研究与评论:微生物学与雷竞技苹果下载生物技术杂志
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上海医药工业研究所，上海，中国
收到日期:15/03/2017;接受日期:22/03/2017;发表日期:27/03/2017
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从重要的商业真菌中获得β-胡萝卜素生物合成基因的多个副本Blakeslea trispora都集成在Yarrowia lipolytica产生β-胡萝卜素。β-胡萝卜素生物合成基因来源b . trispora或毛霉菌的环状表达y lipolytica分别为,卡拉而且碳水化合物从b . trisporaβ-胡萝卜素的生成活性较高(4.35 mg/l)。为了产生更多的β-胡萝卜素，工程菌株拥有不同的拷贝卡拉，碳水化合物构建了香叶酰香叶酰二磷酸合成酶基因(GGS)和HMG- coa还原酶基因(HMG)，考察β-胡萝卜素的产量。工程菌株YC607，有三个拷贝卡拉，碳水化合物， GGS和两个拷贝HMG摇瓶培养可产生72.89 mg/l β-胡萝卜素。用甘油补料分批发酵可获得613.87 mg/l β-胡萝卜素。β-胡萝卜素生物合成基因来源b . trispora可表示为y lipolytica，多个拷贝的β-胡萝卜素合成基因可以产生大量的β-胡萝卜素。
β-胡萝卜素生物合成基因;HMGCoA还原酶;Blakeslea trispora；Yarrowia lipolytica
β-胡萝卜素是一类类胡萝卜素，已被应用于药品、营养食品、化妆品、饲料添加剂，以及用作食物着色剂[1，2］．目前，大多数β-胡萝卜素是通过化学合成或微生物发酵产生的[3.］．大规模发酵Blakeslea trispora是天然β-胡萝卜素的重要商业来源，但由于其复杂的混合菌种发酵方法，无法满足日益增长的市场需求[4］．随着合成的发展生物学而代谢工程、β-胡萝卜素生物合成基因的异源表达已成为解决当前困境的潜在策略。目前β-胡萝卜素的异源表达已取得一系列进展大肠杆菌［3.，5]和酵母系统。β-胡萝卜素得率酿酒酵母［6),毕赤酵母属pastoris［7]的含量低于大肠杆菌但大肠杆菌在食品工业中并不是一种公认的GRAS(公认的安全)生物。因此，有必要优化或研究其他酵母体系来生产β-胡萝卜素。Yarrowia lipolytica已成为近年来生产高附加值化学品的GRAS生物，例如二十碳五烯酸(EPA)，它已成为一种营养补充剂的商业产品[8］．Barth等人构造了一个y lipolytica通过优化代谢途径产生番茄红素的菌株[9］．通过引入毛霉类胡萝卜素基因，获得了产β-胡萝卜素菌株，但产量较低[10］．虽然β-胡萝卜素的生物合成途径b . trispora被阐明[11]，前期研究表明其异源表达较差。本研究的目的是确定这些基因是否在y lipolytica并进一步将β-胡萝卜素生物合成基因的多个拷贝组装到基因组中y lipolytica提高β-胡萝卜素的产量。
菌株、培养基和培养条件
大肠杆菌以DH5α(北京康温生物科技有限公司)为宿主构建质粒。y lipolytica从American Type Culture Collection (ATCC)购买的ATCC20362作为β-胡萝卜素生物合成途径的宿主。所有工程应变见补充表1。
采用LB培养基(1%蛋白胨、0.5%酵母膏和1% NaCl)培养大肠杆菌．采用YPD培养基(2%葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母膏)培养y lipolytica．采用Barth描述的最小培养基(MM培养基)培养重组菌y lipolytica［9］．
质粒的构建
本研究使用的引物和质粒列在补充表2和表3中。的序列碳水化合物而且卡拉(GenBank: AY176662)b . trispora菌株F-744，和碳水化合物(M) (Genbank: AJ238028)和carRP(Genbank: AJ250827)m . circinelloides根据菌株NRRL 2457的密码子偏倚对其进行了密码子优化y lipolytica，基于密码子使用数据库。从ATCC20362基因组中扩增出香叶酰香叶酰二磷酸合成酶基因(GGS, GenBank: XM_502923)和整合到INTF (GenBank: YALI0F3161413 - YALI0F3162449)的同源臂(INTF. 5n和INTF. 