度最高的系统(图3 f)。ki - 67信号与心室腔紧密结合和脉络丛。没有明显的有丝分裂细胞缺乏ki - 67染色信号被确认在这些胚胎。

讨论

根据一般的假设,胚胎具有增殖率非常高。欧洲狍胚胎(Capreolus Capreolus)逮捕胚胎发育可逆的特定能力的几个月,最低的有丝分裂活动(4,17,32]。最后,终止胚胎滞育开始有丝分裂活动的恢复(15)在12月中旬胚胎增长一样快在其他物种胚胎滞育(33]。在这种背景下,我们调查了胚胎细胞的增殖活动狍利用ki - 67抗原的免疫组织化学染色。此外,有一个关系ki - 67抗原和细胞的增长分数34)以及ki - 67蛋白表达与细胞的生理状态(35]。此外,在最近的一项研究中,扩散在狍睾丸被immunolocalization ki - 67 (36]。

据我们所知,目前的研究描述了ki - 67抗原表达在胚胎发育期间在欧洲首次狍和透露了一个有趣的ki - 67分布模式。一般我们的检查结果,我们观察到核ki - 67表达在每个检查胚胎发育阶段,可能表明,ki - 67是到目前为止在post-implantation胚胎早期表达分析。免疫组织化学检查展出ki - 67表达依赖于crown-rump-length的胚胎,它随着胚胎大小的增加而增加。因此,我们证实了强大的核ki - 67表达更大的胚胎在这项研究中,利用ki - 67抗原几乎是无所不在地表达。强ki - 67表达也可检测胎儿在欧洲狍,为验证分析的特异性和大ki - 67抗体。然而,不同ki - 67分布格局明显染色弱信号检测的小胚胎研究。这些数据给理由进一步探索的一般能力狍组织免疫组织化学在较小的胚胎。因此,我们应用的组织部分SOX9-antibody欧洲狍胚胎(Capreolus Capreolus),因为SOX9已经考虑在狍研究双性(37]。结果证实,小胚胎仍有免疫组织化学的能力。

ki - 67蛋白表达在不同器官的胚胎是高度可变的。没有顺向分布格局在各自的器官在不同的发展阶段。虽然在一些胚胎,肝组织表现出最高的ki - 67染色信号,这是在其他胚胎肾。在这种情况下,我们可以认为各胚胎不同的分布模式与特定的发展阶段相关联的特定器官在胚胎发生。另一方面,我们观察到器官省略ki - 67染色但表现出有丝分裂数据信号。同时,我们观察到狍胚胎与众多有丝分裂数据缺乏ki - 67染色信号。此外,ki - 67 -有丝分裂细胞的数量依赖于crown-rump-length的胚胎。胚胎之间的crown-rump-length 5.6毫米和11.4毫米显示一个明显更多的有丝分裂细胞缺乏ki - 67染色信号相比,最小的胚胎的crown-rump-length小于5.6毫米,更大的胚胎crown-rump长度超过11.4毫米。

对生理功能的细胞分裂期间ki - 67。ki - 67是严格与细胞增殖相关的(38),到目前为止,ki - 67的细胞division-controlling功能蛋白质被认为(30.]。流仪分析表明,ki - 67信号有其有丝分裂细胞染色强度最高(39]。每个染色体的激烈Ki - 67染色信号峰值在早期有丝分裂细胞,而Ki - 67抗原减少迅速在有丝分裂期的结束30.]。然而,有丝分裂活动可以发生没有ki - 67的存在,至少在胚胎组织,因为它也可以显示在本研究。因此,可以认为,ki - 67抗原并不是必不可少的细胞增殖。或者,另一种蛋白质继承ki - 67的功能在胚胎细胞分裂组织。因为ki - 67存在的正面和负面的有丝分裂人物相同的胚胎,很可能这另一个蛋白质的运作,具有相同的函数作为ki - 67。的确,ki - 67 -有丝分裂细胞的数量不同胚胎内广泛观察到。这就提出了一个问题是否表达的抗原ki - 67是不断在胚胎发育。

还需要进一步的调查来澄清ki - 67蛋白是否已经检测到在胚泡阶段。许多哺乳动物物种的胚胎滞育始于胚胎发育的胚泡阶段(4]。狍,孵化囊胚在扩散之前迅速逮捕了大约五个月,突然增加植入(8]。有丝分裂活动的明显的减少不会导致死亡的胚胎16]。这种特殊能力使囊胚更有趣的实验研究的发展阶段,尤其是对于生殖技术在动物繁殖。

提出数据展示的一般有效性anti - ki - 67抗体免疫组织化学考试在欧洲狍胚胎,尽管ki - 67不是每个检测到的有丝分裂图识别。更详细地评估这些研究结果,进一步狍胚胎大小不同的应该分析。此外,第二个增殖细胞的标志应包括比较染色结果,例如,细胞增殖核抗原(PCNA),这是与细胞周期相关(40,41),已经用于欧洲狍(36]。还需要进一步的检查来更好地理解ki - 67表达在不同阶段的发展在欧洲狍胚胎,尤其是在预处理和植入后早期的发展阶段。

结论

在较大post-implantation欧洲狍胚胎,ki - 67免疫组织化学产生一个清晰和强烈的染色信号,这似乎适用于定量分析。与我们的假设,ki - 67表达不是无所不在地出现在所有阶段的胚胎发育和减少胚胎较小的大小或发展的早期阶段,分别。ki - 67负的检测细胞在有丝分裂阶段进一步调查原因。

确认

我们感谢Rudiger贝洱博士教授的支持和有益的讨论。l·胡默尔的技术援助,c . Boike诉阿恩特和n Umland我将非常感谢。

引用

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