药学与药学研究与评论“雷竞技苹果下载，
菜单e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
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1印度西孟加拉邦杜尔加布尔- 713206，药学和联合健康科学学院(BCRCPAHS)。
2加尔各答大学化学技术系，印度西孟加拉邦加尔各答700009。
3.费森尤斯卡比肿瘤有限公司，Kalyani，-741235，西孟加拉邦，印度。
收到:02/06/2013;修改后:24/06/2013;接受:02/07/2013
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5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种广泛使用的抗癌药物，但会引起严重的副作用。控制释放系统可能有助于将5-FU浓度保持在较低水平，从而减少副作用。本研究的目的是利用乙基纤维素、HPMC E15和HPMC K4M不同组合，采用溶液铸造法制备载5-氟尿嘧啶透皮薄膜，考察不同聚合物对薄膜药物渗透及其他理化特性的影响。使用透析膜进行体外研究，发现HPMC E15比HPMC K4M具有更持久的配方。此外，还研究了该膜在EAC诱导的瑞士白化小鼠肿瘤上的药理评价。上述体内研究结果显示，EAC荷瘤小鼠的肿瘤体积、堆积细胞体积和活瘤细胞数量随着非活细胞数量百分比的增加和寿命的延长而受到高度显著的抑制。结果表明，制备的5-FU膜具有良好的抗肿瘤作用。
透皮膜，控释，体外及EAC。
透皮给药系统是一种绕过首道代谢问题给药的现代给药系统。它被用来通过皮肤将药物输送到体循环。目前，美国批准了超过35种TDDS产品，用于治疗高血压、心绞痛、晕动病、剧烈疼痛、局部疼痛等多种疾病。
TDDS的非侵入性特点使其适用于广泛的患者群体和高度可接受的药物剂量选择。5-FU是一种抗代谢物，对几种癌前和恶性皮肤状况具有很好的抗肿瘤活性。它还被证明对各种实体肿瘤有活性，包括乳房、结肠、直肠和宫颈的肿瘤[1，2］．透皮给药5-FU可以克服口服和肠外给药的某些限制。其口服给药显示出口服生物利用度的显著差异，范围为0-80% [3.]，在肠外给药的情况下，主要问题是药物的快速消除，其明显的半衰期为8-20分钟，因此，我们有针对性地制定透皮膜使用5-氟尿嘧啶作为模型药物。
在此，我们尝试通过研究药物在透析膜中的渗透(体外)来优化疏水和亲水聚合物的合适比例来制备薄膜。
5-氟尿嘧啶购自Sigma Aldrich。乙基纤维素，HMPC E15, HMPC K4M，油酸和甘油也从孟买的Loba Chemie pbt . Ltd购买。透析膜来自HIMEDIA实验室。所用的其他溶剂和化学品均为分析级。
实验肿瘤在建模中具有重要意义，埃利希腹水癌(EAC)是最常见的肿瘤之一。EAC被称为未分化癌，原为超二倍体，具有高移植能力、无退化、增殖快、寿命短、100%恶性，也无肿瘤特异性移植抗原(tumor-specific transplantation antigen, TSTA)。
活体研究按照印度政府社会正义与赋权部动物实验控制与监督委员会(CPCSEA)批准的指导方针进行。BCRCPAHS机构动物伦理委员会(BCRCP/IAEC/4/2012)批准了本研究的方案。
随机选择四组瑞士白化小鼠，每组包含6只健康的同性小鼠(在本例中为雌性)，大约相同的年龄(10周)和平均体重(18-20克)，并将其安置在聚丙烯酸笼子中，每个笼子不超过6只，并在实验室条件下(25-27°C)饲养。这四组中的一组作为对照组，而其他组则是正常组和测试组。他们可以自由地获得标准干颗粒饮食和水。实验开始前，动物适应实验室条件一周。
采用溶剂铸造法制备5-FU透皮膜。将EC、HPMC K4M和HPMC E15溶解在20 ml丙酮和氯仿(3:1)的混合物中，用磁力搅拌器搅拌10分钟，使聚合物完全分散，制备聚合物溶液。然后加入20 mg 5-FU，再次搅拌10分钟，使其完全分散。然后加入10%的甘油和5%的油酸。搅拌5分钟后，将溶液倒在直径6.06厘米的Petridis上。然后让溶剂在环境温度(32°C, 45%RH)下蒸发24小时。然后对制备好的薄膜进行刮除评价。
