利用标记辅助回交育种和田间验证提高水稻对白叶枯病的抗性

摘要

白叶枯病是制约水稻种植的主要病害之一。培育持久的抗性是对抗疾病最有效和最经济的方法。本研究将4个抗性基因(Xa4、xa5、xa13和Xa21)聚合到流行cv中。利用标记辅助回交育种方法，对马苏里和两个杂交水稻亲本PRR78和KMR3进行了研究。在人工疾病和自然疾病条件下，对不同背景的9个金字塔家族进行了评价。在金字塔上接种16株水稻黄单胞菌。从印度不同地区收集的米曲菌分离株。BF16对复发亲本具有高毒力，Mahsuri的产量损失23%，PRR78的产量损失28%，KMR3的产量损失24%。BF7 (Mahsuri毒性降低10%，KMR3毒性降低13%)和BF10 (PRR78毒性降低22%)毒性最低。在Maruteru的自然条件下，病害导致Mahsuri减产22%，PRR78减产28%，KMR3减产26%。 Under both conditions, none of the pyramids were susceptible. There were no significant differences within pyramids with respect to any character evaluated. No pyramid was susceptible. The agronomic characters showed no significant difference between parent and pyramid. Yield and its related characters were statistically significant between parents and pyramids (P< 0.05). The pyramids insulated a heavy yield loss to the tune of ~28% and pyramiding of resistance genes (two dominant and two recessive) did not show any negative effect on agronomic performance of any pyramid. These pyramids can be used directly and also as valuable source of resistance in future breeding programs.

关键字

白叶枯病，分子标记，抗性，水稻产量，、黄oryzaepv。oryzae。

介绍

细菌性枯萎病(BB)由、黄oryzaepv。oryzae（Xoo语)(波动et al .,1990)是世界范围内最具破坏性的水稻病害之一(Ou, 1985;新,1987;Nino-Liuet al .,2006)。它导致叶片萎蔫，影响光合作用的速率，在严重的情况下导致产量损失高达80-100%et al .,1997;翟和朱，1999)。这种疾病是系统性的，缺乏有效的化学控制措施(Devadath, 1989年)，对农药对健康危害的关注限制了化学控制剂的使用(Guillebeau, 1998年)。抗病育种是其管理的最重要途径(桑切斯et al .,2000;辛格et al .,2001;张,2005;Nino-Luiet al .,2006;他et al .,2008;Mamgainet al .,2013)。传统的植物育种主要依赖于表型选择，由于多基因转移中的显性和上位效应(Collard and Mackill, 2008)和连锁阻力(Young and Tanksley, 1989)，在多基因金字塔构建中，表型选择是一个耗时且效率较低的过程。即使在没有病原体的情况下，分子标记也已成功地用于选择抗性品种(Melchinger, 1990)和降低病原体克服抗性的可能性(Yoshimuraet al .,1995;黄et al .,1997)。到目前为止，已经确定了30多个赋予BB抗性的基因et al .,2010;哈et al .,2012;Natrajkumaret al .,2012)。与一种、二种和三种基因组合相比，多种抗性基因通过协同和互补的基因作用赋予了广泛的种族广谱和持久的抗性(Ogawa和Khush, 1988;黄et al .,1997;Adhikariet al .,1999;Shanti and Shenoy, 2005)。

本研究以Mahsuri、PRR78和KMR3为背景，对4个BB抗性基因进行金字塔化分析，评价9个金字塔家族的农艺性状，即开花至50%日(DFF)、株高(PH)、分蘖数(NT)、穗长(PL)、产量及其相关性状，即每穗饱满粒数(FG/P)、千粒重(GW)、产量(Y)和生物量(BM)。

Mahsuri是印度次大陆第一个雨养的传统品种，在低肥力土壤中具有显著的产量优势和非常理想的谷物品质(羽衣甘蓝)et al .,2008年)，但极易受到病虫害的影响。杂交水稻技术是提高水稻产量和生产力的可行选择之一，其产量比自交系半矮秆品种高出20% (Virmani, 1996)。如果杂交稻的粮食质量不能令人接受，而且易患病害，单靠增加产量并不能确保农民的盈利能力(Virmani和Kumar, 2004年)。杂种活力本身并不能使水稻杂交品种比亲本品种更能或更不能忍受生物胁迫(科恩)et al .,2003;睡椅et al .,2013)。杂交水稻的生物抗逆性是由亲本系的抗逆性决定的。PRR78是一种长粒细长的育性恢复系，是2001年印度新德里印度农业研究所(IARI)发布的世界上第一个也是唯一一个超细粒芳香水稻杂交品种Pusa RH10的亲本之一。这种杂交品种在110天内成熟，平均产量为每公顷7000公斤(Siddiqet al .,2009)。与其他杂交种相比，该杂交种具有良好的香气、仁伸长、蓬松性和更长的保质期等特性，具有商业可行性。KMR3是杂交水稻最佳育性恢复系，是最受欢迎的非芳香杂交水稻KRH2的父本。

四基因组合(Xa4，xa5，xa13和Xa21)最为稳定，对不同的病原菌分离株具有耐药性(Shanti和Shenoy, 2005)。基于这些发现，Mahsuri, PRR78和KMR3金字塔具有4个BB抗性基因(Xa4，xa5，xa13和Xa21)采用标记辅助回交育种(MABB)培育。纯合子条件下采用分子标记进行前景选择，背景选择采用常规育种。从每个背景中选出9个金字塔家族。

