平菇提取物对Balb/c小鼠的免疫调节作用

摘要

平菇(平菇，PSC)因其对人体健康的多种益处而被广泛应用于烹饪。然而，关于其免疫调节特性的研究尚未见报道。采用索氏技术对栽培蘑菇粉进行热水浸提。将PSC提取物悬浮于CMC中，分为0.2 g/kg、1g/kg、2g/kg 3组。Balb/c小鼠每日口服，连续21 d。用不同浓度的PSC治疗小鼠，CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD14+和cd19 +细胞数量增加。有趣的是，psc处理小鼠的CD3+/CD4+和CD19+细胞显著增加。最重要的是，PSC治疗的小鼠CD4+/CD8+比值提高;提示PSC具有潜在的免疫刺激活性。此外，在psc处理的小鼠中没有检测到任何物理变化和死亡迹象。 The results suggest that PSC may improve general immune status when consumed consistently as a daily food option.

关键字

黄菇，平菇，免疫调节剂，淋巴细胞，Balb/c小鼠

简介

免疫调节及其对人类健康的前景自古就有。尽管被广泛应用，但它们在疗效方面的确切作用却很少为人所知。蛋白质、多肽和多糖等化合物通常存在于免疫调节剂中，它们对免疫系统的反应无论是在上调或下调宿主反应的特定方面都是必不可少的[1］．基本上，这些免疫调节剂增强了人体对感染的自然抵抗力[2］．免疫调节剂的作用不仅在于增强免疫细胞，还在于在免疫系统高度激活时使其正常化。因此，它是维持和调节系统现有平衡的代理人[1，3.］．这些活动主要通过吞噬刺激、淋巴样细胞刺激和细胞免疫功能增强来实现[4］．因此，植物和草药作为天然的免疫调节剂，在保持健康和提高免疫系统方面得到了极大的重视。最近，在了解日常饮食中使用的常见烹饪植物及其对各种疾病的高药用价值方面取得了许多进展[5］．

蘑菇作为一种食物来源有着悠久的历史，传统上和科学上都因其药用价值而受到赞誉。蘑菇被认为是健康食品，因为它们热量、脂肪、必需脂肪酸含量低，而植物蛋白、维生素和矿物质含量高[6-9］．此外，蘑菇还具有多种药用价值，如抗菌、抗病毒[10］．抗癌(11］．降低胆固醇水平[12]以及免疫调节作用[13，14］．

灰平菇或科学上称为Pleurotus sajor caju (PSC)，是一种常见于热带地区的可食用蘑菇。这种可食用蘑菇被认为在人类饮食中具有相当重要的地位，因为它们富含非淀粉碳水化合物、膳食纤维、β-葡聚糖、矿物质和维生素b，而且脂肪含量低。［15由于这些营养价值，PSC已被商业化种植，以满足食品和营养药品行业的高需求。［16除了营养价值外，这种PSC还具有各种重要的药用价值。最近的研究显示，PSC具有抗氧化和抗癌的特性[17并且有调节免疫系统的潜力。［18然而，迄今为止还没有在体外动物模型中对这种蘑菇的免疫调节特性进行过这样的研究。本研究通过评估灰平菇或PSC热水提取物对Balb/c小鼠淋巴细胞亚群和细胞因子水平的影响，研究灰平菇或PSC(马来西亚常见的一种蘑菇)的免疫调节作用。

材料与方法

化学物质

本研究使用的试剂为:RPMI 1650培养基购自Sigma chemical Co.(美国);羧甲基纤维素(CMC)购自美国Sigma chemical Co.;磷酸盐缓冲盐水，PBS (Amresco, USA);表面标记抗体PerCP CD3, FITC CD4, PE CD8, FITC CD14和FITC CD 19购自BD PharmingenTM(美国)。

