龙葵、大黄、栀子等药用植物对癌细胞的体外抗癌筛选。

摘要

采用体外细胞毒性试验方法，测定了龙葵(Solanumindicum)、琥珀黄(Rhus succedaneum)、大黄(Rheum emodi)和栀子(Gardenia gummiifera)药用植物甲醇提取物对人非小细胞肺癌(H1975)、前列腺癌(pc -3和DU145)、大肠癌(HCT116)和恶性黑色素瘤(A375)的抗肿瘤活性。体外细胞毒性试验结果表明，黄毛、黄毛、黄毛和黄毛提取物对DU145细胞的细胞毒性最强，IC50分别为8.48∞g/ml、24.5∞g/ml、28.24∞g/ml和28.61∞g/ml，对PC-3细胞的IC50分别为11.18∞g/ml、11.04∞g/ml、11.05∞g/ml和23.03∞g/ml。这些提取物对H1975细胞的IC50分别为9.03∞g/ml、7.71∞g/ml、15.95∞g/ml和11.71∞g/ml。这些提取物对HCT116细胞的IC50分别为17.58∞g/ml、8.87∞g/ml、19.31∞g/ml和11.67∞g/ml。最后，这些提取物的甲醇提取物对A375细胞的细胞毒性分别为5027.94∞g/ml、13.13∞g/ml、11.05∞g/ml和7.816∞g/ml。我们的研究结果表明，南菖蒲、南菖蒲、南菖蒲和南菖蒲的甲醇提取物具有较强的细胞毒作用，由于其对正常细胞的毒性较低，因此有待进一步研究，以寻找潜在的草药配方作为化疗药物的替代品。

关键字

癌症，细胞毒性，结直肠，肺，前列腺。

简介

癌症是一种由物理、环境、代谢、化学和遗传因素共同发展的多步骤疾病，这些因素在癌症的诱发中起直接和/或间接作用[1］．全世界每年约有1000万新确诊病例，600多万人死于癌症[2］．患癌症的风险一般会随着年龄的增长而增加[3.］．癌症的存活机会因癌症的类型、位置和治疗开始时的疾病程度而有很大差异。用植物源性植物化学物质进行化疗已成为一种可行且有前途的癌症控制和管理方法[4］．

几种植物已被证明是重要的治疗药物的来源，对癌症治疗有益。例如，许多癌症化疗药物，包括从马达加斯加长春花中分离出来的长春花生物碱长春芽碱和长春新碱[3.，5]，(红豆杉果中的紫杉醇和多西紫杉醇[6]，来自鬼臼根的鬼臼毒素[7，喜树碱来源于喜树酸树皮[8等等。

研究表明Solanumindicum(茄科)遍布南亚，在印度通常被称为“开始”。这种植物的不同部分(果实，叶子，根)传统上用于治疗食欲不振和厌食症，血液疾病，鼻炎，咳嗽，哮喘，喉咙痛和打嗝，性障碍，腹痛和蠕虫感染，疼痛和发烧，炎症，失眠，泌尿系统并发症，心脏虚弱等。这种草本植物的果实、叶子和根含有蜡、脂肪酸、生物碱等。已从该植物中分离出的薯蓣皂苷元、羊毛甾醇、谷甾醇、茄茄碱、茄碱、茄碱和茄碱[9］．乙醇植物学研究亦显示其对超敏反应、糖尿病及黄疸有疗效[10，11，12］．采用切在亚洲也有发现。在印度民族医学中，这种植物在当地被称为Kakrasingi，并被用作治疗腹泻和痢疾的阿育吠陀疗法[13］．据报道，它具有抗病毒[14]，抗菌剂[15]和细胞毒性[16］．风湿病通常被称为喜马拉雅大黄，是印度阿育吠陀医学系统中使用的一种草药，通常在印度发现。蒽醌类是大黄的主要成分。它被用于治疗肾结石和其他肝脏相关疾病，如痛风和黄疸[17，18］．经证实，黄芪提取物对热氏螺杆菌有一定的抑菌活性。19］．栀子属栀子科，是一种开花灌木，在印度有不同的名字。这种植物的树胶树脂叫做Dikamali [20.］．这种口香糖具有多种药用特性，包括抗痉挛、抗癫痫、强心性和抗氧化潜能[21，22］．从栀子中分离的环芳香烃被发现具有细胞毒性和抗hiv活性[23，24，25，26，27］．