以9个表现最好的Mahsuri金字塔家族PRR78和KMR3与亲本进行比较，了解在病压条件下接种16种不同品种的玉米对产量损失的保温率Xoo语从印度不同地理位置收集的分离株。这些金字塔还在印度安得拉邦西哥达瓦里的马鲁特鲁进行了自然感染测试，那里是细菌性叶枯病的热点地区。这反过来也将表明在田间水平上是否存在由于四种抗性基因金字塔化而导致的产量损失。

材料与方法

实验处理及部位:

IRBB60, IR24背景下的近等基因系，携带四种抗性基因，Xa4，xa5，xa13和Xa21作为三个复发亲本(Mahsuri, PRR78和KMR3)和共有9个具有4个BB抗性基因的金字塔家族(Xa4，xa5，xa13和Xa21)在上述三个背景下均处于纯合状态。复发父母作为易感性对照。对各金字塔家族的农艺性状、产量性状及产量相关性状进行了评价。此外，通过测量单个病变长度到最近的厘米来评估对BB的抵抗力。以芳香品种Malagkit Sung Song (MSS)和IRBB60为抗性对照，以品种台中Native 1(TN1)为敏感性对照。十六岁Xoo语分离物被指定为BF₁到男朋友₁本研究中使用的6个品种从中央水稻研究所(CRRI)， Cuttack (表1)，并在Barwale基金会的分子生物学实验室中保存在改性Wakimoto的半合成琼脂培养基上(每升:20克蔗糖，5克蛋白胨，0.5克硝酸钙，1.82克磷酸氢二钠，0.05克硫酸亚铁，18克琼脂，pH值6.8-7)et al .,1973)。2009年、2010年和2011年6 - 10月，在印度安得拉邦海得拉巴Maharajpet、Shankarpally Mandal、Barwale基金会研究农场对金字塔家族进行了人工接种和自然感染的评估。Maharajpet地区位于17º24 ' N, 78º12 ' E，平均海平面以上536m，实验场地的土壤为粘壤土。马鲁鲁位于北纬16°37′60度，东经81°43′60度，海拔5米。土壤类型为黑色冲积粘土。

试验设计与农艺实践:

每个试验采用完全随机区组设计，自然条件下每组3个重复，人工条件下每组1个培养-菌种组合。将重复亲本Mahsuri、PRR78和KMR3的21日龄苗，Mahsuri、PRR78、KMR3金字塔的9个家族，以及感病检查TN1和抗性检查MSS和IRBB60每山1株苗移栽，间距为20 X 20 cm。每个金字塔家族，循环亲本和检查包括40株植物在四行，每行10株。每次复制之间保持60cm的间隔。对Mahsuri、PRR78和KMR3亲本及9个金字塔家族进行了农艺观察，对感病对照TN1和抗性对照MSS和IRBB60进行了疾病相关观察。移栽后，在田间保持约5厘米的静水。120:60:60 kg/公顷氮磷钾分两次施用于试验田，一半氮肥在移栽时作为基础剂量，其余氮肥在作物分蘖中期施用。在人工接种条件下，定期采取防治褐飞虱和稻瘟病的植保措施，使作物健康生长。接种研究前15天停止所有植物保护措施，以排除这些化学物质的相互作用和掩蔽效应Xoo语。上述所有做法在Maruteru都得到了遵循，没有采取任何植物保护措施。

BB阻力筛查:

在人工接种条件下，评价了Mahsuri、PRR78和KMR3的复发亲本和9个金字塔家族对BB病原菌的抗性反应Xoo语研究农场的分离株和马鲁鲁的自然感染。培养维持在改良的Wakimoto半合成培养基上。为了长期保存，培养物在-20°C下以50%甘油保存。将1mL 50% (w/v)甘油加入1.5ml外注管中。在这些试管中，48小时的菌落Xoo语在无菌条件下，在无菌循环中取出，悬浮并储存。将储存的培养物在改良的Wakimoto培养基上恢复生长，进行接种试验。将拟用的特异性分离物接种于敏感品种TN1上，在实验室重新分离后再进行接种实验，以保持分离物的毒力。

阻力评估:

在人工条件下大约40天大的植株夹接接种(考夫曼et al .,1973)在最大分蘖期，每次用剪刀将每个分离物在改性Wakimoto的半合成琼脂培养基上生长的48小时活跃生长的细菌培养物制备的菌悬液浸入，细胞密度调整为10 8 cfu(菌落形成单位)/ ml，用分光光度计在620 nm (Kauffmann)测定et al .,1973)。分别用灭菌剪刀对各菌株进行接种Xoo语在每次复制中剪去植株顶部的5片叶子。每个试验重复三次。接种后15 d记录疾病反应。测量病灶长度至厘米。

〇在自然条件下在马鲁鲁，金字塔和支票被允许自然感染。在疾病开始出现后15天测量疾病反应。所有检查和金字塔的病变长度被测量到最近的厘米，以分类疾病反应。

在上述两项试验中，根据病害长度(Shanti)将植株分为抗性(0-4 cm)和易感(> -4 cm)et al .,2001)。

DNA提取和聚合酶链反应:

