农药配伍对土壤微生物的影响

关键字

乙酰甲胺磷-非靶标效应-土壤酶- npk -修正

简介

现代农业中不断出现的一个主要问题是，同时或连续施用不同种类的农药以有效控制各种害虫已成为一种普遍趋势。很明显，农药保护作物会导致土壤中的农药残留，最终导致所有这些异种化合物的下沉。人们早就知道，按推荐用量施用农药对土壤中酶活性的影响很小或没有影响[17,5]。然而，许多报告表明，当长期以高于推荐用量的农药施用于土壤时，土壤酶活性会受到显著影响[11,34]。

近几十年来，许多害虫对棉花造成的巨大经济损失引起了人们的严重关注。为了有效防治棉花主要害虫，虽然根据需要使用了几种杀虫剂，但近年来，在防治棉花主要害虫方面，主要使用了两种杀虫剂，特别是buprofezin (Applaud®)和乙酰甲胺磷(Hythene®)。虽然有更多关于其他农药单独处理的数据，但在文献中几乎没有关于这两种杀虫剂联合使用对土壤微生物活性的非靶标影响的信息。因此，在本研究中，试图评估丁丙嗪和乙酰甲胺磷联合施用对未施用氮磷钾肥料和施用氮磷钾肥料的土壤中纤维素酶、淀粉酶和转化酶活性的影响。

材料与方法

土壤集合

在印度安得拉邦(Andhra Pradesh)的半干旱地区南迪亚(Nandyal)，从种植棉花的田地(本来就非常肥沃)收集了12厘米深的土壤，已知有或没有使用过杀虫剂(buprofezin或乙酰甲胺磷)的历史。收集的样品混合、风干并在使用前通过2毫米的筛网进行筛分。其物理化学性质(表1)及微生物特征按标准程序测定。使用电极和1:25 . 5的土-水泥浆[25]测定土壤pH值。电导率用Elico电导率仪测定，在1 g土样中加入100 mL水。Johnson和Ulrich[9]描述的方法被用于估计60%的持水能力。土壤有机碳和全氮含量分别采用Walkley-Black法[14]和Micro-Kjeldahl法[8]定量。细菌及真菌种群(表2)，在两种土壤样品中均采用连续稀释镀法进行分离和计数。

本研究选用的杀虫剂和肥料

鉴于丁丙嗪(2-叔丁基-3-异丙基-5-苯基-1,3,5-噻二嗪-4- 1)和乙酰甲胺磷(O, s -二甲基乙酰磷代硫酸盐)这两种杀虫剂在印度现代农业中的广泛和密集使用，我们选择了这两种杀虫剂进行本研究。矿物肥料尿素、过磷酸钙和钾按规定的用量使用(见第1节)。

选定杀虫剂对土壤酶活性的影响

将buprofezin和乙酰甲胺磷这两种杀虫剂的商业配方在水中配制成水溶液，在试管(25 × 200 mm)中加入5 g土壤，得到不同浓度的杀虫剂组合，buprofezin +乙酰甲胺磷(2.5 ~ 10 μg g)⁻¹如Gundi et al.[7]所述。每种杀虫剂的最终浓度(以w/w为基准)分别为2.5、5.0、7.5和10.0 μg g−1土壤，分别对应0.25、0.5、0.75和1.0 kg ha⁻¹，分别为[1]。之所以选择这些浓度，是因为所选杀虫剂的现场施用剂量在~ 0.3至0.6公斤公顷之间⁻¹．此外，在一组中，接受杀虫剂组合的土壤样本用肥料进行了修改。包括对照组在内的所有试管保持60%的持水能力，并在28±4°C下孵育，3天后测试活性。培养3天后，取出3份土壤样品，测定纤维素酶、淀粉酶和转化酶活性。

相对于未处理对照的活性，计算了百分比抑制值。使用Stratton[24]所概述的乘法生存模型分析所采用的组合的相互作用数据。采用公式E = X +[(100−X)/100] × Y;其中E =混合物的预期加性效应，X =单组分A的抑制率，Y =单组分B的抑制率。实际抑制和预期抑制的平均比值显著大于或小于1.0分别表明协同作用和拮抗作用，而当实际抑制和预期抑制差异不显著时，则存在加性效应[23]。

