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P - ISSN: 2347 - 2286
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上海医药工业研究所、上海
收到日期:15/03/2017;接受日期:22/03/2017;发表日期:27/03/2017
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的多个副本β-carotene从商业上重要的真菌生物合成基因Blakeslea trispora集成在Yarrowia lipolytica生产β-carotene。β-Carotene生物合成基因b . trispora或毛霉菌circinelloides表达y lipolytica分别为,卡拉和碳水化合物从b . trispora显示更高的β-carotene生产活动(4.35 mg / l)。产生更高的β-carotene数量,工程菌株窝藏不同的副本卡拉,碳水化合物,geranylgeranyl二磷酸合酶基因(gg)和β-还原酶基因(HMG)构造调查β-carotene的产量。工程应变YC607,三份卡拉,碳水化合物,gg和两份HMG可以产生72.89 mg / lβ-carotene在摇瓶文化。此外,613.87 mg / lβ-carotene获得由喂料式发酵甘油。β-Carotene生物合成基因b . trispora可以表达的y lipolytica,多个副本可以产生大量的β-caroteneβ-carotene合成基因。
β-Carotene生物合成基因;HMGCoA还原酶;Blakeslea trispora;Yarrowia lipolytica
β-Carotene类胡萝卜素,被应用到药品、保健品、化妆品、饲料添加剂,食品着色剂(1,2]。目前,大多数β-carotene是通过化学合成或由微生物发酵生产3]。大规模发酵,Blakeslea trispora自然β-carotene是一个商业的重要来源,但它不能满足不断增长的市场的需求由于其关联的复杂混合菌株发酵的方法(4]。与合成的发展生物学和代谢工程、β-carotene生物合成基因的异源表达已经成为一个潜在的战略来解决当前的困境。现在的异源表达β-carotene取得了一系列进展大肠杆菌(3,5)和酵母系统。收益率的β-carotene酿酒酵母(6),毕赤酵母属pastoris(7)低于大肠杆菌,但E。杆菌一般不是一个认为肝(通常被认为是安全的)生物使用在食品行业。因此,有必要优化或者β-carotene调查其他酵母系统产品。Yarrowia lipolytica已经成为肝生物近年来生产高附加值的化学品,如二十碳五烯酸(EPA)、已一个商业产品营养补充品(8]。巴斯等人建造了一个y lipolytica应变通过优化生产番茄红素的代谢途径(9]。创建β-carotene-producing应变通过引入类胡萝卜素基因毛霉菌circinelloides,然而收益率很低(10]。尽管β-carotene生物合成途径b . trispora是阐明11),先前的研究已经证明了差不齐的表达式。本研究的目标是确定这些基因的功能y lipolytica并进一步组装的多个副本β-carotene生物合成基因的基因组y lipolytica改善β-carotene生产。
压力、介质和文化条件
大肠杆菌DH5α(北京ConWin生物技术有限公司)作为东道主用于质粒结构。y lipolyticaATCC20362从美国购买类型文化集合(写明ATCC)用作主机β-carotene生物合成途径。所有的工程菌株补充表1所示。
磅中等(1%蛋白胨、酵母提取物,0.5%和1%氯化钠)被用来培养大肠杆菌。YPD中等(2%葡萄糖、蛋白胨2%和1%的酵母提取物)被用来培养y lipolytica。基本培养基介质(毫米)所描述的巴斯应用于培养重组y lipolytica(9]。
构建质粒