对反复亲本(Mahsuri、PRR78和KMR3)及其金字塔家族进行筛选，证实金字塔家族在纯合子条件下包含所有靶基因，并证实无异型。Mahsuri、PRR78和KMR3亲本和金字塔家族的小尺度DNA分离是按照della aporta et al.(1983)的方法进行的。三个序列标记位点(STS)标记Npb181, RG136和pTA248紧密连接Xa4，xa13和Xa21与一个SSR标记RM122紧密相连xa5用于确认每个基因和基因组合的存在。PCR混合物中含有模板DNA 50ng，每个引物5picomoles, 0.05mM dNTPs, 1X PCR缓冲液(10mM Tris, pH 8.4, 50mM KCl, 1.8mM MgCl2和0.01 mg/ml明胶)和1U Taq DNA聚合酶，反应体积为25μl。模板DNA在94ºC下初始变性5分钟，然后进行35个PCR扩增循环，扩增参数如下:94ºC变性30秒，55ºC退火30秒，72ºC引物延伸1分钟。在72ºC下延长5分钟。扩增产物pTA248和Npb181分别在1.4%和2.5%琼脂糖凝胶上电泳分离，并在紫外下观察。

RG136扩增产物由于所有条带均为单态，在进行酶切前，取5μl PCR产物进行凝胶电泳，以确定扩增是否成功。剩余产物用于限制性消化。反应混合物中含有0.5μl (10U/μl)的限制性内切酶Hinf1、在15μl PCR产物中加入2.0μl的10X PCR缓冲液和2.5μl的无菌蒸馏水。37℃孵育4h，酶切产物经凝胶电泳(1.4%琼脂糖)分离，溴化乙啶(10μg/ml)染色后紫外显影。为xa5，以20ng DNA为扩增模板，每个引物5皮摩尔，0.05mM dNTPs, 1X PCR缓冲液，Taq聚合酶1U，总体积为15μl，进行PCR扩增。模板DNA在94ºC下初始变性5min，然后进行35个PCR扩增循环，扩增参数如下:94ºC变性30sec, 55ºC引物退火30sec, 72ºC引物延伸1min。最后一次延长在72℃下进行5min。PCR产物在3%琼脂糖凝胶中溶解。

数据收集和统计分析:

每个条目记录了五种植物的数据，不包括边界植物。收集了抗病资料，并计算了农艺性状，即开花至50%的天数(DFF)、株高(PH)、分蘖数(NT)、穗长(PL)、产量(Y)及其相关性状，即每穗饱满粒数(FG/P)、小穗育性(SF %)、千粒重(GW)、生物量(BM)和收获指数(HI)。对于接种研究的数据，在进行统计分析之前应用对数变换。数据分析结合方差分析(ANOVA)使用Crop Stat Version 7.2。2007.3.在F检验显著的情况下，使用5%概率的Fisher最小显著性差异(LSD)。

结果

BB抗性的标记辅助选择:

4个BB抗性基因的标记辅助前景选择Xa4，xa5，xa13和Xa21是用它们各自紧密相连的标记进行的。F₁对每个杂交(Mahsuri / IRBB60、PRR78/ IRBB60和KMR3/ IRBB60)的5个目标基因进行杂合性检测，并将选择的真型回交给各自的复发亲本。共600只Mahsuri, 620只PRR78, 580只KMR3, BC1F₁利用连锁标记进行前台选择，鉴定出4个基因的杂合个体。这些被回交得到BC₂F₁经过相同选择过程的后代与所选个体回交产生BC_3.F₁在杂合条件下，将具有真株型和目的基因的子代和子代自交产生BC_3.F₂家庭。BC_3.F₂株型真实且靶基因均为纯合子的家系进一步自交至F6代。在每个回交和自交世代进行田间水平的回交亲本型表型选择，以消除不需要表型的植株。我们在BC选择了9个金字塔家庭_3.在Mahsuri、PRR78和KMR3背景下与4个BB基因抗性等位基因纯合的F6代(图1)。首先检查每一代的单个植株是否存在Xa21对抗性等位基因和所选植株进行检测xa5抗性等位基因。对所有具有这两个基因抗性等位基因的植株进行了筛选Xa4吉恩紧随其后的是xa13抗性等位基因。亲本无抗性等位基因，但有4个基因的易感等位基因。

金字塔抗BB性评价:

在人工感染条件下，分离物(I)、基因型(G)和I*G相互作用(表2)以评估病变长度(cm)。不同季节(S)、S*I、S*G和S*I*G之间的相互作用对病变长度无显著差异。在自然感染下，不同基因型(G)的病变长度(cm)有显著差异(5% LSD)。不同季节(S)间无显著差异，病变长度(S *G)间无显著交互作用。表2)。

〇人工条件在接种条件下，所有的复发亲本(Mahsuri、PRR78和KMR3)和易感对照对所有分离物均表现出高度易感反应，而所有金字塔在不同季节的抗性检测中均表现出相同的抗性。男朋友₁6对所有复发亲本均有高毒力，对Mahsuri、PRR78和KMR3进行了评价，记录了Mahsuri(对照)、PRR78(对照)和KMR3(对照)的平均病变长度分别为22.6cm、18.8cm和18.2cm。各背景金字塔的疾病反应范围在1.5 ~ 3.0 cm之间。各个金字塔的损伤长度不同，但没有一个金字塔家族的损伤长度超过3 cm，证明所有金字塔家族对所有分离株都具有抗性Xoo语收集自印度不同地区。