一项文献调查显示，这些植物提取物的抗癌潜力尚未在与四种不同癌症相关的五种人类癌细胞系上进行研究:人类非小细胞肺癌(H1975)、前列腺癌细胞系(PC-3和DU-145)、结直肠癌细胞系(HCT116)和皮肤恶性黑色素瘤(A375)。研究发现，同一种抗癌化合物对不同细胞系的作用不同。因此，使用不同的细胞系对评估抗癌效果变得更有价值。

在本研究中，我们承担了研究枸杞粗甲醇提取物的抗癌活性的任务Solanumindicum(水果)采用切(茎),感冒emodi(树脂)和栀子(树脂/棒)在五种不同组织学来源的人类癌细胞系中。有趣的是，所有提取物对癌细胞的抑制均呈剂量依赖性，溶血试验显示这些提取物对红细胞无影响。本研究结果对开发新型抗癌治疗药物具有重要意义。

材料与方法

植物材料收集

植物材料Solanumindicum(水果)采用切(茎),感冒emodi(树脂)和栀子花(树脂/枝条)收集自班加罗尔的AmrutaKesari仓库。

植物材料提取

风干和粉末状植物材料(各20g)用250ml甲醇(CH_3.OH)经索氏仪60°C, 8hrs [28，29］．粗提物被过滤，滤液用旋转蒸发器蒸发。溶解的成分在加压真空条件下进一步干燥。通过将干燥的残渣溶解在二甲基亚砜(DMSO)中制备原液。提取液保存在−20°C直到使用。

细胞培养

在本研究中，我们使用了从美国组织培养集(ATCC)中获得的人类非小细胞肺癌(H1975)、前列腺癌(PC-3和DU145)、大肠癌(HCT116)和恶性黑色素瘤(A375)六种不同的癌细胞系。H1975、PC-3、DU145和HCT116细胞在Roswell Park Memorial Institute培养基(rmi -1640)中培养，A375细胞在Dulbecco 's Modified Eagle 's培养基(DMEM)中培养，DMEM中添加10%热灭活胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。细胞在37°Cin和5% CO孵育₂湿润孵化器。

细胞毒活性(MTT试验)

细胞毒性试验检测线粒体脱氢酶将MTT[3-(4,5 -二甲基噻唑基)- 2,5 -二苯基-四溴化铵]还原为蓝色不溶性甲醛产物，这反映了线粒体的正常功能，从而反映了细胞活力。将DU145、PC-3、H1975、HCT116和A375的5.0 X 104细胞分别用rmi -1640或DMEM分别镀于96孔板中，37℃孵育24小时。植物提取物在无血清RPMI培养基中分别以0、2、4、8、16、32、64和128 μg/ml的浓度进行测试，并在CO中孵育24小时₂37°C恒温箱。用植物提取物孵育后，从孔中取出培养基，加入100 μl/孔的MTT试剂，孵育3-4 h。孵育后，除去MTT试剂，每孔加入100 μl DMSO，轻轻摇匀。将处理过的细胞与未处理过的细胞对照孔进行比较。使用Tecanmicroplate阅读器测量590nm处的吸光度。用该公式测定抑菌率。

%抑制= 100-(样品光密度/对照光密度)× 100。

集成电路₅₀数值计算为任何被测细胞的增殖抑制率为50%的浓度[30.，31，32，33］．

人红细胞的分离

从健康志愿者身上采集5毫升血液，放入含有5.4毫克EDTA的试管中，以防止凝血，并在40℃下以1000转/分钟的速度离心10分钟。小心地去除血浆，并以极小心的吸液器完全去除白色淡黄色层。然后用1X PBS (pH 7.4)额外洗涤红细胞3次。洗涤后的红细胞存放在47℃，并在6小时内用于溶血试验[34，35，36］．

溶血试验

溶血活性是一种研究血液与可能诱发红细胞溶解的生物材料相互作用的方法。在这项研究中,我们阐述了短暂花费50μl 10稀释(100μl红细胞悬架:900μl 1 x PBS)红细胞悬液为2毫升的新埃普多夫管和孵化100μl各种植物提取物的浓度(0、2、4、8、16、32、64和128μg / ml)在370 c水浴60 - 90分钟。在这里,我们使用100μl 1 x PBS -控制和100μl 1% SDS作为积极的控制,然后调整反应混合物的体积为1毫升通过添加850μl 1 x PBS。最后在300 rpm下离心3-5 min，用Tecan微板仪在540nm处测量得到的上清血红蛋白。数据分析软件测定血红蛋白浓度[34，35］．以100 μl 1% SDS引起的溶血为100%溶血;并根据公式计算溶血率

