7种木霉对不同植物病原真菌拮抗作用的体外筛选

摘要

从番茄和辣椒根际土壤分离出7种不同的木霉，对土壤中最常见的几种植物病原菌，即番茄枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)、茄疫病(Alternaria solani)、黑曲霉(Aspergillus niger)和菜豆大霉(Macrophomina phaseolina)进行体外拮抗，鉴定出具有较高拮抗潜力的木霉菌株。所有木霉种类的分离株通过产生挥发性和非挥发性抑制剂来高度抑制三种测试病原体的生长，显示不同木霉种类对不同测试病原体的拮抗潜力存在差异。绿僵菌和pseudokoningii通过产生挥发性抑制物，分别对茄孢链孢菌(86.6%和86.6%)和oxysporum(81.1%和80.0%)的生长抑制作用最大。而通过产生非挥发性抑制剂，绿僵菌和pseudokoningii对番茄枯草菌的生长抑制率分别为86.6%和83.3%和82.2%，oxysporum的生长抑制率为78.9%。而菜豆木霉对木霉的抑制作用相对较弱，产生挥发性和非挥发性化合物。番茄赤霉病菌、番茄赤霉病菌、番茄赤霉病菌和番茄赤霉病菌均表现出较高的拮抗活性。

关键字

拮抗，辣椒，番茄，木霉属，挥发性和非挥发性抑制剂。

介绍

病害是作物产量低、种子质量差的重要生物原因。病原菌由土壤和种子传播，是防治该病的一大难题。土壤传播的疾病难以控制，用杀菌剂处理种子不能长期保护作物。对同一种病原体持续使用同一种杀菌剂会导致病原体产生抗杀菌剂菌株(Shanmugam和Varma, 1998;库马尔和杜贝，2001;Mamgain等, 2013)。

此外，化学措施可能造成微生物群落的不平衡，不利于有益生物的活动，否则这些有益生物可以改善作物健康。由于人们对化学品的安全和环境方面的关切，对化学防治植物病原体的替代品的需求越来越强烈。然而，生物防治除了避免农药抗性问题外，还提供了在现有资源范围内提高作物产量的机会(Dekker, 1976;汗等, 2014)。

属的种木霉属在环境中普遍存在，尤其是在土壤中。的拮抗电位的表征木霉属物种是充分利用物种潜力的第一步木霉属特殊应用。在体外筛选不同的病原体是一种快速、有效地鉴定具有拮抗潜力菌株的方法。木霉属真菌是一种丝状土传真菌，已被证明对许多土传植物病原体有效(Papavizas, 1985;锅等, 2001;Jash和Pan, 2004)，因为它们有不止一种作用机制。

因此，本研究评估了七种不同的拮抗潜力木霉种类即，绿木霉，哈氏木霉，里氏木霉，atroviride, pseudokoningii木霉，koningii木霉和t .液对抑制一些最广泛存在于土壤中的植物病原体的生长，即镰刀菌素番茄枯萎菌、茄链病菌、黑曲霉和菜豆大霉和识别木霉属具有高拮抗潜能的菌株。

材料与方法

分离出7种不同的木霉属采用土壤稀释板技术(Johnson and Curl, 1972)对木霉属选择性介质(TSM) (Saha和Pan, 1997)。采用滑动培养技术对绿色菌落进行鉴定，并与Rifai(1969)的分类键进行属和种水平比较。美国文化木霉属单孢子分离纯化，PDA斜置，4℃冰箱保存备用。

病原体是从表现出病状的番茄和辣椒植株中分离出来的镰刀菌素枯萎病，早疫病，炭腐病和冠腐病。这些分离的病原体被鉴定，纯化和致病性测试(Guvvala等, 2013)。

7的超寄生潜能木霉属筛选物种在体外对抗四种试验植物病原体，即番茄枯萎菌，茄链病菌，黑曲霉和Macrophomina phaseolina通过双培养板技术和生产挥发性和非挥发性代谢物。

在体外真菌拮抗剂筛选

七种不同种类的木霉属对测试病原体进行筛选在体外．

的功效木霉属双平板培养法对病原菌生长的影响

为了在双重培养法中测试拮抗作用(Morton和Stroube, 1955)，从5天龄的培养物活跃生长区域的边缘切下一个6mm的菌丝盘木霉属在培养板的一端(距离培养板边缘1cm)接种无菌马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，同时在另一端接种试验病原体的菌丝盘(6mm)。每个处理维持3个重复，在28±1°C下孵育。保留每种病原体的对照板。在双重文化中木霉属分离物根据其过度生长和抑制病原体生长的能力被分类为有效，并根据改进的贝尔量表(Bell’s scale)给它们打分等其中R1= 100%超生长，R2= 75%超生长，R3= 50%超生长，R4=锁定在接触点。雷竞技网页版

菌丝的交互

用双培养板技术研究了拮抗剂与试验病原菌之间的菌丝相互作用。在针的帮助下，将菌丝垫从双培养板的相互作用区轻轻提起，放在显微镜载玻片上的棉蓝滴中。菌丝毡进一步转移到含有乳酸酚的清洁载玻片上，并在显微镜下观察。