选定土壤酶的测定

多种纤维素酶

采用Pancholy和Rice[16]以mg葡萄糖g表示的方法测定纤维素酶活性⁻¹30分钟⁻¹以葡萄糖为标准。在要求的间隔后取出三份重复的土壤样品(5 g)，放置在50 mL Erlenmeyer烧瓶中，并加入0.5 mL甲苯。将烧瓶中的内容物充分混合，15分钟后加入10 mL 0.5 M醋酸酯缓冲液(pH 5.9)，然后加入10 mL 1%羧甲基纤维素(CMC)。孵育30分钟后，加入约50毫升蒸馏水。然后用Whatman 1号滤纸过滤悬浮液，用蒸馏水将滤液量调至100ml。取合适的上清液用2 mL碱性铜试剂[13]处理;管子置于沸水浴中10分钟，冷却至室温。然后，用1 mL砷钼酸盐试剂处理混合物，然后加入5 mL蒸馏水。用分光光度计在620 nm处读出显影的蓝色。

淀粉酶

采用Cole[3]开发并经Tu[29,31]改进的方法测定未处理和杀虫剂和/或肥料处理的土壤样品中的淀粉酶活性。将5克土壤样品放入25 mL沸腾的试管中，然后加入1 mL甲苯。管子中的所有内容物充分混合，15分钟后，加入6 mL 2%的淀粉，0.2 M醋酸酯缓冲液(pH 5.5)。试管孵育48小时。土壤悬浮液用Whatman 1号滤纸过滤，滤液中还原糖含量用Nelson-Somagyi法在Elico数字分光光度计中测定，活性用mg葡萄糖g表示⁻¹48小时⁻¹．

转化酶

采用Tu[32]法测定试验土壤样品的蔗糖酶活性。将5克土壤样品放入25 mL沸腾的试管中，加入1 mL甲苯。管子里的东西完全混合了。15分钟后，在0.2 M醋酸缓冲液(pH 5.5)中加入6 mL 18 mM蔗糖，试管孵育6小时。最后，用Whatman 1号滤纸过滤悬浮液，在Elico数字分光光度计中采用Nelson-Somagyi法测定滤液中还原糖的含量。酶活性以每g土壤每6 h释放的mg葡萄糖(mg葡萄糖g⁻¹6小时⁻¹)．

结果

丁胺磷和乙酰甲胺磷对土壤纤维素酶的非靶标效应

乙酰甲胺磷处理，2.5 μg⁻¹与buprofezin组合的土壤可达7.5 μg g⁻¹土壤对酶活性有显著的增效作用(表3)．仅在5 μg时观察到加性反应⁻¹土壤中乙酰甲胺磷浓度为2.5 μg⁻¹丁丙嗪土壤。高浓度的丁丙嗪或乙酰甲胺磷具有显著毒性，对酶活性产生拮抗作用。事实上，对土壤样品进行分级施肥和杀虫剂组合，对未施用氮磷钾肥料的土壤样品的相互作用效果没有可测量的影响(表4一)．

丁胺磷和乙酰甲胺磷对土壤淀粉酶的非靶标效应

在杀虫剂组合中，丁丙嗪用量为2.5 μg⁻¹乙酰甲胺磷对淀粉酶的增效作用可达7.5 μg⁻¹土壤(表3 b)．在5 μg g时，相同的组合⁻¹在混合液中显示了对酶活性的加性作用。高浓度的两种杀虫剂组合使用对土壤淀粉酶有明显的拮抗作用。此外，两种杀虫剂联合施用对施用氮磷钾肥料的土壤淀粉酶的拮抗作用更强(表4 b)．

丁丙嗪和乙酰甲胺磷对转化酶的非靶标作用

丁丙嗪、乙酰甲胺磷等浓度2.5 μg⁻¹对土壤转化酶活性产生协同刺激作用(表3 c)．仅在2.5 μg时观察到加性反应⁻¹土中添加丁非嗪和5 μg⁻¹乙酰甲胺磷土壤然而，7.5和10 μg g的组合⁻¹不同浓度乙酰甲胺磷对土壤转化酶活性有拮抗作用。在NPK处理的土壤中也有类似的结果(表4 c)．