〇自然条件在自然侵染条件下，亲本的疾病反应水平与易感对照TN1相当，而Mahsuri、PRR78和KMR3背景的金字塔各季节均与抗性对照相当。Mahsuri(对照)的平均病变长度为24.1cm, PRR78(对照)的平均病变长度为23.9cm, KMR3(对照)的平均病变长度为19.1cm。Mahsuri、PRR78和KMR3四个基因金字塔家族的疾病反应范围为1.4 ~ 2.8 cm。单个金字塔呈现不同程度的损伤长度，但没有金字塔家族的损伤长度超过3 cm。

农艺性能:

在人工侵染条件下，菌株(I)、基因型(G)和I*G互作的农艺性状、产量及其相关性状的评价差异显著(LSD为5%)。评价性状的季节(S)和S*I、S*G和S*I*G之间的交互作用(表3)。在自然侵染条件下，不同基因型(G)的农艺性状、产量及其相关性状在5% LSD条件下存在显著差异。不同季节(S)和S*G之间的交互作用对评价性状(表3)。

在人工条件下:

Mahsuri金字塔家族在9个金字塔科中，16个分离株的性状均无显著差异。在不同季节，亲本与金字塔间的DFF、PH、NT和PL等农艺性状无显著差异(图2一个)。亲本和锥体的DFF均为133天，PH为158cm，每株14分蘖，穗长为24cm。产量及其相关性状(表45%的LSD，在母体和金字塔之间。

在人工条件下，重复亲本的产量变化百分比及其相关性状FG/P、SF、GW、BM和HI见图6而在金字塔的九个家族中，这些特征都没有减少。在所有分离株中，BF₁6号毒株为高毒力毒株，使马苏里的产量降低22%。

PRR78金字塔家族PRR78各性状金字塔间无显著差异。各品种的农艺性状，即DFF (95 d)、PH (107cm)、NT(12)和PL (27cm)在亲本和金字塔间均无显著差异Xoo语隔离(图2 b)。在5% LSD下，16个分离株的FG/P、SF、GW、Y和BM等性状在不同季节与亲本间差异显著(表5)。16株亲本的产量及其相关性状(FG/P、SF、GW、Y、BM)的百分比变化顺序见图6 b。其中，BF₁6号毒力强，产量损失28%。

KMR3金字塔家族在KKR3金字塔的9个家族中，任何性状的评价都没有显著差异。亲本与金字塔间的DFF、PH、NT、PL等农艺性状无显著差异(图2 c)。DFF为109 d, PH为149cm，单株NT为11,PL为25cm。在产量及其相关性状(FG/P、SF、GW、BM和HI)上，KMR3与其金字塔(表6)，不分季节。16个分离株在不同季节表现出显著差异的性状变化百分比见图6 c。其中，BF₁6号毒力强，产量降低24%。

毒力谱Xoo语隔离- - - - - -十六岁Xoo语菌株表现出显著的毒力特征，并影响了所有复发亲本的产量及其相关性状SF%、FG/P、GW、Y/P、BM和HI。本研究中使用的分离株的毒力谱见图3就产量损失而言。

方差分析(表2和表3)表明菌株与基因型之间存在显著的相互作用。隔离，BF₁6号在不同季节对所有复发亲本都具有高毒力，不同基因型的产量损失在23-28%之间。分离株BF7(在Mahsuri和KMR3中)和BF₁0 (PRR78中)是不同基因型中毒性最小的。BF7在Mahsuri和KMR3中分别造成10%和13%的产量损失₁0显示PRR78的产量损失20%。所有金字塔都显示出抗性，在任何背景测试中，没有分离物可以在三个雨季中分解四个基因金字塔中的任何一个。

在自然状态下:

Mahsuri金字塔家族-在金字塔中没有任何显著的变化对于任何被评估的特征。在不同季节的疾病压力下，亲本与金字塔间的DFF、PH、NT和PL等农艺性状均无显著差异(图4一)。不同季节的产量及其相关性状，即全肥力比、总肥力、总肥力和总肥力差异显著(表7)在母体和金字塔之间添加5%的LSD。自然侵染条件下，亲本产量下降百分比及其相关性状FG/P、SF、GW、Y、BM见表7。Mahsuri亲本的产量与金字塔相比降低了22%。Mahsuri亲本的FG/P降低25%，SF%降低27%，GW降低24%，BM降低13%，HI降低11%。

PRR78金字塔家族在自然侵染条件下，返代亲本的产量及相关性状与金字塔有显著差异。农艺性状DFF、PH、NT和PL在不同季节间无显著差异(图4 b)。方差分析表显示，在5% LSD条件下，亲本和金字塔的产量及其相关性状(FG/P、SF、GW、Y和BM)在不同季节间存在显著差异(表3)。这些特征在金字塔中都没有这样的区别。各季节的产量损失减少了28%。PRR78显示FG/P和SF降低24%，GW降低31%，BM降低13%，HI降低17% (表7)。