在我们的研究中使用的引物,质粒是补充表2和表3中列出。的序列碳水化合物和卡拉(基因库:AY176662)b . trispora株f - 744,碳水化合物(美元)(基因库:AJ238028)和carRP(基因库:AJ250827)m . circinelloides根据密码子2457株NRRL codon-optimized偏见的y lipolytica根据密码子使用数据库。geranylgeranyl二磷酸合酶基因(gg,基因库:XM_502923)的同源性武器(INTF.5N和INTF.3N)融入INTF(基因库:YALI0F3161413 YALI0F3162449)从ATCC20362的基因组被放大。的碳水化合物,卡拉,碳水化合物(M),carRPgg,得到NcoI / NotI消化插入质粒pWSV-FBAin-lip1、pWSV-GPD-lip2和pWSV-YAT1-lip2分别构建表达式磁带pWSV-FBAin -碳水化合物-lip1 pWSV-GPD -卡拉-lip2 pWSV-FBAin -碳水化合物(M) -lip1 pWSV-GPD -carRP-lip2, pWSV-YAT1-GGS-lip2。随后,同源臂INTF.5N INTF.3N,一起表达磁带FBAin -碳水化合物-lip1加仑日-卡拉-lip2,先后和YAT1-GGS-lip2插入pSK-URA3生成pSK-B-RA-GGS-INTF-U (图1一个)。然后FBAin -碳水化合物(M) -lip1和加仑日carRP-lip2然后代替FBAin -碳水化合物-lip1和加仑日-卡拉-lip2 pSK-B-RA-GGS-INTF-U生成pSK-B (M) -RP-GGS-INTF-U (图1 b)。
图1:质粒图用于这项研究。(a) pSK-B-RA-GGS-INTF-U窝藏YAT1-GGS-lip2、GPD-carRA-lip2 FBAin-carB-lip1, URA3 INTF.5N, INTF.3N。(b) pSK-B (M) -RP-GGS-INTF-U YAT1-GGS-lip2, GPD-carRP-lip2, FBAin-carB (M) -lip1 URA3 INTF.5N, INTF.3N。(c) pSK-HMG-URA3-INTB包含EXP-HMG-Aco URA3, INTB.5N, INTB.3N。
β-还原酶基因(HMG基因库:XM_503558)和同源臂(INTB.5N和INTB.3N)融入INTB(基因库:YALI0B700678 YALI0B701707)从ATCC20362的基因组被放大。HMG削减NcoI / NotI结扎成pWSV-EXP-Aco生成pWSV-EXP-HMG-Aco。接下来,INTB.5N, INTB.3N, EXP-HMG-Aco结扎成pSK-URA3生成pSK-HMG-U-INTB (图1 c)。
建设的质粒所示补充数据转换和修养y lipolytica:一URA3缺乏应变转换线性DNA使用协议的巴斯和Gaillardin [12]。100毫升瓶包含5毫升YPD介质(pH值4.0,调整使用1 M柠檬酸acid-Na柠檬酸缓冲)接种一个殖民地和动摇28°C 16 h。那么,500年μl文化转移到一个包含10毫升250毫升瓶YPD中型和孵化过夜。OD600大约5.0时,所有的细胞都在3500×g离心收获而为5分钟,洗两次TE缓冲(pH值7.5)。大约20毫升的100毫米醋酸锂(pH值6.0)被用来resuspend细胞和样本孵化28°C 1 h。最后,对细胞在3500×g离心5分钟和resuspended 2毫升的100毫米醋酸锂获得能力的细胞。大约1μg线性化质粒与50μg混合变性DNA载体(σ)和100μl主管细胞被孵化的28°C,持续15分钟。然后,700μl PEG4000添加40%,样品在100 rpm,动摇了28°C 1 h。热休克的39°C 10 min,然后执行1.2毫升的100毫米醋酸锂是补充道。混合物在固体MM媒介传播和培养4天28°C。转化株出现黄色板上的选择和培育在28°C 96 h补充图1和图2。
回收的URA3标记
工程y lipolyticaYPD培养基,接种在20毫升,动摇了28°C到OD600大约是1.0。细胞(100μl)传播在固体MM中包含100μg /毫升5-fluoroorotic酸(5-FOA), 75年μg /毫升尿苷、尿嘧啶、孵化为4天28°C。一个黄色的殖民地被选为下一个集成。
β-还原酶活性分析
一个转化株菌落接种5毫升毫米介质和孵化28°C到OD600大约是1.0。随后,1毫升的培养基被转移到20毫升的MM中、孵化一夜之间在28°C。10毫升的培养基在3500×g离心10分钟和50毫米洗磷酸盐缓冲剂(pH值7.0)。颗粒状细胞在600年resuspendedμl裂解缓冲和玻璃珠的体积增加了50%的液体。暂停是1分钟每五次涡立即放在冰。提取离心机在3500×g和4ºC 5分钟,并暂停被转移到新管在冰上活动分析。