讨论

本研究中使用的两种杀虫剂对土壤中酶活性的非靶标作用显示出明显的悲观影响。从实验数据可以清楚地看出，土壤纤维素酶对土壤中的人为物质高度敏感。Gundi et al.[6]报道，施用效磷处理的土壤，最高可达25 μg⁻¹它既无毒，也有刺激性，但高浓度的这种杀虫剂会对土壤纤维素酶活性产生不利影响。有研究指出，虽然纤维素酶活性受到较低程度的刺激，但在施用高浓度农药(baythroid [10]， diazinon[20]等)处理土壤时，纤维素酶活性受到严重影响。在另一项研究中，溴和selecron在大部分潜伏期后都抑制了土壤中纤维素酶的活性。令人惊讶的是，Cycon和piotrowka - seget[4]报告说，异养细菌和真菌的数量最初有所下降，但在土壤中使用更高剂量的有机磷杀虫剂二嗪农时受到刺激。另一方面，低配施率对纤维素酶活性产生增效和加性反应，而高配施率对两种土壤均产生拮抗反应。[6]的一项研究发现，有证据支持单效磷与氯氰菊酯或喹啉磷与氯氰菊酯在不同水平的组合对土壤中纤维素酶活性产生增效和拮抗反应。最后，研究人员警告说，不按田间用量而按较高用量任意使用丁丙嗪和乙酰甲胺磷对土壤中的纤维素酶是有害的。

如前所述，较高浓度的丁丙嗪和乙酰甲胺磷对土壤淀粉酶活性也有毒性，许多研究报告了同样的情况[10,21,6]。例如，硫丹在32 μL和48 μL时⁻¹对培养滤液上清液α-淀粉酶活性有刺激作用，但在64和80 μL⁻¹[26]。但在其他研究中，低浓度时活性受到刺激，但当施用高浓度的单效磷、喹那磷、氯氰菊酯、氰戊菊酯[18,6]、马拉硫磷和氯菊酯[30]和其他有机磷杀虫剂[32]时，活性受到负面影响。与此相反，施用氟氯氰菊酯和吡虫啉对土壤淀粉酶活性的抑制作用在培养3周后逐渐增强。有趣的是，在浓度为930毫克千克时⁻¹，在实验室条件[19]下，fenamiphos对淀粉酶活性有有害影响，在处理62天后，淀粉酶活性降低24%。另一方面，高浓度丁丙嗪和乙酰甲胺磷组合对未改性和npk改性土壤淀粉酶活性具有拮抗作用。农药联合使用对土壤淀粉酶活性影响的文献很少。在最近的一项研究中，Gundi et al.[6]报告说，在5 μg下，单效磷和氯氰菊酯联合使用时，淀粉酶活性增加了约51%⁻¹10天孵育结束时;单独而言，增量分别为30%和17%。因此，本研究结果表明，这两种杀虫剂的高施用量，无论是单独或重复使用，还是联合使用，都对土壤淀粉酶有很大影响。

本研究还探讨了丁胺磷和乙酰甲胺磷对土壤转化酶活性的影响。这些发现的最重要的影响是，众所周知，重复使用和以较高的比例组合使用两种选定的杀虫剂会严重影响转化酶。结果表明，在1.6 μg baythroid时，蔗糖酶活性提高了110.9%⁻¹在[10]研究的最高水平上，土壤的磷含量降低了40.3%。在另一项研究中，Sreenivasulu和Rangaswamy[22]报告说，土壤中蔗糖酶活性随着杀菌剂浓度的增加而增加;在每种测试化学物质的较高比率下，酶活性受到不利影响。另一方面，在正常农业剂量下施用西威威杀虫剂对[12]土壤中蔗糖酶活性无抑制作用。相反，Tu[28]的一项研究表明，卡布酚和百菌清在沙质壤土中对转化酶活性的抑制作用暂时为1天，2天后抑制作用缓解。Voets et al.[33]的报告首次证明了长期施用阿特拉津会显著降低土壤中转化酶的活性。也许，更令人担忧的是，用氮磷钾肥料改良土壤似乎减轻了杀虫剂对转化酶的毒性。然而，Bielinska和Pranagal[2]的一项研究表明，在化学除草的同时施用高浓度的矿物肥料似乎对土壤的生物活性尤其有害。这意味着伴随的pHKCl的减少是该位点土壤酶活性大幅降低的另一个原因。因此，从以上数据可以得出结论，无论是单独使用还是组合使用，蔗糖酶对所选杀虫剂都具有高度敏感性。 But, amendment of the soil with NPK fertilizers seems to alleviate the toxicity of the insecticides towards invertase. Although these results suggest that the studied enzymes are known to be affected by the selected insecticides in vitro, it remains unclear how these are actually influenced at field level. In conclusion, insecticide combinations, at higher concentrations, resulted in an interaction leading to significant antagonistic effect on activities of all the soil enzymes tested. This clearly warrants the judicious use of insecticides at recommended doses only.

确认

我们要感谢S. Imthiyaz Ahamed博士，校长，国立P.G.学院，南迪亚尔，印度提供实验室设施，并鼓励我们进行这项研究。

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