研究与评论:药理学与毒雷竞技苹果下载理学研究杂志
菜单e-ISSN: 2322-0139 p-ISSN: 2322-0120
e-ISSN: 2322-0139 p-ISSN: 2322-0120
阿米特·古普塔＊以及Sushama R Chaphalkar
Vidya Pratishthan的生物技术学院，VSBT, Savitribai Phule浦那大学附属研究中心，印度马哈拉施特拉邦巴拉玛蒂
收到日期:24/11/2015接受日期:09/01/2016发表日期:16/01/2016
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本研究旨在从这三种药用植物的叶片中分离黄酮类化合物并进行评价在体外对人体外周血的影响单核细胞(PBMC)使用含有表面抗原(HBsAg;20µg/ml, 10µl)，并测定其HBsAg增殖、一氧化氮产生和CD14单核细胞表面标记物。结果表明，黄酮类化合物在较高剂量(25 mg/ml;50 μ l)抑制HBsAg刺激人PBMC细胞的增殖以及一氧化氮的产生，也阻止CD14单核细胞表面标记物的激活，这是T细胞激活所必需的。本文报道了Mitragyna parvifolia, Mangifera indica和Aegle marmelos对HBsAg特异性蛋白抗原的免疫抑制活性。因此，这些从药用植物中分离出来的粗黄酮类化合物可以作为一种免疫抑制剂和细胞毒性剂进行开发。
Mitragyna parvifolia, Mangifera indica, Aegle marmelos，免疫抑制,细胞毒性。
药用植物自古以来就是一种传统药物，一般用于治疗细菌、病毒和寄生虫疾病[1，2］．在这些药用植物产品中，表现出多种植物化学物质在医学领域，特别是对兽医动物和人类而言，这是不可或缺的方法，在拓展和蓬勃发展治疗和预防动物和人类疾病的新药方面发挥了重要作用[3.，4］．从药用植物产品和其他生命形式(细菌、真菌、海洋生物)中分离和纯化的天然化合物是具有传统药用特性的分子的主要来源[5］．其中，免疫抑制物质尤其引人关注。一般而言，这些药用植物产品或部分通常富含酚类化合物(类黄酮、酚酸、单宁、香豆素、木脂素和木质素)[6，7］．这些酚类化合物特别是类黄酮具有多种免疫药理作用，包括免疫调节活动(8］．因此，对药用植物产品中提取的黄酮类化合物有足够的了解是非常重要的，这不仅是因为它们的广泛用途，而且因为它们有可能引起毒性反应或与其他药物相互作用[9，10］．
类黄酮在自然界中普遍存在，是次生植物的一种代谢物并按化学结构分类，如黄酮醇/黄酮/黄酮/异黄酮/儿茶素/花青素/查尔酮等。[7，9，10］．这些类黄酮是多酚类化合物，通常存在于柑橘类水果、浆果、洋葱、欧芹、豆类、绿茶和红酒中。此外，黄酮类化合物的天然苯并-g-吡喃酮衍生物已被证明具有几种免疫药理特性，(即hepatoprotective，抗血栓抗炎和抗病毒活性)，其中许多可能至少部分地与它们的抗氧化和清除自由基的能力有关[7，10］．
Mitragyna parvifolia(茜草科)，俗称Kadamb，在印度、巴基斯坦和斯里兰卡较干燥的地区随处可见[11，12］．这种药用植物具有镇痛、解热、抗炎、抗关节炎、抗溃疡、抗氧化等多种免疫药理作用。12-14这些都被报道过，而且在科学上是可识别的。
Mangifera籼(Anacardiaceae科)，药用植物中显示出大量的多酚类化合物，并显示出大量的免疫药理活性，如伤口愈合特性;抗糖尿病；免疫调节;抗氧化剂等[15-17］．此外，这种药用植物的叶子(燃烧)可以缓解打嗝和喉咙感染。
Aegle marmelos(Rutacae科)，最常见的植物成分从叶子(柠檬醛，芦皮酚，桉树醇等)茎皮(Fagarine, marmin等)和果实(单宁，marmelide)中分离和纯化。大多数情况下，这种药用植物的叶子通常用于治疗炎症，哮喘，低血糖，发热，肝炎和镇痛[18-21］．
我们的研究目的是从三种不同的药用植物中分离黄酮类化合物，并测定其对特定蛋白抗原(HBsAg)的活性，以便利用各种免疫药理学技术检测免疫抑制活性。
收集植物材料
收集这些药用植物的新鲜和成熟的植物叶子，即Mitragyna parvifolia, Mangifera indica而且Aegle marmelos来自马哈拉施特拉邦巴拉玛蒂(浦那)Vidya Pratishthan生物技术学校(VSBT)的花园。