抗生

影响挥发性和非挥发性化合物的产生木霉属根据Dennis和Webster (1971a, b)描述的技术，研究了菌株对病原体生长的影响。

挥发性代谢物的影响

挥发性抗生素的生产研究遵循Dennis和Webster (1971b)的方法进行。七种木霉属在含有固化灭菌PDA培养基的培养皿的中心接种，将6mm的圆盘(3d旧培养)置于木霉属sp.， 28±1°C孵育3 d。然后将每个培养皿的上盖替换为另一个相同大小的含有PDA培养基的培养皿的底部，在孵育3d后适当接种试验病原体的6mm菌丝盘。每个板对用parfilm(胶带)密封，28±1°C孵育。PDA媒体没有木霉属在培养皿底部分离，在培养皿上盖分别检测病原菌作为对照。每个处理维持3个重复。72h后打开组装，通过测量每个平板和对照平板上被试病原体的菌落直径(单位:mm)来记录观察结果。

非挥发性代谢物的作用

7个菌株的培养滤液效果木霉属根据Dennis和Webster (1971a)的方法对试验病原体进行了研究。取50ml无菌马铃薯葡萄糖汤，放入250ml Erlenmeyer锥形瓶中，接种从培养4天边缘剪下来的5毫米拮抗菌丝盘。接种瓶在28±2ºC恒温15天，在摇轨器中不断摇晃。培养滤液经Whatman 1号滤纸收集，滤液收集于灭菌锥形瓶中，以6000转/分的速度离心15分钟后，经纤维素膜Millipore过滤器灭菌。

将试验病原菌的菌丝盘(6mm)接种于含25%培养滤液(PDA +培养滤液)的培养皿中央，28±1℃孵育，直至各自病原菌完全覆盖对照培养皿。以接种试验病原菌但未加培养滤液的PDA板作为对照。每个处理维持3个重复。记录了对试验病原体径向生长的周期性观察(Khan和Sinha, 2007)。根据Garcia计算挥发性和非挥发性化合物对病原菌菌丝生长的抑制百分比等．(1994)，使用公式:

抑制率=C- t /C*100

C =对照病原菌径向生长(mm)，

T =处理时病原菌径向生长(mm)。

结果与讨论

的种类木霉属从番茄和辣椒根际土壤中分离出的菌种，经形态学鉴定和显微观察，分别属于7个不同的种，即:绿色木霉(Tv)、哈氏木霉(Th)、里氏木霉(Tr)、atroviride木霉(Tatr)、koningii木霉(Tk)、pseudokoningii木霉(Tps)、virens木霉(Tvrn)。t . viride其次为Th、Tvrn、Tps、Tr、Tk、Tatr。从菌落颜色、结构、生长模式、菌囊和菌囊孢子大小等方面对拮抗菌株进行了形态学表征。

所鉴定的试验病原体为镰刀菌素Oxysporum f. sp。番茄疫病菌(Fox)、茄疫病菌(As)、黑曲霉(An)和菜豆大霉(Mp)．病原学检测呈阳性的病原菌在PDA斜面上增殖保存。

拮抗菌株双培养筛选试验病原菌生长定植的观察(表1)证明了不同种类的木霉属它们抑制试验病原体生长的能力不同。Tps、Tatr和Tvrn对Fox、As和Mp、Tr对As和Mp、Tk对Fox和Mp、Tv对As表现出较高的拮抗作用，病原菌菌落完全过度生长(100%过度生长)，按Bell评分为R1 (表1)。Tps和Tvrn完全超过了Fox和As的菌落，Tr在72小时内超过了As。Tv与a和Tatr重叠，Fox与a重叠，花了96个小时。然而，Tk, Tps, Tr, Tatr和Tvrn花了120个小时才完全超过Mp, Tk超过Fox。快速生长的菌株对病原体的抑制作用更强，这可能是由于支原体寄生和对空间和营养物质的竞争。哈曼等．(1980)认为分枝杆菌寄生是控制豌豆种子中毕氏菌的主要机制。毕氏菌的菌丝寄生木霉属也被观察到在体外许多工人(利弗希茨等, 1986;库马尔和胡达，2007)。

Tps和Tvrn被证明是优越的，因为它们比Fox和As生长更快(需要24小时接触)。雷竞技网页版Tv能在An和Mp上部分过长，Tk比As, Tatr比An。然而，Tv无法殖民Fox, Th无法过度生长Fox, As和Mp, Tps在An上，Tr在Fox上，并被给予Bell的排名R4。这些被锁定在接触点上，表现出对病原体的高寄生潜力。雷竞技网页版Th、Tk和Tvrn孵育9 d后均无接触。雷竞技网页版这些菌株在双重培养条件下生长速度较慢，竞争能力较差，表明其拮抗潜力较差。

