蔗糖脂肪酸酯的抑制影响食源性金黄色葡萄球菌生物膜的形成

文摘

生物膜在食品工业的形成是一个极大的威胁。本研究旨在探讨蔗糖酯的抑制食源性金黄色葡萄球菌的生物膜的形成。十二个金黄色葡萄球菌菌株被孤立,识别和用于生物膜的形成能力测定蔗糖酯的存在与否。细菌粘附碳氢化合物测试(浴)来分析细胞表面疏水性的蔗糖酯治疗和生物膜的形成能力和疏水性之间的相关性。不同等级的生物膜的形成抑制蔗糖酯中观察到所有的隔离。细胞表面疏水性(CSH)的浓度的蔗糖酯3毫克/毫升和4毫克/毫升下降,表明biofilmproducing能力和利率之间的正相关CSH (P < 0.05)以及显著降低CSH的蔗糖酯在生物膜发展(P < 0.05)。本身具有巨大的潜力作为生物膜的形成的抑制剂的食源性病原体。

关键字

金黄色葡萄球菌、蔗糖酯、生物膜形成、疏水性、抑制。

介绍

金黄色葡萄球菌,作为一种重要的食源性病原体,被认为是负责疫情相关的新鲜和加工食品的消费。生物膜的形成对食品加工厂的表面金黄色葡萄球菌干预努力消除污染(1- - - - - -3]。生物膜微生物群落,装在一个selfsynthesized胞外聚合物基体(EPS)和高度生物或非生物表面在增长(4,5]。细菌生物膜对人类健康产生明显影响(6,7),包括龋齿,感染的植入物和食品污染,由于其增强致病能力相对于细菌在溶液中由于固着行为,提高其耐消毒液和其他抗菌素(8]。

有必要澄清biofilm-related污染导致生物膜的微生物污染的网站。最近研究生物膜主要专注于研究化学抑制剂,它调节致病性细菌生物膜的形成(9]。然而,在食品加工环境,其中一些anti-biofilm化合物是禁止出于安全考虑。最近,蔗糖酯作为一个自然成分的食品,在过去几十年得到了广泛研究,用于食品、化妆品和洗涤剂行业。此外,几种类型的合成SE显示强大的杀虫活动和可以作为一个新的抑菌剂与一位才华横溢的商业前景。月桂酸单甘油酯(monolaurin)执行大量的抗菌活性对单核细胞增多性李斯特氏菌和大肠杆菌O157: H7 (10,11]。

尽管广泛研究,SE抑制细菌的基本机制并没有被完全理解。我们假设蔗糖酯作为表面活性剂解决方案发挥作用在细胞表面疏水性与生物膜的形成有关。因此,本研究的目的是探讨生物膜的形成和表面疏水性之间的相关性金黄色葡萄球菌与蔗糖酯治疗,评估潜在的商业使用SE化合物作为生物膜的形成的抑制剂。

材料和方法

试剂和隔离金黄色葡萄球菌:三种类型的蔗糖酯(SE)、SE7 (7) hydrophilic-lipophilic平衡,SE11 (11) hydrophilic-lipophilic平衡和SE13 (hydrophilic-lipophilic平衡13)是来自浙江总督化工有限公司,有限公司(浙江省金华市,中国),大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB), Baird -帕克琼脂,兔血浆,血液琼脂板买来希望生物技术有限公司有限公司(青岛)。

金黄色葡萄球菌被孤立的来自30个样本包括过期牛肉(20)样品,培根(5)样品,和冷冻猪肉饺子(5)样本,收集当地的杂货店和小超市在广州,中国。12株分离和确定为金黄色葡萄球菌根据国家食品安全标准的食品微生物学检测金黄色葡萄球菌检验(GB -2010 - 4789.10)标准操作。所有的样品都单独激动到10毫升含有75 g / L的管子氯化钠肉汤在37°C 18到24 h,然后接种Baird -帕克板24 h在37°C。殖民地形成一个点在盘子里和明确的区域选择和净化血液琼脂板。孵化后,潜在的金黄色葡萄球菌革兰氏染色剂,生成细胞形态学和血浆凝血试验。这些验证金黄色葡萄球菌存储在-80°C TSB补充20% (v / v)甘油深造。工作文化是维护在TSA储存在4°C。短暂,每一株生长在TSB 37°C 48 h。文化被稀释,0.5麦克法兰标准之前(大约108 cfu /毫升)后测试。