β-还原酶活性测定是修改根据Asadollahi描述和唐纳德13]。NADPH, 50μl 3毫米和50μl细胞提取物的添加到850毫升含石英试管μl 100毫米磷酸盐缓冲剂。5分钟后平衡在30°C, 50μl 3毫米β-添加到试管和吸光度的变化在340海里(A340)被记录1分钟。酶活性(U)被定义为辅酶ii的数量(nmol)每分钟生产14]。
细胞中提取的蛋白质含量是决定使用BCA蛋白质分析工具包(北京ComWin生物技术有限公司)与牛血清白蛋白标准。
碳源优化Shake-flasks转基因菌株
一群转基因菌株接种于5毫升YPD液体培养基和孵化28°C到OD600大约是1.0。随后,1毫升的文化转移到20毫升中含有不同浓度的葡萄糖和甘油(2%葡萄糖,葡萄糖4%,1%葡萄糖和1%甘油、2%甘油、4%甘油)在96年28°C h和培育。
馈料式β-carotene生产发酵
实验室规模的文化、馈料式5 l发酵罐进行发酵。250毫升种子摇瓶25毫升YPD介质是接种一个循环YC607和孵化24小时28°C。随后,三个750毫升种子摇动烧瓶与每个注射100毫升YPD介质5毫升的文化和孵化24小时28°C。最后,300毫升的种子文化被接种到3000毫升YPD介质的发酵罐和孵化28°C。溶解氧是保持在30%,pH值维持在5.5使用氨。馈料式发酵期间,70 g / l的甘油是美联储维持甘油2%以上。
β-carotene提取和量化
量化的β-carotene是由高效液相色谱法(HPLC) (6]。一毫升发酵肉汤离心机在13200 X g 2分钟和冻干一夜之间测量干电池的重量。相等数量的细胞收获β-carotene提取。1毫升的颗粒状细胞resuspended丙酮和搅拌30分钟的超声波。丙酮提取离心机在13200 X 2分钟g和悬浮包含β-carotene过滤0.45μm过滤器进行后续分析。
的β-carotene内容提取系统使用一个高效液相色谱法测定(安捷伦1260∞)配备了C18柱(海波西尔ODS 5μm, 4.6毫米×250毫米)(15]。样本(10μl)注入C18柱和检测在472海里移动阶段补充表4所示10]。
统计分析
统计分析与统计软件SPSS18.0执行。所有数据,获得至少三个独立的实验中,表示为±标准差。学习任务是用来比较不同群体之间的差异,p < 0.05或p < 0.01表明统计不同。
比较β-carotene b . Trispora和生物合成的基因m . Circinelloides
高层实现类胡萝卜素大肠杆菌通过表达细菌类胡萝卜素基因(3),然而表现活动的细菌类胡萝卜素基因在酵母系统[很穷16]。谢等人还表明,类胡萝卜素来自真核生物的基因是比这更合适的细菌酿酒酵母(17]。因此,codon-optimized生物合成的基因(卡拉和碳水化合物从b . trispora,碳水化合物(M)和carRP从m . circinelloides从两个重要的微生物生产β-carotene被表达y lipolytica。质粒pSK-B-RA-GGS-INTF-U或pSK-B (M) -RP-GGS-INTF-U被集成到主机应变Y2224 (URA3-deficient应变y lipolyticaATCC20362)分别和积极的殖民地被选来分析β-carotene生产力。最高的转化株β-carotene设计YC202(从屈服b . trispora)和YM202 (m . circinelloides)。表1表明,应变YC202的生物量和YM202 ATCC20362相似,表明引入β-carotene生物合成途径并不影响应变增长。YC202β-carotene产量为4.35±0.14 mg / l, YM202为3.86±0.13 mg / l,β-carotene收益率有显著区别的两个菌株(p < 0.05)。结果表明,卡拉和碳水化合物b . trispora或m . circinelloides功能在y lipolytica然而,β-carotene生物合成基因的表达水平b . trispora是比这更好的m . circinelloides在y lipolytica。
| 生物质(g / l) | β-carotene收益率(毫克/升) | |
|---|---|---|
| ATCC20362 | 11.63±0.62 | 0 |
| YC202 | 11.42±0.74 | 4.35±0.14 |
| YM202 | 11.71±0.57 | 3.86±0.13 |
表1:比较菌株之间的生物量和β-carotene产量综合β-carotene生物合成的基因b . trispora或m . circinelloides。
代谢工程的y Lipolyticaβ-carotene