PSC提取物的制备

栽培的干蘑菇来自马来西亚国家红麻和烟草委员会。将蘑菇磨碎，用热水提取粉末，使用渗透和索氏技术。然后将提取的溶液冷冻干燥成冻干粉状。将冻干后的提取物悬浮在粘度为0.5%的CMC中，制备成0.2 g/kg、1g/kg、2g/kg 3种不同浓度。

动物与实验设计

雄性Balb/c小鼠(6-8周龄;重量为20 ~ 25g)。老鼠被关在空气控制的房间里的聚苯乙烯笼子里。所有的动物都被饲养在动物房里，自来水是免费供应的。实验前驯化1周。将小鼠分为5组:未处理组(对照组);CMC溶液0.3 ml/小鼠日剂量(对照)，0.2g/kg PSC, 1g/kg PSC和2g/kg PSC。动物每日灌胃口服，连续21天。在实验期间，采集各组小鼠治疗前和治疗后血清。

器官与体重

记录治疗前和治疗后动物体重。在研究结束时，用颈椎脱位法处死小鼠。取脾称重，置于1ml RPMI-1640培养基15ml无菌离心管中，4℃保存，待进一步分析。

单细胞悬液的制备

将每个脾脏置于无菌培养板上，并在两个无菌玻片之间压碎。然后从组织板上收集均质悬浮液，通过70 μm细胞过滤器(BD Falcon™)过滤到新的无菌离心管中。在10°C下，以1500转/分的速度离心5分钟。丢弃上清液，用1ml PBS重悬颗粒。血细胞计计数，取5×105细胞，流式细胞仪圆底管中加入100μl RPMI。

流式细胞术测定脾脏T淋巴细胞亚群

分别用表面标记抗体PerCP CD3对脾细胞进行染色⁺， fitc cd4⁺， PE cd8⁺， fitc cd14⁺FITC CD19⁺．染色处理结束后，样品在4℃暗区孵育20分钟。随后，用1ml PBS悬浮样品，混合并再次离心。小心吸出上清液后，用500 μl RPMI重悬染色细胞，4℃保存于黑暗中过夜。采用FACSCantoTM流式细胞仪检测淋巴细胞亚群分布。

统计分析

数据以各组每只小鼠的均值±SD表示。实验进行了三次。采用社会科学统计程序SPSS 20.0版，采用Wilcoxon W检验和Mann Whitney U检验进行统计分析。当p值低于0.05时，认为差异有统计学意义(p<0.05)。

结果

PSC提取物对体重的影响

每日口服PSC提取物21天未导致任何死亡。未观察到任何毒性迹象，这可以从治疗前和治疗后末端体重的变化以及监测的体重(图1)．对治疗前后小鼠体重进行分析，PSC对小鼠体重无显著差异，对体重影响较小。

PSC提取物对细胞亚群分布的影响

给予PSC提取物的小鼠淋巴细胞亚群百分比(CD3⁺/ CD4⁺, CD3⁺/ CD8⁺, CD19⁺和CD14⁺)注射不同浓度的PSC提取物(图2 a-d)．结果显示CD3明显升高⁺/ CD4⁺和CD19⁺细胞亚群与未处理组比较。psc处理的小鼠也显示CD3增加⁺/ CD8⁺和CD14⁺尽管增量的百分比并不显著。有趣的是，CD3的种群⁺/ CD4⁺, CD3⁺/ CD8⁺, CD19⁺和CD14⁺当给予0.2g/kg的PSC提取物时，小鼠的亚群数量最高。最重要的是，psc治疗组CD4比值显著增加⁺/ CD8⁺细胞(表1)．