首先选择了一种聚合物组合来生产不含药物的薄膜。公式的组合如图所示表1．我们用PF表示这些公式。
表1:预配方组成
通过配方前研究，筛选出以下8个配方作为最终配方。
在进入最终配方之前，首先对药物的物理混合物进行IR研究，EC, HPMC K4M和HPMC E15进行相容性研究。
经配方前研究并确认无药物-辅料相互作用后，制备如下配方(表2)．
表2:最后的公式
对所制备薄膜的物理外观、厚度均匀性、重量变化、折叠耐力、药物含量、含水率、吸湿率、平整度和体外释放度进行评价。
通过对随机选取的6部电影分别称重，计算平均权重和标准差来确定权重变化。个人体重不应明显偏离平均体重[4］．
用螺旋规测定薄膜的厚度。通过将薄膜保持在已知厚度的两块玻片之间，将其放置在三个不同的位置，并计算出平均厚度，并给出数值表4．
表4:配方的理化参数
折叠耐力由手工测量。将面积为22cm2的薄膜条均匀切割，在同一位置反复折叠，直至其断裂。薄膜在同一位置折叠而不断裂/开裂的次数给出了折叠耐力的确切值，结果报告在表4［5，7］．
将制备好的薄膜单独称量，并在室温下放入含有硅胶的干燥器中保存24小时。在指定的间隔后，再次称量薄膜，直到它们显示恒定的重量。含水率百分比按以下公式计算[6]。
称重后的薄膜在干燥器中室温保存24小时，然后取出，在干燥器中使用饱和氯化钠溶液暴露在相对湿度为75.3%的环境中，直到达到恒定的重量。吸湿率计算公式如下[6］．
透皮膜应具有光滑的表面，不应随着时间而收缩。这可以用平面度研究来证明。为了确定平整度，从膜的中心切一条，从膜的每边切两条。测量每条的长度，长度的变化是通过确定收缩百分比来测量的。0%的收缩相当于100%的平坦。
我2=每条的最终长度
我1=每条的初始长度
采用钱氏扩散细胞法进行体外释放研究。该方法将透皮膜置于扩散细胞的受体和供体间室之间。透皮系统面对受体室，受体液即缓冲液被放置在其中。整个组件保持在磁力搅拌器上，在整个实验过程中，用磁珠以600 rpm的速度连续不断地搅拌接收室中的溶液。受体室温度维持在37±2℃。在预定的时间间隔内，取出5ml受体液进行分析，并用等体积的pH为7.4的磷酸盐缓冲液替代。在266 nm波长下，适当稀释，分光光度法测定药物浓度[8，9]。
采用改良的钱氏扩散细胞进行体外渗透研究。透析膜之前在蒸馏水中浸泡24小时。将膜粘附在屏障膜(透析膜，浸泡在ph7.4的磷酸盐缓冲液中过夜)上，并将膜牢固地系在Keshary Chien扩散细胞的供体室，其受体室充满57 ml磷酸盐缓冲液。供体腔室被降低到受体腔室以这样的方式透析膜刚好接触到受体腔室的介质。整个装置放在一个磁力搅拌器上。受体室温度维持在37±2℃。使用特氟龙涂层珠以恒定速度(600 rpm)搅拌扩散池的内容物。按预定时间间隔提取样品(5ml)，用等量的磷酸盐缓冲液替换以保持下沉状态。经适当稀释后，在266 nm波长下，用SHIMADZU的UV-VIS 1800分光光度计测定样品的药物含量。渗透研究进行7小时[10]。
根据ICH指南Q1A规范，在稳定室中对配方进行了稳定性研究。我们在封闭容器中进行了中间和加速条件下的稳定性研究(表3)．两种情况均在0、3、6个月采样3次，并进行药物含量均匀性检测。
表3:稳定性研究条件
以EC、HPMC E15和HPMC K4M为聚合物，以甘油为增塑剂，采用溶剂铸造法制备了5-FU透皮给药体系。通过体外药物渗透研究对所制备薄膜的理化参数进行评价。聚合物组合的选择可为5-FU透皮给药系统产生清晰、光滑、均匀、实质性、柔性和所需厚度的薄膜。
在体外条件下研究了配方的特性。在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中进行7小时的渗透研究，以找出主要影响药物从膜上渗透的扩散机制。所制备配方的药物含量均匀性和质量均匀性表明，本研究制备薄膜的工艺能够得到药物含量均匀的薄膜，薄膜厚度在0.0855±0.005 ~ 0.134±0.003 mm之间。
随着HPMC和EC的加入，配方的吸湿率和含水率均有所增加。乳油与HPMC K4M比例为1:1的配方FF2含水率最高，且含水率随HPMC E15浓度的增加而降低。这证明了HPMC的掺入提高了含水率。在两个等级的HPMC中，我们观察到HPMC K4M比HPMC E15表现出更强的亲水性。