3n)。的碳水化合物，卡拉，碳水化合物(M),carRP，以及由NcoI/NotI获得的GGS消化分别转染psvv - fbain -lip1、psvv - gpd -lip2、psvv - yat1 -lip2质粒，构建psvv - fbain -表达盒碳水化合物-lip1 pWSV-GPD -卡拉-lip2 pWSV-FBAin -碳水化合物(M) -lip1 pWSV-GPD -carRP-lip2和pWSV-YAT1-GGS-lip2。随后，同源臂INTF.5N和INTF.3N，以及表达盒FBAin-碳水化合物-lip1加仑日-卡拉-lip2、YAT1-GGS-lip2分别插入到pSK-URA3中，生成pSK-B-RA-GGS-INTF-U (图1一个)．然后FBAin -碳水化合物(M)-lip1和GPD-carRP-lip2被FBAin-取代碳水化合物-lip1和GPD-卡拉-lip2生成pSK-B(M)-RP-GGS-INTF-U (图1 b)．
图1:本研究中使用的质粒图谱。(a) pSK-B-RA-GGS-INTF-U含有YAT1-GGS-lip2, GPD-carRA-lip2, FBAin-carB-lip1, URA3, inf . 5n和inf . 3n。(b) pSK-B(M)-RP-GGS-INTF-U携带YAT1-GGS-lip2、GPD-carRP-lip2、fbin - carb (M)-lip1、URA3、inf . 5n和inf . 3n。(c) pSK-HMG-URA3-INTB含有EXP-HMG-Aco, URA3, INTB.5N和INTB.3N。
从ATCC20362基因组中扩增HMG- coa还原酶基因(HMG, GenBank: XM_503558)和整合到INTB (GenBank: YALI0B700678 - YALI0B701707)的同源臂(INTB. 5n和INTB. 3n)。将NcoI/NotI切割的HMG连接到pWSV-EXP-Aco中，生成pWSV-EXP-HMG-Aco。然后，将INTB.5N、INTB.3N和EXP-HMG-Aco连接到pSK-URA3中，生成pSK-HMG-U-INTB (图1 c)．
剩余质粒的构建在补充的数据转化和培养中显示y lipolytica：采用Barth和Gaillardin的方法将URA3缺失菌株用线性DNA进行转化[12］．在100ml装有5ml YPD培养基(pH 4.0，用1 M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节)的瓶中接种单菌落，28°C震动16 h。然后将500 μl培养物转移到装有10ml YPD培养基的250ml瓶中，孵育过夜。当OD600约为5.0时，所有细胞在3500 × g下离心5 min，用TE缓冲液(pH 7.5)洗涤2次。用约20 ml 100 mM醋酸锂(pH 6.0)重悬细胞，28℃孵育1 h。最后，处理后的细胞在3500 × g下离心5 min，重悬于2 ml 100 mM醋酸锂中，得到活性细胞。将约1 μg线性化质粒与50 μg变性载体DNA (Sigma)和100 μl感受态细胞混合，在28℃下孵育15分钟，然后加入700 μl 40% PEG4000，以100转/分、28℃震动1小时，在39℃下热休克10分钟，然后加入1.2 ml 100 mM醋酸锂。将混合物铺于MM固体培养基上，在28°C下孵育4天。在28°C下采摘并培养96 h，补充图1和图2。
回收再造市建局3号标记
工程y lipolytica，接种于20ml YPD培养基中，28℃摇匀至OD600约为1.0。将细胞(100 μl)分散于含100 μg/ml 5-氟山胶酸(5-FOA)、75 μg/ml尿苷和尿嘧啶的MM固体培养基上，28℃孵育4 d。选择一个黄色的殖民地进行下一次整合。
HMG-CoA还原酶活性分析
将一个转化菌落接种于5 ml MM培养基中，28°C孵育至OD600约为1.0。随后，将1 ml培养基转入20 ml MM培养基中，28°C孵育过夜。取10ml培养基，3500 × g离心10分钟，用50mm磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤。将成球细胞重悬于600 μl裂解液中，按50%体积加入玻璃微珠。将悬浮液旋转5次，每次1分钟，并立即放置在冰上。提取液在3500 × g和4ºC下离心5分钟，悬浮液转移到新的冰管中进行活性测定。