讨论

食用蘑菇通常用于烹饪或替代药物，可能对健康有重要影响，甚至在治疗疾病方面。以往研究显示，许多食用菌品种均具有免疫调节活性[19］．这可能是由于大量真菌化合物的存在，如多糖(主要是β-葡聚糖和一些α-葡聚糖)、蛋白多糖和蛋白质，这些化合物因其免疫调节效力和活性而被广泛报道[1］．近年来，膳食成分对多种生理活动的影响越来越受到人们的关注。由于其美味的口感和营养价值，灰蚝菇在马来西亚被广泛种植和食用[16］．既往研究显示PSC治疗多种疾病具有显著的多重作用[11，13，14，10］．然而，到目前为止，尚无关于PSC免疫作用的具体研究报道。公开其免疫特性的重要性将开启各种新的应用，包括增值食品或营养补充剂。

在目前的工作中，我们研究了口服PSC水提取物在体内模型中的作用。口服PSC后，Balb/c小鼠某些淋巴细胞亚群明显增加。辅助T细胞(CD4⁺)和细胞毒性T细胞(CD8⁺)种群在决定免疫调节的平衡状态和对内在免疫系统内稳态的反应方面已变得非常重要[20.］．先前的研究表明，一些食物来源，例如来自牛、大豆和乳清蛋白的多肽，通过增加CD4的百分比具有免疫刺激能力⁺细胞或CD4⁺/ CD8⁺比(21-23］．CD3对脾细胞的流式细胞分析⁺/ CD4⁺本研究中的抗体显示，与对照组相比，所有治疗组的T辅助细胞数量显著增加(图2一个)．但CD3无明显升高⁺/ CD8⁺经psc处理的小鼠可观察到细胞数量;尽管与对照组相比，0.2g/kg和1g/kg PSC提取物处理的小鼠表现出更高的细胞毒性T细胞数量(图2 b)．这一发现与Rubel等人的发现一致，用灵芝处理的动物报告了CD3种群的选择性减少⁺和CD8⁺在脾细胞中[24］．最重要的是，这项研究显示CD4显著增加⁺/ CD8⁺所有psc处理组的细胞。

已知蘑菇的真菌细胞壁由几丁质、β-葡聚糖和含甘露聚糖的糖蛋白组成[25β-葡聚糖是蘑菇中常见的多糖，被认为是一种有效的免疫调节剂，对T细胞和抗原提呈细胞如单核细胞和巨噬细胞具有特异性活性[1］．巨噬细胞、树突状细胞(dc)和B淋巴细胞是参与向CD4呈递外源抗原的主要细胞类型⁺T淋巴细胞。所有这些细胞都在B细胞中表达受体，即表面免疫球蛋白(slg) [26]和Fc受体(FcRs) [27]以及巨噬细胞和树突细胞中不同的甘露糖受体[28，29]调节抗原的摄取[30.使抗原呈现。本研究的结果表明，psc处理的小鼠产生了显著增加的B细胞群。然而,CD14⁺主要由巨噬细胞和dc表达的细胞在psc处理的小鼠中表达略高。前期研究表明β-葡聚糖还能促进单核细胞和巨噬细胞的增殖，具有较强的造血活性[31，32］．Shibata等报道β-葡聚糖参与巨噬细胞形态的改变，增加磷酸酶活性，脂多糖(LPS)刺激NO的产生[33］．最近的证据也表明蘑菇或β-葡聚糖可以调节促炎细胞因子的产生[24，34，35］．

总之，本研究表明，PSC具有非特异性增强宿主免疫系统体液和细胞成分的潜力。此外，PSC的阳性免疫调节很可能归因于辅助T细胞的刺激;CD4比值增加⁺/ CD8⁺细胞。随着治疗剂量的增加，淋巴细胞亚群百分比显著下降，这可能解释了最佳剂量及其疗效。因此，当以最佳比例摄入PSC并定期作为日常食物选择时，PSC可能会潜在地改善一般免疫功能。

确认

在此，我们非常感谢口腔科学学院文化实验室及口腔科学学院颅面科学实验室的工作人员在整个研究过程中所做的贡献。本研究由马来西亚理科大学1002/PPSK/910314卓越研究资助(APEX USM)资助。

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