不同菌株的寄生能力差异木霉属对土壤真菌病原体的抑制作用已被报道(Prasad和Rageswaram, 1999;Sarker和Sharma, 2001;Pan和Bhagat, 2007)和物种木霉属对不同的真菌有不同的选择性(Dennis and Webster, 1971a, b;井等, 1972)。这种现象可能与不同菌种或分离物在攻击病原菌菌丝体时产生的水解酶水平的差异有关。木霉属sp .能够产生细胞外裂解酶，负责它们的拮抗活性(Elad等, 1982)。

双培养板相互作用区菌丝毡的显微观察表明，Tps、Tk、Tr、Tatr和Tvrn通过向病原体(病原体)生长和缠绕菌丝与病原体相互作用。观察到分枝杆菌产生小的旋钮状结构。这些带有穿透栓的吸器旋钮状结构，穿透宿主，最终溶解原生质和收缩的菌丝，这可能导致裂解(Weindling, 1932)。

Th与病原菌之间、Tv与Fox和An、Tk与As、Tr与Fox和Tatr与An之间均未观察到菌丝相互作用。分枝杆菌寄生包括菌丝相互作用和寄生作用，是真菌拮抗作用保护植物免受病原菌侵袭的最重要机制。分枝杆菌寄生作为生物控制的主要机制受到许多科学家的青睐(Weindling, 1932;豪厄尔，1982,2003)。分枝杆菌对病原体的生长表明了一种正向趋向性，可能是寄生虫对宿主的趋化性(Chet, 1987)。

生物质生产

生物量产量最高的是绿刺柳，其次是绿刺柳、哈氏刺柳和孔雀柳，生物量最低的是伪孔雀柳(表2，图1）.

挥发性化合物

所有的分离物木霉属拮抗作用抑制了病原菌的径向生长镰刀菌素通过产生挥发性和非挥发性抑制剂来抑制番茄枯萎菌、茄疫病菌、黑曲霉和菜豆大霉。不同的分离物木霉属挥发性和非挥发性代谢物的产生不同，因为它们引起了不同程度的测试病原体的生长抑制。

Tps和Tvrn被认为是七种方法中最有效的木霉属Sp .，通过产生挥发性抑制剂抑制测试病原体的生长(表3)。Tvrn和Tps在培养3d后对As的生长抑制作用最大(86.6%)。在Tvrn培养3d后，Fox的生长抑制率最高(81.1%)，其次是Tps，培养5 d后生长抑制率为80.0%。观察表明，年轻的文化木霉属(拮抗真菌)产生更多的挥发性化合物，从而最大限度地抑制病原体的生长。然而，这七个木霉属结果表明，不同种类的植物通过产生挥发性化合物来抑制Mp的生长。

非挥发性化合物

Tk、Tps和Tvrn培养滤液中不挥发性化合物在25%浓度时显著抑制试验病原菌的生长(表3）.25% Tvrn滤液对As和Fox的抑制作用最强(86.6和82.2%)，Tps对As和Fox的抑制作用次之(83.3%和78.9%)。培养滤液对As的生长抑制率为81.1%。培养滤液全部7个木霉属与其他病原菌相比，菌株对Mp的生长抑制作用较小。而Tr培养滤液对Mp的生长抑制作用最小(48.9%)。

在本研究中，Tps、Tvrn和Tk产生的挥发性和非挥发性抗生素对Fox、As、An和Mp的生长有抑制作用(少数例外)。其他种类的木霉属抑制试验病原菌径向生长，但抑制程度相对较小。

从目前的研究可以清楚地看出，拮抗真菌通过产生挥发性和非挥发性化合物来抑制测试病原体的生长，这表明生物控制的主要机制是抗菌作用(Shanmugham和Varma, 1999, Hazarika)等, 2000)。抗生素作用是由微生物来源的特异性或非特异性代谢物、水解酶、挥发性化合物和其他有毒物质介导的拮抗作用。细胞游离培养滤液被用来证明抗生素在生物控制中的可能作用。值得一提的是木霉属已知sp .能产生一些抗生素，如木霉菌素，木霉菌酚，herzianolide (Kucuk和Kivanc, 2004)。

本研究结果表明，所有分离株均可分离木霉属对三种病原菌的生长均有显著抑制作用。然而，通过产生挥发性和非挥发性抑制剂，Mp被相对较少的抑制。早前已经观察到拮抗真菌对特定真菌的拮抗活性具有特异性(Saleem等, 2000)。对立的木霉属对一系列土壤传播的植物病原体的抑制作用早有报道(潘等, 2001;Papavizas, 1985)。

不同药物拮抗电位的可变性木霉属在本研究中观察到对抗不同病原体的spp，这与早期的报道相似(Pan和Bhagat, 2007)。分离物的强选择性木霉属sp的拮抗作用对特定的病原体至关重要。

结论

七种不同种类的木霉属对试验病原菌表现出最大的生长抑制作用，其拮抗潜能存在差异。Tvrn、Tps、Tatr、Tk、Tv和Th对枯萎病菌和枯萎病菌具有较强的拮抗作用。而豆荚草相对较弱的抑制作用木霉属物种。

确认

Dr. A. Hindumathi非常感谢新德里科学与技术部在女科学家计划a (WOS-A)下提供奖学金。SR / WOS-A LS-498/2011 (G)。

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