KMR3金字塔家族在自然感染BB病原菌(表7)。亲本和金字塔的农艺性状DFF、PH、NT和PL在不同季节间无显著差异(图4 c)。方差分析(表3)在不同季节间，亲本和金字塔间的全重比、SF、GW、Y、BM和HI均存在显著差异。在5%的LSD浓度下，上述性状在不同季节的金字塔间没有这种变化。在亲本中，FG/P、GW和Y降低了25%，SF%降低了24%，BM降低了15%，HI降低了12%，最终导致产量损失24% (表7)。

讨论

本研究的主要目的是将四种BB抗性基因(即:Xa4，xa5，xa13和Xa21)加入流行的简历。利用杂交水稻亲本PRR78和KMR3对其9个表现最佳的金字塔家族进行评价Xa4，xa5，xa13和Xa21在人工和自然条件下跨季节的农艺、产量及其相关性状和抗病性的纯合基因。标记辅助回交育种与紧密连锁标记结合田间表型选择，使4个BB抗性基因同时金字塔化到多个背景中成为可能。标记辅助回交育种已在若干研究中成功应用(黄et al .,1997;Hittalmaniet al .,2000;桑切斯et al .,2000;Narayananet al .,2004;佩雷斯et al .,2008;Perumalsamyet al .,2010)。

该病害导致叶片萎蔫，影响光合作用、结实率和籽粒重量降低(Ou, 1985)。它还会影响粮食的品质。杂交水稻生产面临更严重的白叶枯病问题，因为在孕穗期需要切断A和R系主蘖的旗叶，以促进授粉，这为病原体的进入铺平了道路。

以Mahsuri、PRR78和KMR3为背景的金字塔家族在农艺性能上与其亲本相当，并且在人工和自然条件下都通过隔离BB病造成的产量损失而表现出高水平的抗BB病能力。表型选择是非常严格的，以尽可能多地保留所有的性状的返代亲本。早些时候进行的研究显示了其他基因型和不同病原体种族的类似结果(Singhet al .,2001;约瑟夫et al .,2004;他et al .,2008;Basavarajet al .,2010;Salgotraet al .,2012;Suhet al .,2013)。

由于季节变化和缺乏足够的接种剂来启动统一的疾病反应，仅在自然感染下筛选抗病能力并不是可行的选择。在受控的田间条件下模拟自然环境的人工接种尽量减少了这些问题，并在疾病严重程度上产生了较大的变化。

在人工条件下，父母的疾病发生率与敏感组相当，所有金字塔的病变长度与抗性组相当，为1.5 ~ 3cm (图5)。16个分离株的复发亲本FG/P、SF、GW等性状差异均有统计学意义(表3)。一个隔离装置被指定为BF₁与其他分离株相比，6株在所有3个亲本中表现出较高的毒力，造成最高产量损失高达23%至28% (图3)。BF7(在Mahsuri和KMR3)和BF₁0 (PRR78)在整个季节表现出最小的毒力。BF7在Mahsuri亲本和KMR3亲本中分别造成10%和13%的产量损失₁0显示PRR78亲本产量损失20%。

隔离高炉₁6对所有复代亲本的产量及其相关性状影响较大。用BF接种马氏亲本各季节的平均性能₁6个显示181 FG/P, 68% SF%， 13gm 1000GW, 15gm/ Y, 54gm BM和27gm HI (表4)，而金字塔为240 FG/P, 96% SF%， 17gm 1000GW, 19gm/株Y, 62gm BM和31gm HI。有BF的PRR78亲本各季节平均性能₁6个是，151 FG/P, 71% SF%， 17gm 1000 GW和Y, 57gm BM和30gm HI (表5)，而金字塔显示200 FG/P, 95% SF%， 25gm 1000GW, 24gm/株Y, 65gm BM和37gm HI，以及KMR3亲本的BF₁(6)各季节为121 FG/P, 68% SF%， 17gm 1000GW和Y, 60gm BM和28gm HI，其金字塔为160FG/P, 91% SF%， 22gm 1000GW和Y, 70gm BM和31gm HI (表6)。

结果表明，在高毒力菌株BF的人工疾病压力下，Mahsuri、PRR78和KMR3背景的金字塔比各自亲本的金字塔产量分别高出23%、28%和24%₁6个季节。各亲本的农艺性状(开花天数至50%、株高、分蘖数和穗长)与任一攻毒分离株均无显著差异(表3)。

在印度东部进行的研究表明，基因组合Xa4+xa5，xa5+Xa21和Xa4+xa5+Xa21赋予了广泛的抵抗力(香提)et al .,2001)。两种基因组合比三种基因组合产生的抗性程度要小，因此使用三种基因组合是最可行的选择。多年来，有关于xa5+xa13+Xa21作为一个适合印度不同地区的基因组合，流行的品种与这个组合是金字塔(辛格et al .,2003年和Sundaramet al .,2008）.早期的结果(Shanti和Shenoy, 2005年)和AICRIP试验(水稻研究理事会，2006年a)表明，在一些试验地点出现了耐药性崩溃。病原体种群是高度动态的，显然与宿主共同进化，并产生新的菌株，导致金字塔的抵抗力崩溃。因此，迫切需要了解当代病原菌种群和有效的耐药基因。