生物膜的形成分析:生物膜试验金黄色葡萄球菌与一些修改(量化跟着之前的研究12]。简单地说,文化被稀释后(106 CFU /毫升)的细菌悬液(1μl)被添加到每个96孔聚苯乙烯微量滴定板的。每个还满100μl新鲜TSB含有不同浓度的蔗糖酯的范围从0.05毫克/毫升7毫克/毫升(引用和设计的食品添加剂使用卫生标准,那么所有样本在37°C的环境在有氧条件下48 h。井没有添加剂作为消极的控制。井的吸光度测量在630 nm分光光度计(Bio-Rad大力神,CA)。后的细菌被洗涤三次通过淹没无菌去离子水的板块,板块风干了30分钟,沾0.1% (wt / wt)结晶紫为20分钟,然后用去离子水冲洗6次去除游离结晶紫。30分钟后,用电吹风,乙醇(95%,100μl)被添加到每个好,板是放在瓶30分钟。492海里的吸光度测定。吸光度的比值(B) 492和630海里被用来评估生物膜的形成。隔离是分类根据规模的B值没有生物膜生产商= B < 0.1;弱生物膜生产商= 0.1≤B < 0.5; moderate biofilm producer =0.5 ≤ B<1; strong biofilm producer=B ≥ 1. Biofilm-forming rate represents the percentage of the No. of strains producing biofilm (B ≥ 0.1) to that of total strains.

细菌疏水性分析:修改后的细菌坚持hydrocarbon-xylene(浴)测试了最初提出的罗森博格等人[13]。细菌细胞表面疏水性的两个浓度处理(3毫克/毫升和4毫克/毫升)的三种类型的蔗糖酯以及未经处理的细胞进行评估。短暂,5毫升细胞悬液(106 CFU /毫升)混合TSB(1:10 0稀释,v / v)含有蔗糖酯,放置在10毫升管和孵化48 h在37°C在旋转瓶120 rpm。沉积物细菌获得治疗和控制文化冲洗两次磷酸盐(pH值7.2,0.2米0.1米不₂阿宝₄和0.2不₂阿宝₄实验前,双重的用去离子水稀释)。由去离子水后暂停,吸光度值金黄色葡萄球菌在其630海里(A630t), 200年μl二甲苯加入4毫升金黄色葡萄球菌悬架。60年代的样本漩涡,其次是孵化15分钟25°C。样本分为两层后,水层仔细了,和测量吸光度630海里(A630d)。减少的百分比显示的吸光度降低水相初始细胞悬液的吸光度。CSH的结果分析了按照下列公式:% CSH = [(A630t-A630 d)×100] / A630t [14]。压力被认为是亲水的时候表达粘附二甲苯的百分比≤35%15]。

统计分析:所有统计测试进行了使用SPSS 17.0(美国SPSS . n:行情)、芝加哥、IL)。数据在所有研究都使用复制样品重复三次。统计学意义的变量之间的关联在不同类别的隔离(强劲、温和、弱biofilm-producing×比率CSH)计算使用两个相关示例测试方差分析测试。Independent-samples的显著差异是使用T生成测试(P < 0.05)。

结果与讨论

细菌的鉴定:总共12分离筛选和确定为金黄色葡萄球菌来自30个样本。根据GB -2010 - 4789.10,样本在Baird传播——帕克琼脂(BPA)板。阳性样品形成白色,灰色或黑色殖民地,由一个不透明的光环包围的降水。溶血性活动是由裸奔株血琼脂平板上。的识别金黄色葡萄球菌证实了革兰氏染色法和凝固酶反应。12(40%)样品了金黄色葡萄球菌,都是孤立的牛肉。结果表明,高的礼物金黄色葡萄球菌积极是牛肉样本。最新的报告显示金黄色葡萄球菌污染是普遍在生牛肉肉(15%)16]。在这项研究中,高百分比的污染金黄色葡萄球菌提出了可能造成由于使用过期肉样品代替生肉。

Biofilm-forming能力和CSH分析:所有浓度的蔗糖酯范围从0.05 mg / ml - 7毫克/毫升测试经济增长无显著影响金黄色葡萄球菌根据吸光度的井630海里(数据没有显示)。

生物膜的形成能力金黄色葡萄球菌评估是基于其粘附率(B) .Results biofilm-forming率(BFR)和蔗糖酯治疗是显示在吗图1。不同层次的生物膜的形成抑制蔗糖酯对所有的隔离观察。