类黄酮提取
用于从药用植物叶片中提取粗黄酮类化合物，即Mitragyna parvifolia, Mangifera indica而且Aegle marmelos被执行。首先，用液氮(-196°C)浸渍叶子(10 g)，制备细粉末，并在100ºC下溶解在100 ml甲醇(80%)中2小时[6］．然后，用whatman滤纸收集滤液，然后突然加入乙酸乙酯(20毫升)和蒸馏水(40毫升)，定期摇动至少5分钟，然后在室温下培养过夜。孵育后，观察到两个不同的层，即上层(即乙酸乙酯)和下层(类黄酮)。最后，蒸发上面的相，即乙酸乙酯溶液，然后干燥植物提取物(类黄酮)沉淀在底部。
类黄酮定性分析
用醋酸铅法测定这三种药用植物中黄酮类化合物含量时，加入少量醋酸铅溶液，出现黄色沉淀。这种黄色沉淀表明黄酮含量的存在。
PBMC增殖试验和一氧化氮产生测定，包括CD14单核细胞表面标记
从Mangal采集了EDTA未感染人类血液样本病理实验室，Baramati为了分离PBMC使用Ficoll-Hypaque试剂。制备PBMC时，细胞通过Ficoll-Hypaque梯度离心分离，并置于组织培养板(96孔平底)中，在HBsAg (1 μg, 20 μg/ml)存在下孵育，同时连续稀释黄酮类化合物(6.25-25 mg/ml;50 μl)从3种药用植物中提取。Mitragyna parvifolia, Mangifera indica而且Aegle marmelos37℃孵育24 h后，组织培养板离心(1500 rpm, 5分钟)，从用HBsAg处理的PBMC和未处理的PBMC孔中收集上清液(100 μl)测定一氧化氮产量，然后在96孔板中加入等体积的新鲜培养基。加入MTT (5 mg/ml, 10 μl)溶液，在二氧化碳培养箱中孵育4 h。同样，将培养皿离心并丢弃上清液。在甲醛晶体中加入DMSO (100 μl)溶液，并在570 nm处的酶联免疫吸附仪上评估吸光度[22，23］．所有实验均重复三次。
采用Griess试剂(1%磺胺和0.1%萘乙二胺二盐酸，2.5%磷酸)测定一氧化氮产量，将PBMC细胞培养液(50 μl)与相同体积的Griess试剂绞碎，室温孵育10-20分钟，在微板仪中测定吸光度(540 nm) [24-26］．新鲜培养基(含10%胎牛血清的RPMI)为空白。亚硝酸盐的数量是由亚硝酸钠标准曲线确定的。
类似地，CD14单核细胞表面标记物在人PBMC中被确定(105细胞/ml)分别加或不加HBsAg (1 μg、20 μg/ml)培养24 h后，用CD14 FITC表面标记物染色。用磷酸盐缓冲盐水孵育和洗涤样品，分析有或没有HBsAg刺激的类黄酮样品[24-26]通过流式细胞仪(FACS Calibur, BD Biosciences)。
统计分析
所有数值均以均数±标准差表示，统计学分析采用单向方差分析检验(Boniferroni多重比较检验)。
PBMC增殖试验
为观察其HBsAg在人PBMC上的增殖情况，采用不同剂量黄酮(6.25 ~ 25 mg/ml;50 μl)图1．结果表明，从黄酮类化合物的叶片提取Mitragyna parvifolia, Mangifera indica而且Aegle marmelos高剂量(25 mg/ml;50 μl)，与对照组比较。这些研究以HBsAg为标准，结果显示与对照组相比，增殖显著增加。
图1:利用HBsAg研究不同剂量黄酮对人PBMC的影响。PBMC (106细胞/ml, 100 μl)与不同剂量黄酮(6.25 ~ 25 mg/ml;在含HBsAg的完全RPMI 1640培养基中(20 μg/ml, 1 μl)。MTT法检测细胞增殖。数值用Mean±S.E.表示。在570 nm处的ELISA阅读器中评估吸光度。
一氧化氮的产生
同样，在人PBMC细胞培养上清中观察到一氧化氮的测定，如图所示图2．结果表明，黄酮类化合物在较高剂量(25 mg/ml;50 μl)Mitragyna parvifolia, Mangifera indica而且Aegle marmelos与对照组相比，一氧化氮的产生显著下降。与对照组相比，HBsAg明显加速了一氧化氮的产生。