这四个基因的组合Xa4，xa5，xa13和Xa21是对抗病原菌最有效的方法(Shanti和Shenoy, 2005)。所产生的抗性是由于抗性基因的互补作用。这证实了早期的报告表明，与单基因相比，多基因具有更高水平的耐药性(Yoshimuraet al .,1996;黄et al .,1997;亮丽人生et al .,2001年和Sundaramet al .,2008）.多个基因对抗性的总体水平具有累加效应。

2009年、2010年和2011年雨季，印度安得拉邦马鲁鲁的Mahsuri、PRR78和KMR3金字塔家族及其各自的复发亲本和后代也受到自然疾病的压力。它是BB的高发地区，BB的位置严重指数高达8.6 (Directorate of Rice Research, 2006b)。自然感染导致典型的疾病症状。结果与人工感染相同。金字塔组与供体组和抵抗力检查组表现出相同的抵抗力，而复发父母组则高度易感。Mahsuri和PRR78亲本病变长度为24cm (图7a和b)及KMR3显示19cm (图7 c)。锥体无敏感反应，病变长度为1.5 ~ 2.8cm，不超过3cm

在自然条件下，马苏里、PRR78和KMR3亲本的农艺性状(开花至50%的天数、株高、分蘖数和穗长)与金字塔无显著差异(表3)，不分季节。亲本和金字塔间的产量及其相关性状(全果比、SF%、GW、BM和HI)在不同季节间差异显著。Mahsuri亲本FG/P为182,SF%为70%，1000GW为13g, Y为15g /株，BM为54 g, HI为27 g (表7)， PRR78亲本为152 FG/P, 72% SF%， 17 g 1000GW, 18g Y /株，58 g BM和31 g HI (表7)和KMR3亲本的FG/P为122,SF%为70%，1000GW和Y为17 g, BM为61 g, HI为28 g (表7)。在自然侵染条件下，玉米的农艺、产量及相关性状均无显著差异。Mahsuri亲本、PRR78亲本和KMR3亲本的产量金字塔相比分别降低22%、28%和26%。

环境条件也在表型和农艺性能中发挥重要作用(Garrettet al .,2006)。在实验期间，分三个季节测量了Barwale基金会研究农场的人工田间条件和Maruteru (图8)。在两种环境下，季节、处理和基因型之间的相互作用对病害造成的产量损失没有影响。

人工条件下Mahsuri, PRR78和KMR3背景的金字塔家族显示出对非常多样化的一组的不同程度的抵抗Xoo语分离株均不能击破任何一个金字塔科的抗性。金字塔在自然条件下也具有很强的抵抗力。早期研究(巴拉特库马尔)et al .,2008;普拉萨德et al .,2013)，本研究证明，四种基因组合在对抗动态病原菌群体方面最有效。

这项研究显示了四个基因金字塔在不同地点和季节的稳定表现。所有金字塔都能表现出广谱抗性，并具有多重协同效应Xoo语跨季节隔离。这些金字塔可以避免25-30%的产量损失，这对减少产量损失有很大帮助，从而增加水稻产量。在金字塔中，任何接种过的分离株都没有产量损失。本研究还表明，由于在对照条件下亲本和金字塔的平均产量相同，因此4个基因的掺入对产量没有任何影响。

结论

从目前的实验可以看出，四个基因金字塔在多种背景下可以对抗Xoo语病原菌对玉米产量无显著影响，对玉米的农艺性能无显著影响。这些金字塔可以直接用于育种计划，或者在未来的育种计划中作为抗细菌枯萎病的潜在捐助者。的演变Xoo语病原体是一个动态过程。在未来，新的种族/s可能会击败这四个基因组合。因此，对病原菌群体结构的研究是一个持续不断的过程，以确定对新小种有效的正确基因组合，并将该基因组合推广到易感品系