薄膜的折叠耐力在72±1.67 ~ 144.5±3.2次之间。从得到的结果可以发现，随着HPMC的加入，折叠耐力降低。同样，增加浓度的HPMC K4M比等量EC的HPMC E15具有更高的折叠耐久性，这可能是由于聚合物K4M具有更高的保湿能力。
现在，为了了解其释放情况，我们首先使用透析膜进行体外释放研究。从7小时内累积释放百分比(表5)，我们观察到FF1的释放速度非常慢，7hr的释放量为56.76%。FF2释放率最高，为96.53%。FF1的释放率最低，可能是由于EC的缓释作用，FF2的释放率为96.53%，这是HPMC K4M和EC联合使用的结果。如果我们研究制定FF3是1:1的EC和HPMC E15我们观察它制定公布低于FF2但高于FF1and率的配方FF4 FF8我们准备三个聚合物的配方结合EC, HPMC K4M HPMC E15和我们观察到随着HPMC E15的浓度的增加与减少的浓度HPMC K4M的%释放药物通过透析膜相应减少。这意味着在两个等级的HPMC之间，E15比K4M提供更持久的释放。
表5:体外5-氟尿嘧啶在5小时内通过透析膜的累计渗透百分比
为了了解释放的性质，我们将药物释放数据拟合为零阶、一阶和Higuchi模型，并将每种情况下的R2值制成表格。
我们观察到所有配方均与Higuchi模型呈最高线性。
表6:模型方程的回归系数体外扩散动力学。
从累积的%释放数据中，我们放弃了FF1, FF2和FF4进行进一步研究。FF1被放弃了，因为它提供了非常缓慢的释放。FF2和FF4，释放速度更快，这是不可取的情况下透皮薄膜配方。
为了理解释放机制，我们将R2值拟合到Korsmeyer-Peppas模型中，以找出“n”值。
然后我们观察到所有的配方都表现出非菲克释放机制。因此，药物5-FU通过扩散和聚合物链侵蚀从薄膜中释放。
表7:的Korsmeyer-Peppas模型的n值表体外通过透析膜释放药物
图1:图表表示的水分含量和水分摄取的配方
图2:所选配方经透析膜在7hr内进行Higuchi图
表8:两种不同条件下配方稳定性研究数据表
我们在加尔各答贾达布尔大学的联合实验室长期以来一直采用标准化的方法[11，12，13］．
EAC细胞来自印度加尔各答Chittaranjan国家癌症研究所(CNCI)。EAC细胞在瑞士白化小鼠中维持，每9天腹腔移植一次[14用注射器采集供体小鼠腹水，在显微镜下用德国Marienfield公司生产的Neubauer血细胞计进行肿瘤细胞计数。2 X 107细胞数/ml用生理盐水稀释[15存活率为98%的肿瘤细胞悬液(台盼蓝染料(0.4%)排除试验检查)用于移植。一个确定的数字(大约2 × 10)6除生理盐水组(阴性对照)外，其余3组小鼠腹腔注射或植入这些活活细胞/ 0.2mL。在这种情况下，肿瘤细胞在腹膜腔内相对自由地繁殖并产生腹水。这是第0天。在开始给药之前，允许一天的潜伏期在体内建立疾病。所有动物腹腔注射EAC细胞诱导肿瘤。EAC诱导小鼠分为3组(n = 6)，分别为纯5-FU处理组、添加5-FU的“FF5”制剂处理组和无处理组(阳性对照)。给药组通过尾静脉静脉给药20mg /kg /天，或等量的药物(FF5制剂)在小鼠背表面透皮贴片上涂抹，连续9天。对照组不予治疗[16］．
第一组:0.9%生理盐水(5ml/kg i.p)阴性对照
第二组:EAC (2X106细胞/小鼠i.p.)积极的控制
III组:EAC (2x106个细胞/小鼠i.p) +纯5-氟尿嘧啶(20mg/kg/天)尾静脉静脉注射。
IV组:EAC (2x106个细胞/小鼠i.p) +‘FF5’制剂(相当于5-FU 20mg /kg /day)透皮贴剂敷于背表面。
遇到的主要问题是，在实验过程中，如何保护所应用的透皮膜不被刮掉、摩擦和/或舔掉，一旦应用到剃光的小鼠皮肤背表面。魔术贴防护夹克的设计，根据[17］．尼龙搭扣外套覆盖整个小鼠躯干，顶部打开，这是适当指定的应用透皮膜。夹克保护透皮膜，并允许良好的通风。它很好地发挥了作用，老鼠戴上它后能够正常工作。通过观察以下参数的变化来评估配方FF5的抗肿瘤活性。第10天开始试验前6小时停止进食和饮水。
通过研究肿瘤体积、填充细胞体积、肿瘤细胞计数、存活肿瘤细胞计数、非存活肿瘤细胞计数和寿命增加百分比等参数，考察了添加5-FU的配方“FF5”对肿瘤生长的影响。