图2:不同剂量黄酮对一氧化氮生成的影响。不同剂量黄酮(6.25 ~ 25 mg/ml;HBsAg (20 μg/ml, 1 μl);培养皿孵育24小时，离心后收集上清，用于测定一氧化氮。读数以μM表示。数值以均数±标准差表示
CD14单核细胞表面标记物
不同剂量黄酮类化合物(6.25 ~ 25 mg/ml;以HBsAg为抗原，通过流式细胞术检测其对人CD14单核细胞表面标记物的影响图3．在较高剂量(25mg /ml;50 μl)时，与对照组相比，这些药用植物CD14单核细胞表面标记物呈剂量依赖性降低。
图3:流式细胞术观察不同剂量黄酮对人PBMC细胞CD14单核细胞表面标志物的影响。用CD14 FITC表面标记物对PBMC进行染色，然后在PBS中裂解和清洗细胞，并在流式细胞仪(FACS Calibur)中分析。用均数±标准差表示。对照组和处理组黄酮含量的差异采用单因素方差分析(Bonferroni多重比较检验)。＊P< 0.05;**P< 0.01;＊＊＊P< 0.001。
我们的免疫系统参与了许多疾病的病因学和病理生理机制，如细菌、病毒、原生动物等。利用各种药用植物调节免疫反应，以减轻各种人类疾病的负担，已经引起了许多研究者的极大兴趣。一般来说，药用植物中含有大量的初级代谢产物和次级代谢产物。其中一种次生代谢产物黄酮类化合物(又称生物类黄酮)是天然存在的免疫生物学化合物，常存在于植物中，如槲皮素、山奈酚、儿茶素等，可保护人体免受各种细胞内和细胞外病原体的侵害。最近，人们对药用植物中这些类黄酮的生物活性的兴趣激增，因为这些多酚成分存在于主要的膳食成分中，可以提供潜在的人类健康益处[7-9］．根据文献调查，一些类黄酮，如儿茶素显示出对艾滋病毒介导的认知衰退的神经保护作用。事实上，很高的类黄酮浓度与神经毒性不良反应有关[27］．
在本研究中，这些药用植物叶片中的黄酮类化合物，即Mitragyna parvifolia, Mangifera indica而且Aegle marmelos通过细胞培养基础试验(MTT)测定，对人pbmc中HBsAg增殖有显著抑制作用。此外，我们的小组还报告了黄酮类化合物下调了人体PBMC中一氧化氮产生的活性，这与促炎细胞因子直接相关，而促炎细胞因子在细菌、病毒和寄生虫疾病的感染和发病机制中起着重要作用[28］．
结果表明，一氧化氮试验可作为一种高效、经济、相对可靠的工具，用于初步筛选人体细胞系统内固有免疫刺激/免疫抑制及细胞毒作用化合物。最重要的是，不仅在动物巨噬细胞中，在人PBMC中，黄酮类化合物产生的一氧化氮与细胞因子产生的程度密切相关[28］．在这项研究中，黄酮类化合物有可能在有或没有HBsAg刺激的情况下抑制一氧化氮的产生。在这些研究中，与对照组相比，当体外用HBsAg激活从人PBMC中收集的细胞培养上清在刺激后24小时产生了显著更高的一氧化氮生产水平。结果表明，我们的系统中低一氧化氮检测可能与T细胞和其他免疫细胞的增殖有关。
最终目的是检验黄酮类化合物是否从Mitragyna parvifolia, Mangifera indica而且Aegle marmelosCD14单核细胞表面标记物在人PBMC中的产量下降可作为评估人细胞系统中免疫抑制和细胞毒性潜能的预测措施。此外，CD14 (55 kDa糖蛋白;多个富亮氨酸重复序列)在流式细胞术中广泛用作单核细胞标记物[23，24］．一般来说，人单核细胞表现出形态异质性，如大小的变异性，包括粒度和核形态。首先，通过单核细胞表面大量CD14(脂多糖受体)的表达来识别单核细胞。然而，随后对抗原标记差异表达的鉴定或识别表明，人PBMC中的单核细胞是异质的，这为单核细胞亚群的差异生理活动提供了第一个线索。最后，结果提示一氧化氮和CD14单核细胞表面标记物的产生可能与细胞类型及其种源有关，不同细胞对信号转导途径的要求明显不同。特别是主要由人体PBMC释放的一氧化氮和CD14标记物的测定被认为在激素免疫系统的病理生理中起着相当大的作用[28］．
在目前的研究中，我们小组发现黄酮类化合物来自Mitragyna parvifolia, Mangifera indica而且Aegle marmelos显著抑制HBsAg刺激的增殖，包括一氧化氮和CD14单核细胞表面标记物的产生。进一步的调查将集中在在活的有机体内评估了这些黄酮类化合物的免疫药理活性，并确定了有效提取物中负责免疫抑制和细胞毒作用的主要活性成分。