β-还原酶是一种病原反应酶甲羟戊酸途径中,甲羟戊酸通常被认为是一个有效的供应商的类异戊二烯前体18]。超表达β-还原酶增强类异戊二烯生产等一些酵母种类酿酒酵母(13),假丝酵母utilis(19]。β-还原酶基因的一个副本(HMG)是由质粒插入YC202 pSK-HMG-U-INTB创建YC306。β-还原酶酶活性是YC202和YC306化验。超表达HMG增加酶活性从1.06±0.04 U /(毫克蛋白)YC202 1.77±0.06 U / (YC306毫克蛋白),差异显著(p < 0.01)。与此同时,β-carotene生产增加从4.35±0.14 mg / l YC202 YC306 6.96±0.15 mg / l,差异显著(p < 0.01)。超表达促提高催化活性的大约65%,同时刺激增加β-carotene收益率约为60%。
为了提高的生产力β-carotene由多个基因表达策略,可回收URA3标记被用来介绍β-carotene生物合成基因的多个副本的连续的集成。URA3标记在URA3-phenotype转化株可以通过同源重组和切除URA3-phenotype转化株被FOA-resistant选择确定后续轮变换(20.]。建设步骤β-carotene生物合成的重组y lipolytica所示图2。首先,插入YC306创建YC413 pSK-B-RA-GGS-GUT2-U,引入第二份β-carotene生物合成基因和产生β-carotene 37.45±0.87 mg / l。应变YC413转换使用pSK-B-RA-GGS-POX2-U创建YC511,介绍了第三份β-carotene生物合成基因和β-carotene的产量增加到53.97±0.83 mg / l。第二份邮政编码,使用pSK-HMG-U-INTA,引入YC511创建YC607。转基因菌株YC607,含有三份β-carotene生物合成基因,两份HMG,积累β-carotene 72.89±1.09 mg / l。每个基因整合导致β-carotene的产量的增加,差异显著(p < 0.01) (图3 b)。β-carotene收益率显示相比增加16.8折YC202β-carotene生物合成基因的一个副本,表明超表达的病原反应步骤可以有效提高目标产品的产量在不同的主机上。然而,当另一个副本HMG插入YC607应变,β-carotene产量下降是由于低生物质。结果表明,更多的β-还原酶可能导致积累isopentenyl二磷酸(IPP),通过二磷酸焦磷酸(FPP)和其他中间代谢产物(21),和类异戊二烯焦磷酸过多可能会导致潜在的有毒影响细胞(22]。
图2:代谢工程y lipolytica生产β-carotene。(一)β-还原酶活力测定YC202和YC306 U被定义为辅酶ii的数量(nmol)每分钟生产。(b)生物量和β-carotene内容产生的工程y lipolytica当菌株培养YPD中96 h。
图3:碳源的影响由YC607β-carotene生产。(a)在媒介生产β-carotene包含不同内容的葡萄糖或甘油shake-flask文化。(b)时间的增长和β-carotene生产y lipolyticaYC607与喂养甘油5 l生物反应器。
发酵β-carotene生产
在先前的研究中,优化的发酵过程是提高类胡萝卜素的生产酵母(6]。碳源对生产的影响的β-carotene YC607 shake-flask文化研究,和4%甘油可以改善β-carotene生产12%比2%葡萄糖(p < 0.01)。蔗糖梯度离心实验显示,大多数番茄红素在lycopene-producing存储体内脂质分数y lipolytica应变(9]。甘油可以提高合成的脂质体催化甘油激酶导致储存更多β-carotene体内脂质(20.]。
此外,馈料式栽培YC607 5 l生物反应器中进行。发酵所示的时间进程图3一。过程中甘油是美联储将维持在10 - 20 g / l。我们可以看到图3 b大幅增加,生物量和β-carotene内容在最初的50 h,然后生物质开始下降,但最大生产β-carotene 613.87 mg / l 80 h。结果表明y lipolyticaYC607可能产生较高含量的β-carotene高密度培养法。
总之,我们的结果代表的第一份报告β-carotene生物合成基因的表达b . trispora在酵母。我们发现gg的多个副本的引入,碳水化合物,卡拉格,HMG可以显著提高β-carotene生产。最后,使用甘油作为碳源发酵过程中增强β-carotene生产,表明y lipolytica可能是一个潜在的微生物工厂类胡萝卜素的合成。
作者宣称没有利益冲突。