在低浓度为0.05毫克/毫升,SE7和SE11表现出温和的生物膜的抑制能力,而SE11在0.1 ~ 1毫克/毫升的浓度并没有减少细菌的粘附。当SE7到达4毫克/毫升时,生物膜的形成率降至最小值。它显示biofilm-forming率最低的高浓度SE11 7毫克/毫升。然而,外加3毫克/毫升SE13 BFR显著降低,表明100%的抑制。虽然增加了价值为SE13 3毫克/毫升,显著减少BFR也观察到图1。在浓度为0.3 ~ 4毫克/毫升,生物膜的形成分析结果(图1)表明,SE7 BFR SE13显示减少,而SE11 BFR的总体下降的趋势。在先前的研究中,很少有商业消毒液可以允许使用蔬菜和水果的去污或使用消除病原体坚持食物;因此,食品添加剂可能是一个新的视角去污的食物是一种安全的选择。粘附抑制效果的几个食品添加剂,如SE在几个病原菌在微量滴定板已经被证明(17,18]。注册等食品添加剂蔗糖脂肪酸酯可作为乳化剂在加工食品是有前途的代理人抑制由食物中毒的细菌生物膜的形成(19),我们的研究结果支持同样的效果。在我们的研究中,3毫克/毫升的浓度和4毫克/毫升的三种类型的蔗糖酯是遵循食品安全标准,基于研究到目前为止,我们相信商用SE可用于未来作为一项预防措施,以防止建立生物膜,或作为一个方法用来消除现有生物膜感染。

接下来,我们检查了细胞表面疏水性的变化金黄色葡萄球菌治疗后三种类型的蔗糖酯的浓度还测试了3毫克/毫升和4毫克/毫升(不影响增长)。水平的金黄色葡萄球菌疏水性不同根据不同种类的病原体和蔗糖酯类型(20.]。疏水性的金黄色葡萄球菌显示显著降低相比,摘要除了3株细菌(St.2、圣St.4)在某些浓度(图2)。的影响3毫克/毫升SE7从10.67下降到90.32%,4例(33.3%)菌株显示有效影响百分比低于50%,而6株(50%)达到51.61%或更高。所有金黄色葡萄球菌菌株表现出显著减少SE7 4毫克/毫升的浓度,从98.26%至49.01不等。

Biofilm-Forming能力之间的相关性和CSH:很明显,有一个显著的相关性biofilmforming能力和比率CSH (P = 0.002)。方差Independent-samples输出t检验的结果显示表1。蔗糖酯3毫克/毫升和4毫克/毫升的抑制作用在食物的生物膜的形成金黄色葡萄球菌(P1 < 0.05)。

显示在图2,大多数菌株(10/12)可衡量的减少他们的CSH状态控制相比,接种在SE的存在。与此同时,一个重要的(p≤0.010,表1)SE的细胞表面疏水性的影响金黄色葡萄球菌。在进一步的实验中,细胞表面疏水性的变化金黄色葡萄球菌治疗后两个浓度的蔗糖酯也被测试。

细菌表面的疏水性是重要的水不溶性基质的粘附的细菌。这是推测,越来越细菌疏水性细菌粘附增强和降低减少疏水性(21,22]。细菌附件是影响细胞表面电荷(23],疏水性[24)和结构,包括胞外多糖和纤维或菌毛(25),但细菌粘附的基本机制仍不清楚。以前的观测表明,疏水性的术语解释细菌粘附是经常使用,因为它已被观察到,附着力增加而增加疏水性细菌(21- - - - - -28]。在最新的报告中,作者证明了正相关验证了疏水性和生物膜生物量之间c parapsilosis [29日]。在我们的实验中,本身也显然不同的细胞表面疏水性下降金黄色葡萄球菌压力明显。此外,B值和CSH值测定的结果(图1和2)和统计分析(表1)表明,SE抑制生物膜的形成金黄色葡萄球菌通过干扰病毒的细胞表面疏水性。他们可以减少的CSH金黄色葡萄球菌并破坏细胞膜渗透率。我们的结果与先前的报道,其中糖脂肪酸酯抑制最初的依恋金黄色葡萄球菌细胞非生物表面(19]。另一个文献报道,糖脂肪酸酯在一定浓度抑制肠炎沙门氏菌的粘附(30.]。然而,机制如何蔗糖酯抑制biofilm-forming尚不清楚。在这一点上,我们的研究结果推测,SE抑制了电影的形成金黄色葡萄球菌通过干扰病毒的细胞表面疏水性,和细菌疏水性可能是一个重要的参数,它决定细胞的能力遵守,入侵,造成损害。

结论

总之,目前的研究表明,硒具有抗生物膜的能力,并且可以进一步用于预防测量,防止附件食源性病原体或作为一个方法来消除现有生物膜感染。虽然食品添加剂进一步抑制生物膜的形成机制并不完全了解,我们的研究表明一个理想的应用程序安全预防食品污染的食品添加剂。

承认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。20707003也没有。31101278)。

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