解剖小鼠，用注射器从腹腔中收集腹水。体积的测量方法是将其置于刻度离心管中。通过在冷离心机(Remi)中以1000转/分的速度离心腹水5分钟，在22-25°C下测定填充细胞体积。
用白细胞移液管将腹水稀释至100倍。然后将稀释后的细胞悬浮液滴在纽鲍尔计数室上，仔细计算64个小方块中的细胞数量。
然后用台盼蓝(在生理盐水中占0.4%)染色。没有吸收染料的细胞是活的，而那些吸收了染料的细胞是不活的。计数这些活细胞和非活细胞。将检测样品的肿瘤体积、填充细胞体积、活细胞计数与对照组进行比较，对检测样品进行评价。腹水中肿瘤体积和活细胞计数的抑制百分比由以下表达获得:
腹水抑制率= (1 - T / C) × 100
其中，T =试验动物腹水的平均体积(ml)， C =对照动物腹水的平均体积(ml)，然后
腹水细胞抑制率= (1 - T / C) × 100
T=平均no。试验动物腹水细胞的C°=平均no。在对照动物腹水细胞中
通过记录6周内的每日死亡率，监测' ff5 '配方对肿瘤生长的影响，并计算寿命增加百分比(%IMST)。寿命延长25%或以上被认为是有效的抗肿瘤反应[13，18］．
IMST(%)=[(治疗组中位生存时间/对照组中位生存时间)- 1]X100
中位生存时间(MST) =[第一次死亡日+最后一次死亡日]/ 2
数值以均数±s.e.m.表示。数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学评估，之后采用SPSS软件进行事后Dunnett检验。P< 0.05为有统计学意义，P< 0.01为极显著。
腹水抑制百分率:= (1 - T / C) × 100
式中，T =试验动物腹水平均体积(ml)， C =对照动物腹水平均体积(ml):
(i)纯药物(5-FU) ==对照的65.05%。
(ii)配方‘FF5’与对照相比== 84.17%。同样的,
(i)纯药物(5-FU) ==72.88%
(ii)配方' ff5 ' ==79.11%
然后
腹水细胞抑制率:= (1 - T/ C) × 100
T =平均no。试验动物腹水细胞的C°=平均no。对照动物腹水细胞:
(i)纯药物(5-FU) == 70.31%。
(ii)配方‘FF5’== 88.71%，与对照相比。
上述体内实验表明，当纯药(5-FU)减少60.05%的腹水、72.88%的腹水和70.31%的腹水细胞时，透皮膜5-FU (FF5)的抗肿瘤活性比EAC诱导的对照组小鼠减少84.17%的腹水，减少79.11%的腹水细胞容积，减少88.71%的腹水细胞容积。
癌症是一种涉及肿瘤细胞不受控制的增殖的病理状态。
本研究旨在研究我们制备的含有5-FU的制剂“FF5”对EAC荷瘤小鼠的抗肿瘤潜力。EAC(埃利希腹水癌)是一种生长非常迅速且具有侵袭性的癌症[19］．它能在几乎所有品系的小鼠体内生长。埃利希腹水肿瘤植入本身可诱导局部炎症反应，血管通透性增加，导致强烈水肿形成、细胞迁移和渐进性腹水形成和积聚[20.]。
腹水是肿瘤生长所必需的，因为腹水是肿瘤细胞的直接营养来源[21]。我们的“FF5”添加了药物治疗，可能是通过降低腹水营养液的体积来显著减小肿瘤体积(p<0.01)。此外，与肿瘤对照组相比，使用' FF5 '配方处理的小鼠腹膜中填充的细胞体积和存活的EAC肿瘤细胞数量显著减少。这些结果可能表明' FF5 '配方对肿瘤细胞具有直接的细胞毒作用或间接的局部作用，可能涉及巨噬细胞激活和血管通透性抑制。
判断任何抗癌配方的价值的可靠标准是延长动物的寿命。22结果表明，与对照组相比，“FF5”膜和纯药物5-FU处理的荷瘤小鼠的寿命分别增加了88.95%和68.80% (表10)．“FF5”减少了腹水体积，从而增加了寿命的百分比。
表10:“FF5”配方对EAC细胞携带者小鼠存活时间的影响
从稳定性研究数据，我们观察到，配方是稳定的加速以及中间条件。因此，上述体内研究显示，在EAC小鼠中，随着非活细胞计数百分比的增加，肿瘤体积、填充细胞体积和活肿瘤细胞计数受到高度显著的抑制(表9)．因此，配方“FF5”有助于积极的反应，并支持配方膜的抗肿瘤作用。
表9:“FF5”方对EAC荷瘤小鼠肿瘤生长反应的影响