Acknowlegemets

作者感谢巴瓦莱基金会主任Usha B. Zehr博士和执行主任Dinesh C. Joshi先生的鼓励和资金支持。

参考文献

1. Adhikari TB, Basnyat RC和new TW。1999.毒性的、黄oryzaepv。oryzae对水稻品系含单
2. 抗性基因和基因组合。植物病害,83 (1):46-50。
3. Basavaraj SH, Singh VK, Sing AT, Singh AS, Singh AN, Anand D, Yadav S, Ellur RK, Singh D, Gopalakrishnan S，
4. Nagarajan M, Mohapatra T, Prabhu KV和Singh AK。2010.标记辅助改良细菌性枯萎病
5. 超细粒香稻杂交种PusaRH10亲本的抗性研究。分子育种,26日:293 - 305。
6. DOI：10.1007 / s11032 - 010 - 9407 - 3
7. Bharatkumar S, Paulraj RSD, Brindha PV, Kavitha S和Gnanmanickam SS。2008。改善细菌性枯萎病
8. 通过标记辅助回交育种对水稻品种Jyothi和IR50的抗性进行了研究。作物科学杂志，21:101
9. 116.DOI: 10.1300 / J411v21n01_07
10. Bhasin H, Bhatia D, Raghuvanshi S, Lore JS, Sahi GK, Kaur B, Vikal Y和Singh K. 2012。新的基于pcr的序列标记
11. 抗白叶枯病基因的位点标记Xa38大米。分子育种,30:607 - 611。DOI:
12. 10.1007 / s11032 - 011 - 9646 - y
13. 李建军，李建军。2003。水稻杂交种是否具有抗虫杂种优势?一项研究摘要研究
14. 选择性(半翅目:飞虱科)及Marasmiapatnalis(鳞翅目:Pyralidae)。经济昆虫学杂志，
15. 96 (6):1935 - 1941。0022 - 0493 - 96.6.1935 DOI: 10.1603 /
16. Collard, Iftekharuddaula, Thomson, Pamplona and Mackill, 2008。水稻GCP回交育种的相关性。
17. 生物信息学资源- MAS。
18. 杨建军，杨建军，杨建军，等。一种植物分子DNA的迷你制剂。植物分子生物学1：
19. 月19 - 21日。DOI: 10.1007 / BF02712670
20. Devadath S. 1989。水稻白疫病的化学防治。:国际细菌研讨会论文集
21. 水稻疫病[国际水稻研究所主编]，1988年3月14 -18日，国际水稻研究所，马尼拉，菲律宾。89年p。
22. 水稻研究理事会。进度报告。2006。第2卷，作物保护(昆虫学，植物病理学):第3.55页。
23. 水稻研究理事会。进度报告，2006年b卷。2，Crop Protection (Entomology, Plant Pathology): pp.3.53.
24. 陈建军，陈建军，陈建军。2013。水稻早期活力相关qtl的分子定位。生物学研究杂志，1：24 - 30。
25. 加勒特K，丹尼S，弗兰克E，劳斯M和特拉弗斯S. 2006。气候变化对植物病害的影响:基因组到生态系统。植物病理学年度综述，44:489 - 509。DOI: 10.1146 / annurev.phyto.44.070505.143420
26. 吉勒博，P. 1998。如何应对食品质量保护法?或者我们如何保护我们需要的农药?美国山核桃种植者协会，91:65 - 69。
27. 黄宁，张建军，张建军，张建军。2000。水稻抗稻瘟病三个主要基因的精细定位和DNA标记辅助金字塔化。理论与应用遗传学，100:1121 - 1128。DOI: 10.1007 / s001220051395
28. 黄宁，张国强，张国强。1997。水稻抗白叶枯病基因的金字塔化:利用RFLP和PCR进行标记辅助选择。理论与应用遗传学，95:313 - 320。DOI: 10.1007 / s001220050565
29. Joseph M, Gopalakrishnan S, Sharma RK, Singh VP, Singh AK, Singh NK和Mohapatra T. 2004。水稻抗白叶枯病与巴斯马蒂品质性状的表型和分子标记辅助选择。分子育种,13：377 - 387。DOI: 10.1023 / B: MOLB.0000034093.63593.4c
30. Karaganilla A, Natural MP和Ou SH. 1973。文化媒介的比较研究、黄oryzaepv。oryzae。菲律宾农业、57:141 - 152。贺考曼，Reddy APK, Hsieh SPY和Merca SD。1973.水稻品种抗虫性评价技术的改进、黄oryzae。植物病害报告，57:537 - 541。
31. 王晓明，王晓明。2013。链格孢属致病性及其战略控制。生物学研究杂志，1：1 - 9。
32. 默尔岑AE。1990.分子标记在寡源性抗病育种中的应用。植物育种,104:-。DOI: 10.1111 / j.1439-0523.1990.tb00396.x
33. 新太瓦。1987.水稻白叶枯病研究现状及展望。植物病理学年度综述，25:359 - 382。DOI: 10.1146 / annurev.py.25.090187.002043
34. Narayanan NN, Baisakh N, Oliva NP, Vera Cruz CV, Gnanmanickam SS, Datta K和Datta SK. 2004。分子育种:标记辅助选择与生物转化相结合的籼稻稻瘟病和白叶枯病抗性研究(cv.Co39)。分子育种,14：61 - 67。DOI: 10.1023 / B: MOLB.0000037995.63856.2d
35. Natrajkumar P, Sujatha K, Laha GS, Srinivasarao K, Mishra B, Viraktamath BC, Hari Y, Reddy CS, Balachandran SM, Ram T, Sheshumadhav M, Shobharani N, Neeraja CN, Ashokreddy G, Shaik H, Sundaram RM。2012.的识别和精细映射Xa33这是一种新的抗病基因、黄oryzaepv。oryzae。植物病理学,102:222 - 228。DOI: 10.5376 / mpb.2012.03.0012