HMG-CoA还原酶活性测定根据Asadollahi和Donald的描述进行了修改[13］．为此，将50 μl 3mm NADPH和50 μl细胞提取物加入到含有850 μl 100mm磷酸盐缓冲液的1ml石英试管中。在30℃平衡5 min后，向比色皿中加入50 μl的3 mM HMG-CoA，记录1 min内340 nm (A340)吸光度的变化。酶活性(U)定义为每分钟产生的NADP (nmol)量[14］．
以牛血清白蛋白为标准品，采用BCA蛋白检测试剂盒(北京康文生物科技有限公司)测定细胞提取物的蛋白质含量。
转基因菌株在摇瓶中的碳源优化
将一菌落转基因菌株接种于5 ml YPD液体培养基中，28℃培养至OD600约为1.0。随后，将1 ml培养物转移到含有不同浓度葡萄糖和甘油(2%葡萄糖，4%葡萄糖，1%葡萄糖和1%甘油，2%甘油，4%甘油)的20 ml培养基中，在28°C下培养96 h。
分批补料发酵生产β-胡萝卜素
对于实验室规模的培养，在5升发酵罐中进行补料分批发酵。将250 ml摇种瓶中25 ml YPD培养基接种YC607一环，28℃孵育24 h，然后将3个750 ml摇种瓶中100 ml YPD培养基分别接种5 ml培养物，28℃孵育24 h，最后将300 ml种子培养物接种到发酵罐中3000 ml YPD培养基中，28℃孵育。使用氨水将溶解氧保持在30%，pH保持在5.5。分批补料发酵时，加70g /l甘油，使甘油含量保持在2%以上。
β-胡萝卜素的提取与定量
β-胡萝卜素的定量采用高效液相色谱法[6］．取1毫升发酵液，13200 X g离心2分钟，冻干过夜，测量干细胞重量。取等量细胞进行β-胡萝卜素提取。将球团细胞重悬于1 ml丙酮中，超声搅拌30 min。丙酮提取物13200 X g离心2 min，含β-胡萝卜素的悬浮液用0.45 μm过滤器过滤后进行分析。
采用C18色谱柱(Hypersil ODS 5 μm, 4.6 mm × 250 mm)的高效液相色谱系统(Agilent 1260 Infinity)测定提取物中的β-胡萝卜素含量[15］．样品(10 μl)注入C18柱，在472 nm处检测，流动相如补充表4所示[10］．
统计分析
采用统计软件SPSS18.0进行统计分析。所有数据至少从三个独立实验中获得，以均数±标准差表示。各组间比较采用t检验，p<0.05或p<0.01为有统计学差异。
三孢白梭菌和白梭菌β-胡萝卜素生物合成基因的比较m . Circinelloides
在大肠杆菌通过表达细菌类胡萝卜素基因[3.]，但细菌类胡萝卜素基因在酵母系统中的表达活性较差[16］．Xie等人还表明，真核生物的类胡萝卜素基因比细菌的类胡萝卜素基因更适合酿酒酵母［17］．因此，密码子优化的生物合成基因(卡拉而且碳水化合物从b . trispora,碳水化合物(M)和carRP从m . circinelloides)从两个重要的微生物用于β-胡萝卜素的产生y lipolytica．将质粒pSK-B- ra - ggs - intf - u或pSK-B(M)-RP-GGS-INTF-U整合到宿主菌株Y2224中y lipolyticaATCC20362)，选择阳性菌落进行β-胡萝卜素产量分析。设计了β-胡萝卜素产量最高的转化体YC202(从b . trispora)和YM202(来自m . circinelloides)．表1结果表明，菌株YC202和YM202的生物量与ATCC20362相近，说明β-胡萝卜素生物合成途径的引入对菌株生长没有影响。YC202的β-胡萝卜素产量为4.35±0.14 mg/l, YM202的β-胡萝卜素产量为3.86±0.13 mg/l，两株菌株β-胡萝卜素产量差异有统计学意义(p<0.05)。结果表明，carRA和carBb . trispora或m . circinelloides都有作用y lipolyticaβ-胡萝卜素生物合成基因的表达水平b . trispora比那个好吗m . circinelloides在y lipolytica．
| 生物质(g / l) | β-胡萝卜素产率(mg/l) | |
|---|---|---|
| ATCC20362 | 11.63±0.62 | 0 |
| YC202 | 11.42±0.74 | 4.35±0.14 |
| YM202 | 11.71±0.57 | 3.86±0.13 |