统计分析

所有试验均进行三次，每组2 - 3个独立实验。集成电路₅₀细胞毒性试验值由基于s型剂量反应曲线(变量)的非线性回归分析(曲线拟合)得出，并使用Graph Pad Prism 5 (Graphpad，圣地亚哥，加州，美国)计算[37，38］．

结果

细胞毒性试验

为了验证上述植物提取物可能的抗增殖作用，作为开发新型抗癌药物的第一步，我们测试了s.m inindicum (Fruit)的甲醇提取物，R.succedanea(茎),R。emodi(树脂)和g。以DU145、PC-3、H1975、HCT116和a375癌细胞系为研究对象，考察其在2 ~ 128 μ g/ml浓度下对癌细胞生长和活性的抑制作用。上述提取物对这些细胞的增殖有显著的抑制作用，并呈浓度依赖性图1．四种提取物对DU145 (A)细胞和IC的抑制作用均达到70 ~ 75%₅₀(8.482 μ g/ml);R.succedanea(24.5 μ g/ml);emodi (28.24 μ g/ml)和g .gummifera (28.61 μ g/ml)。而白蜡和白蜡对PC-3 (B)细胞和IC的抑制作用为80-90%₅₀(11.04 μ g/ml)和(11.05 μ g/ml)。但是s indicumandg . gummifera抑制PC-3细胞和IC 40-50%的生长₅₀黄芪(11.18 μ g/ml)和黄芪(23.03 μ g/ml)。在H1975 (C)细胞中，S.indicum抑制80- 90%R.succedanea， R.emodi和g . gummifer40 - 65%的生长抑制和IC₅₀S.indicum(9.03μg / ml),R.succedanea(7.71μg / ml), R。emodi (15.95μg/ml)和G.gummifera (11.71μg/ml)。对HCT116 (D)细胞的生长有80 ~ 90%的抑制作用₅₀S.indicum(17.58μg / ml),R.succedanea(8.87μg / ml), R。Emodi (19.31μg/ml)g . gummifera(11.67μg / ml)。结果表明，菟丝子提取物对A375 (E)细胞的抑制作用为75 ~ 80%，其余提取物对A375 (E)细胞的抑制作用为90 ~ 95%₅₀S.indicum(27.94μg / ml),R.succedanea(13.13μg / ml), R。emodi (11.05μg/ml)和G.gummifera (7.81μg/ml)。因此，我们的研究结果表明，这些植物的甲醇提取物具有很强的广谱抗癌活性。

用不同浓度(0、2、4、8、16、32、64和128 μg/ml)的上述植物提取物在无血清培养基中培养24小时。使用MTT法测定诱导细胞死亡的百分比，每个数据代表三个独立实验的平均值。

将人红细胞与不同浓度(0、2、4、8、16、32、64和128 μg/ml)的上述植物提取物在370C水浴中孵育60 min。在540 nm处用分光光度计(JENWAY 6305 UV/Vis.)测定所产生上清的吸光度，以确定溶血程度。溶血率计算公式为%溶血率=[(对照- ASample) /对照]x 100。所有的分析都是两个独立实验的平均值。

溶血试验

溶血试验方法适用于评价生物材料和医疗器械的血液相容性，符合国际标准ISO 10993-4:2002。由于黄菖蒲、黄菖蒲、黄菖蒲和黄菖蒲的甲醇提取物对上述人类癌细胞均有抗肿瘤活性，因此我们对黄菖蒲的浓度进行了0 ~ 128 μg/ml的测定。R.succedanea，r . emodiandg . gummifera提取物对人红细胞的作用如图所示图2．各提取物浓度均无明显的溶血活性;结果表明，大鼠黄毛提取物的溶血率为2-9.5%，呈浓度依赖性g . gummifera提取液在64 ~ 128 μg/ml时溶血率极低(< 4%)。

讨论

本研究评价了金菖蒲甲醇提取物的细胞毒活性。R.succedanea，r . emodiandg . gummiferainDU145、PC-3、H1975、HCT116和A375癌细胞系及其IC₅₀详见表1．不同的部分(果实，叶，根)在传统上用于治疗各种疾病，如上一节所述。在本实验中，indicus提取物对du145、PC-3、H1975、HCT116和A375癌细胞的生长有抑制作用₅₀浓度分别为8.48、11.18、9.03、17.58、27.94μg/ml (图1而且表1)．印楝苷活性成分对Bel-7402细胞增殖具有剂量依赖性抑制作用，并可通过线粒体依赖途径诱导细胞凋亡[39］．茄属成分Solavetivone1对OVCAR-3细胞具有细胞毒性[40］．从整个植物中分离得到β -谷甾醇(SI-0)、β -谷甾醇葡萄糖苷(SI-1)、薯蓣皂苷(SI-2)、薯蓣皂苷的甲基原原原素A (SI-3)、甲基原薯蓣皂苷(SI-4)和原薯蓣皂苷(SI-5)的生物活性成分SolanumindicumL，对7种癌细胞系均有细胞毒性。SI-3、4、5在C6胶质瘤细胞中具有体内抑瘤作用，SI-2在10微克/ml浓度下对C6胶质瘤细胞DNA合成具有抑制作用[41］．