36. 刘慧玲，Ronald PC, Bogdanove A.J. 2006。、黄oryzae病原体:模式作物的模式病原体。分子植物病理学，7：303 - 324。DOI: 10.1111 / J.1364-3703.2006.00344.X
37. 欧胜。1985。水稻疾病。邱园，英国:英联邦真菌学研究所(CMI)，第二版，第61-63页。
38. Ogawa T和Khush GS。1988.抗细菌性枯萎病的主要基因。:水稻白叶枯病国际研讨会论文集[国际水稻研究所主编]，1988年3月14 -18日，国际水稻研究所，马尼拉，菲律宾。p . 177 - 192。
39. Perez ML, Redona DE, Mendioro SM, Vera Cruz MC和Leung H. 2008。渐渗现象的Xa4, Xa7和Xa21温敏遗传雄性不育水稻(栽培稻L.)用于两系杂交种的发展。Euphytica,164:627 - 636。DOI: 10.1007 / s10681 - 008 - 9653 - 1
40. Perumalsamy S, Bharani M, Sudha M, Nagarajan P, Arul L, Saraswathi R, Balasubramanian P, Ramalingam J. 2010。水稻抗白叶枯病基因的功能标记辅助选择(栽培稻l .)。植物品种,129:400 - 406。DOI: 10.1111 / j.1439-0523.2009.01705.x
41. Prasad D, Das K M和Rao GJN。2013.标记辅助选择对水稻白叶枯病抗性基因的金字塔化研究。Euphytica,192 (1):87 - 96。DOI: 10.1007 / s10681 - 013 - 0878 - 2
42. Salgotra RK, Gupta BB, Millwood RJ, Balasubramanian M和Stewart CNJr。2012.利用功能标记辅助选择渗入水稻抗白叶枯病和香气基因(栽培稻l .)。Euphytica,187:313 - 323。DOI: 10.1007 / s10681 - 011 - 0599 - 3
43. Sanchez AC, Brar DS, Haung N, LiZ和Khush GS。2000.序列标记位点标记辅助水稻抗白叶枯病基因的选择。作物科学,40岁:792 - 797。DOI: 10.2135 / cropsci2000.403792x
44. Shanti ML, George MLC, Cruz CMV, Bernardo MA和Nelson RJ。2001.印度东部水稻白叶枯病有效抗性基因的鉴定。植物病害,85:506 - 512。
45. Shanti ML和Shenoy VV。2005.水稻白叶枯病抗性基因及其金字塔的评价、黄oryzaepv。oryzae。之后,42:169 - 173。
46. Siddiq EA, Singh VP, Zaman FU, Sadananda AR, Abraham MJ, Hari Prasad AS, Mahendrum A, Natrajan US, Nagarajan M, Atwal SS, Sinha SN, Chopra NK, Seth R, Mohapatra T, Prabhu, KV和Singh AK。2009.巴斯马蒂优质高产水稻品种的开发:一个成功的故事。印度农业,59:13 - 17。
47. Singh S, Sodhi M, Vikal Y, George MLC, Bala GS, Mangat GS, Garg M, Sidhu JS和Dhaliwal HS。2003.DNA指纹图谱及毒力分析、黄oryzaepv。oryzae从印度北部的旁遮普分离。Euphytica,130:107 - 115。Doi: 10.1023/ a: 10223 290 24651
48. 辛格GP，斯里瓦斯塔瓦MK，辛格RV和辛格RM。1997.白叶枯病在不同水稻品种中的变异及质量损失。印度植物病理学30:180 - 185。
49. Singh S, Sidhu JS, Huang N, Vikal Y, Li Z, Brar DS, Dhaliwal HS, Khush GS。2001.三种抗枯萎病基因(xa5，xa13和Xa21)对籼稻品种PR106进行标记辅助选择。理论与应用遗传学，102:DOI: 10.1007/s001220000495
50. 徐金平、郑珠、卢涛、赵玉成、朴善、朴生、申美娟、金灿灿、Jena KK。2013.水稻广谱抗白叶枯病3个锥体基因选育及其分子分析。大米6:5.DOI: 10.1186 / 1939-8433-6-5
51. Sundaram RM, Vishnupriya MR, Biradar SK, Laha GS和Reddy GA。2008.籼稻优良品种桑巴·马苏里抗白叶枯病的标记辅助渗入。Euphytica, 160:411 - 422。DOI: 10.1007/s10681-007- 9564-6
52. 张建军，张建军，张建军，张建军，张建军，张建军。细菌性枯萎病致病因子的重新分类(Xanthomonascampestrispv。oryzae)及细菌性叶斑病(Xanthomonascampestrispv。oryzicola水稻的致病变种Xanthomonasorzae(ex Ishiyama, 1922)国际系统细菌学杂志40岁:309 - 311。
53. 维马尼和库马尔。2004。开发和利用杂交水稻技术提高热带地区水稻产量。《国际水稻研究笔记》29 (1):10 - 19。
54. 维尔马尼出版社，1996。杂交水稻。农学进展57:377 - 462。Yoshimura S, Yoshimura A, Iwata N, Mc. Couch SR, Abenes ML, Baraoidan MR, newtw, Nelson RJ。1995.利用RAPD和RFLP标记对水稻抗白叶枯病基因进行标记和组合。分子育种1:375 - 387。DOI: 10.1007 / BF01248415
55. Yoshimura S, Umehera Y, Kurata N, Nagamura Y, Sasaki T, Minobe Y和Iwata N. 1996。YAC克隆携带Xa-1等位基因，水稻中的抗白叶枯病基因。理论与应用遗传学, 93:117 - 122。DOI: 10.1007 / BF00225736
56. 年轻的ND和坦克斯利SD。1989.回交育种中番茄Tin-2位点周围保留染色体片段大小的RFLP分析。理论与应用遗传学, 77:353 - 359。
57. 翟文霞，朱丽莲。1999.水稻抗白叶枯病基因及其在分子育种中的应用。先进的生物技术,１９：9日至15日。
58. 张强。2005。中国水稻白叶枯病抗性基因的利用与策略。中国水稻科学，19 (5):453 - 459。(中文，附英文摘要)