表1:整合β-胡萝卜素生物合成基因的菌株生物量和β-胡萝卜素产量的比较b . trispora或m . circinelloides。
脂多糖产生β-胡萝卜素的代谢工程研究
HMG-CoA还原酶是甲羟戊酸途径中的一种限速酶，甲羟戊酸通常被认为是类异戊二烯前体的有效供体[18］．HMG-CoA还原酶的过表达增强了几种酵母物种中类异戊二烯的产生，如酿酒酵母［13),假丝酵母utilis［19］．通过质粒pSK-HMG-U-INTB将一个拷贝的HMG- coa还原酶基因(HMG)插入到YC202中，生成YC306。测定YC202和YC306的HMG-CoA还原酶活性。过表达HMG使YC202的酶活性由1.06±0.04 U/(mg蛋白)增加到YC306的1.77±0.06 U/(mg蛋白)，差异极显著(p<0.01)。β-胡萝卜素产量由YC202的4.35±0.14 mg/l增加到YC306的6.96±0.15 mg/l，差异极显著(p<0.01)。过表达HMG可使催化活性提高约65%，同时刺激β-胡萝卜素产量提高约60%。
以提高β-胡萝卜素的产率倍数基因采用可重复利用的URA3标记，通过序列整合引入多个β-胡萝卜素生物合成基因拷贝。URA3表型转化子中的URA3标记可以通过同源重组被切除，URA3表型转化子可以通过后续转化轮的抗foa选择被识别[20.］．重组体β-胡萝卜素生物合成的构建步骤y lipolytica显示在图2．首先，将pSK-B-RA-GGS-GUT2-U插入到YC306中，构建YC413，引入β-胡萝卜素生物合成基因的第二拷贝，产生37.45±0.87 mg/l β-胡萝卜素。利用pSK-B-RA-GGS-POX2-U对菌株YC413进行转化，获得引入β-胡萝卜素生物合成基因第三拷贝的YC511， β-胡萝卜素产量提高至53.97±0.83 mg/l。第二个HMG副本，使用pSK-HMG-U-INTA，被引入YC511，创建YC607。转基因菌株YC607含有3个β-胡萝卜素生物合成基因副本，2个HMG副本，β-胡萝卜素累积量为72.89±1.09 mg/l。各基因整合均能提高β-胡萝卜素产量，且差异极显著(p<0.01) (图3 b)．与含有1份β-胡萝卜素生物合成基因的YC202相比，β-胡萝卜素产量提高了16.8倍，表明过表达限速步骤可有效提高目标产物在异源宿主中的产量。但是，当另一个HMG拷贝插入YC607菌株时，β-胡萝卜素产量由于降低而降低生物质．结果表明HMG-CoA还原酶的增加可能导致异戊二磷酸(IPP)、法尼基二磷酸(FPP)等中间焦磷酸代谢物的积累[21]，而过量的类异戊二烯焦磷酸盐可能对细胞造成潜在的毒性作用[22］．
图2:代谢工程y lipolytica产生β-胡萝卜素。(a) YC202和YC306的HMG-CoA还原酶活性测定，U定义为每分钟产生的NADP (nmol)量。(b)工程产生的生物量和β-胡萝卜素含量y lipolytica在YPD培养基中培养96 h。
图3:碳源对YC607产β-胡萝卜素的影响。(a)摇瓶培养法在含不同葡萄糖或甘油含量的培养基中生产β-胡萝卜素。(b)生长的时间过程和β-胡萝卜素的产生y lipolyticaYC607在5升生物反应器中加料甘油。
发酵生产β-胡萝卜素
在之前的研究中，优化a发酵该过程被证明可以提高类胡萝卜素的生产酵母［6］．在摇瓶培养中研究了碳源对YC607 β-胡萝卜素产量的影响，4%甘油比2%葡萄糖可使β-胡萝卜素产量提高12% (p<0.01)。蔗糖梯度离心实验表明，在番茄红素产生过程中，大部分番茄红素储存在脂质体馏分中y lipolytica应变(9］．甘油可增加甘油激酶催化的脂体合成，使更多β-胡萝卜素储存在脂体中[20.］．
在5l生物反应器中对YC607进行补料分批培养。发酵的时间过程如图所示图3一．在此过程中，甘油的进料保持在10-20克/升。从…中可以看出图3 b50 h时，生物量和β-胡萝卜素含量急剧上升，随后生物量开始下降，80 h时β-胡萝卜素产量最高可达613.87 mg/ly lipolyticaYC607经高密度培养可产生较高含量的β-胡萝卜素。
综上所述，我们的研究结果首次报道了β-胡萝卜素生物合成基因的表达b . trispora在酵母。我们发现，引入GGS、carB、carRA和HMG的多个拷贝可以显著提高β-胡萝卜素的产量。最后，在发酵过程中使用甘油作为碳源可以促进β-胡萝卜素的产生y lipolytica可能是合成类胡萝卜素的潜在微生物工厂。
作者宣称他们没有利益冲突。