这种植物在当地被称为Kakrasingi，在印度民族医学中，它被用作阿育吠陀治疗腹泻和痢疾[13]。据报道，它还具有抗病毒作用[14]，抗菌剂[15]，以及细胞毒性[16］．结果表明，白藜草提取物能抑制DU145、PC-3、H1975、HCT116和A375癌细胞的生长₅₀浓度分别为24.5、11.04、7.71、8.87和13.13μg/ml (图1而且表1)．从Rhussuccedanea汁液的乙醇提取物中分离得到两个新的抗氧化和细胞毒化合物，10'(Z)， 13'(E)， 15'(E)-十七方三烯基对苯二酚(1)和10'(Z)， 13'(E) -十七方三烯基对苯二酚(2)，以及已知的10'(Z)-十七方三烯基对苯二酚(3)，对五种癌细胞具有抗氧化和细胞毒活性[42］．

大黄提取物对DU145、PC-3、H1975、HCT116和A375癌细胞生长及IC均有抑制作用₅₀浓度分别为28.24、11.05、15.95、19.31、11.05μg/ml (图1而且表1)．大黄醇提物对MDA-MB-435S和Hep3B细胞系具有浓度依赖性的细胞毒性，这是由于大黄醇中含有β-间苯二甲酸、大豆黄酮-8- o -葡萄糖苷(葛根素)、大豆黄酮、槲皮素和黄酮醇等酚类化合物[43］．大黄素(1)是几种草本植物的主要活性化合物，属蒽醌类化合物，从大黄根中分离得到，对HepG2和MDA-MB-231细胞有抗增殖活性[44］．

同时，对DU145、PC-3、H1975、HCT116和A375癌细胞的生长也有抑制作用₅₀浓度分别为28.61、23.03、11.71、11.67和7.816μg/ml (图1而且表1)．口香糖具有许多药用特性，包括上节提到的驱虫剂，抗痉挛，抗癫痫和抗氧化潜能。Dikamaliartane-A，一种从胶树脂中分离出来的环芳香烃，g . gummifera在HeLa(宫颈癌)和MCF-7(乳腺癌)细胞系体内外均有良好的抗癌活性[45］．

总的来说，我们的结果表明，在葡萄的甲醇提取物中存在生物活性成分，R.succedanea，r . emodiand<g . gummifera显著抑制前列腺癌、肺癌、结直肠癌和皮肤癌的生长，并通过线粒体依赖途径诱导细胞凋亡。然而，我们可以得出结论，所有这些提取物不仅可以抑制特定类型的癌细胞生长，而且可以抑制大多数类型的癌细胞生长。

采用溶血试验方法，测定了羊蹄草甲醇提取物、R.succedanea，r . emodiandg . gummifera穿过红细胞膜，与血红蛋白相互作用，引发一系列反应，导致红细胞溶解[34］．除葡萄外，其余提取物均表现出浓度依赖性的水解活性图2．结合酚类化合物、皂苷等生物活性成分的主要特征是具有溶血作用，由于这些提取物中存在溶血作用。

根据美国国家癌症研究所，IC₅₀考虑一种具有开发抗癌药物前景的粗提物的价值低于30μg/ml的限制阈值[43］．在我们的研究中，R.succedanea，r . emodiandg . gummifera提取物中含有显著的IC₅₀值小于28μg/ml以上不同类型的癌细胞生长。因此，所有这些提取物都可以作为抗癌化合物的潜在来源。

结论

综上所述，本实验结果表明，山茱萸醇提物具有较好的抗氧化活性。indicum,R.succedanea，r . emodiandg . gummifera不仅能抑制特定类型的癌细胞生长，还能抑制大多数类型的癌细胞生长。药用植物是天然产物，可能具有治疗潜力;然而，自然并不意味着它们就一定安全。进一步的工作是在我们的实验室评估他们的配方有效的体外和体内抗癌潜力和深入的机制方面的进展。

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